Die Autoren bedanken sich bei mehreren Mitgliedern des Labors für ihre wertvollen Anregungen bedanken bei der Entwicklung von Agroinfiltration und In-vitro-Assays Montage. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der University of California finanziert. Diese Studie wurde in Teilen durch ein Stipendium der National Science Foundation (CBET-1144237) unterstützt.

1. Pflanzenmaterial <ol><li> Nicotiana benthamiana Pflanzen in der Einkapselung des Tests verwendet werden bei 4 Blätter Stufe (etwa 3-4 Wochen alten Pflanzen) sein. </li></ol> 2. Lieferung und Expression von funktionellen viralen Genom-Komponenten zu Zellen, die durch Agroinfiltration pflanzen <ol><li> Tag 1: Der Agrobacterium-Stamm (zB EH 105 oder GV 3101) beherbergt, die pCass-BMV-RNA 1, 2 und BMV-RNA BMV-RNA 3 1,2 auf LB-Agarplatten mit 50 mg / ml Kanamycin gezüchtet werden (wählt für die pCASS Vektor) und 100mg/ml von Rifampicin (wählt für die Agrobacterium). Die Inkubation wird bei 28 ° C für zwei Tage durchgeführt. </li><li> Tag 3: inokulieren einzelnen Kolonie von der LB-Agarplatte in 2 ml LB-Bouillon, die 50 mg / ml Kanamycin und 100 mg / ml Rifampicin für 1 Tag bei 28 ° C in Orbitalschüttler bei 250 RPM. </li><li> Tag 4: inokulieren 50 ml des LB-Brühe Ergänzunged mit 50 mg / ml Kanamycin und 100 mg / ml Rifampicin, 10 mM MES, pH 5,6 und 100 mM mit einem ml der Kultur in einem 250 ml Erlenmeyerkolben Acetosyringon für 16 Stunden bei 28 ° C am Schüttler bei 250 rpm . </li><li> Tag 5: Übertragen Sie die Kultur (bei ​​OD 600 1,0 erreicht) zu einem Oak Ridge Röhrchen oder sterile Falcon-Röhrchen und zentrifugieren Sie für 10 Minuten bei 5000 rpm bei 4 ° C </li><li> Das Pellet in 10 ml 10 mM MgCl 2 und Zentrifuge für 10 Minuten bei 5000 rpm bei 4 ° C Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal um die vollständige Entfernung des Antibiotikums zu gewährleisten. </li><li> Hängen Sie das Pellet in 10 ml Puffer mit 10 mM MgCl 2 und 10 mM MES (pH 5,6). </li><li> Messen Sie die OD 600 für jede Kultur des BMV-RNA 1, 2 und RNA-RNA-3 und justieren zu 0,1 OD 600 mit 10 mM MgCl 2 und 10 mM MES (pH 5,6). </li><li> Mischen Sie je 1 ml alle drei 0,1 OD 600 Kultur Suspensionen. </li><li> In 100 mM Acetosyringon, mischen Gently und halten das Gemisch bei Raumtemperatur ungestört für 3 Stunden. </li><li> Zeichnen Sie die Kultur-Suspension in 1 ml. Spritze ohne Nadel. </li><li> Infiltrieren Sie die oben genannten Kultur-Suspension in der abaxialen Seite von 2-3 gut ausgebildeten Blättern von N. benthamiana (5 Blätter Bühne, 3-4 Wochen alten Pflanzen) durch leichten Druck auf die Spritze, um eine Hälfte des abaxialen Oberfläche des Blattes. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang Infiltration zu anderen Blättern. </li><li> Halten Sie infiltrierten Pflanzen im Gewächshaus bei 24 ° C. </li><li> Ernte-infiltrierten Blätter 3 bis 4 Tage nach der Infiltration (dpi). </li></ol> 3. Die Reinigung des BMV Virionen <ol><li> Sammeln Sie N. benthamiana verlässt agroinfiltrated mit einem Gemisch, das alle drei Wildtyp BMV agrotransformants. </li><li> Grind Blätter in einem sterilen Mörser mit einem gleichen Volumen (w / v) von BMV Extraktionspuffer (0,5 M NaAc, 0,08 M ​​MgAc, pH 4,5 und 1/100 Volumen von β-Mercaptoethanol, die unmittelbar vor der Verwendung hinzugefügt werden soll) 3. Um Virus zu maximieren, ist es empfehlenswert, mit Säure gewaschenen Sand (~ 0,5-1 g), die einfach und effizient Schleifen Zellaufschluss erleichtert hinzuzufügen. </li><li> Filtern Sie die Blatt-Extrakt durch 2-3 Lagen Baumwolltuch und sammeln die Flut. </li><li> Auch hier schleifen die einbehaltene auf Baumwolltuch mit gleichen Volumen BMV Extraktionspuffer auf das Ausgangsgewicht von Blattmaterial. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang mit Filtration Baumwolltuch. Diese Schritte sollten bei 4 ° C durchgeführt werden </li><li> Das Filtrat Lösung zu einem Zentrifugenröhrchen eingewogen und mit gleichem Volumen vorgekühlte Chloroform zugeben und vortexen (oder schütteln) für 5 Minuten bei Raumtemperatur, bis die Farbe der Suspension wird hellgrün. </li><li> Zentrifugieren der emulgierten Lösung für 15 Minuten bei 12.000 rpm bei 4 ° C </li><li> Sammeln Sie die wässrige Phase und rühren für 30 Minuten auf Magnetrührer, um das restliche Chloroform zu entfernen. </li><li> Die Suspension in ein steriles Röhrchen Ultrazentrifuge. </li><li&gt; Unterlage 1 ml. 10% Saccharose (hergestellt in Extraktionspuffer Virus) als Kissen 3. </li><li> Zentrifugieren bei 30.000 rpm für 3 Stunden in einem Beckman-Ultrazentrifuge bei 4 ° C </li><li> Überstand verwerfen und Pellet in auszusetzen gewünschte Volumen der BMV Suspensionspuffer (bis Suspensionspuffer verdünnter BMV Extraktionspuffer auf 1/10 vorbereiten mit sterilem destilliertem Wasser). </li><li> Das teilweise gereinigte Virion Herstellung von oben durchgeführt wird, um 10-40% Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation 150 min bei 28.000 rpm bei 4 ° C unterworfen </li><li> Sammeln des Virus Band entweder manuell oder durch einen Fraktionator. Das Virus Band erscheint blau unter Beleuchtung mit weißem Licht. </li><li> Verdünnen der Lösung, die Saccharose-Virus Probe mindestens 50% mit der Virussuspension Puffer. </li><li> Zentrifuge verdünnten Virus, enthaltend Saccharose-Lösung für 3 Stunden bei 30.000 UpM in einer Beckman-Ultrazentrifuge bei 4 ° C </li><li> Schließlich setzt die hochgereinigten Viruspellet in einem gewünschten Volumen von viruns Suspensionspuffer. </li><li> Messen der Konzentration des Virions (mg / ml) unter Verwendung Spektrophotometer bei OD 260. </li></ol><img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/3645/3645eq1.jpg" /> Hinweis: Basierend auf RNA-Gehalt ist der Extinktionskoeffizient für BMV 5 4. <ol start="19"><li> Überprüfen Sie die Reinheit der Virionen, indem Sie unter TEM (Abb. A) </li></ol> 4. Vorbereitung der Kapsid-Protein-Untereinheiten für die In-vitro-Montage <ol><li> Planen 1 Liter 1x-Virus Dissoziationspuffer (0,5 M CaCl 2, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 mM EDTA, 1,0 mM DTT und 0,5 mM PMSF) 5. </li><li> Planen Dialysemembran nach Sambrook et al 6. </li><li> Dosiernadel erforderliche Konzentration des gereinigten Virus in einen Dialyseschlauch. </li><li> Setzen Sie den Virus enthält Dialyseschlauch in ein Becherglas mit der 1x Virus Dissoziationspuffer. </li><li> Dialysieren 24 Stunden bei 4 ° C while Rühren. </li><li> Sammeln der Lösung aus dem Dialysebeutel nach 24 Stunden und Zentrifuge bei 12.000 × g für 15 min bei 4 ° C Dadurch wird die BMV-RNA aus den dissoziierten Virionen zu trennen. </li><li> Sammeln Sie den Überstand und Zentrifuge bei 35.000 rpm in Beckman-Zentrifuge für 3 Stunden bei 4 ° C bis Pellet jeder un-dissoziierten Viruspartikel. </li><li> Die überstehende Flüssigkeit. </li><li> In diesem Stadium ist es zwingend erforderlich, um alle verunreinigenden Virion-RNA aus dissoziierten Kapsidprotein Untereinheiten zu entfernen. Um dies zu tun, sollte der Überstand aus Schritt 8 bis eine weitere Runde von über Nacht Remontage von Kapsid-Protein-Untereinheiten ohne Zugabe von RNA (RNA in 1x Montage-Puffer, siehe unten) von einem Hochgeschwindigkeitszentrifugation (30.000 rpm für 3 Stunden bei gefolgt unterzogen werden 4 ° C) Pelletierung nicht montiert Virionen. Nach diesem Zusammenbau Schritt würden die enthaltende Überstand Hüllprotein-Untereinheiten frei von jeglichen restlichen kontaminierender RNA. Doch um dies zu gewährleisten, ist es ratsam, eine zusätzliche in v ausführenITRO Zusammenbau mit nur Hüllprotein-Untereinheiten mittels RNA 1x Montage-Puffer. Nach dem Zusammenbau über Nacht, muss die Zubereitung frei von Virionen zusammengebaut (Überprüfung mittels TEM). </li><li> Die Konzentration von Kapsid-Protein-Untereinheiten durch Messen der OD 254 und 280 nm oder durch andere Verfahren, wie Bradford-Assay. </li><li> Führen 12-15% SDS-PAGE, gefolgt von Western Blot, um die Integrität der dissoziierten Kapsid-Protein-Untereinheiten zu bestimmen. </li></ol> 5. In-vitro-RNA, die Montage der Virionen <ol><li> Bereiten RNA-Transkripte in Virionen wieder zusammengebaut werden und die Konzentration 7. </li><li> Mischen Kapsid-Protein-Untereinheiten und RNA-Transkript in einem Verhältnis von 1:5 (w / w) 5. </li><li> Pipettieren Sie die obige Mischung in einen Dialyseschlauch und ordnungsgemäß zu sichern, um jegliches Auslaufen zu vermeiden. </li><li> Bereiten 1.000 ml. Anordnung von RNA 1x Puffer (50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1,0 mM DTT) 5. </li><li> Legen Sie den Beutel mit der Dialyse Reaktionsgemisch gegen 1x Montage-Puffer in das Becherglas und rühren. </li><li> Dialysieren des Re-Assembly Reaktion bei 4 ° C für 24 Stunden unter leichtem Rühren. </li><li> Sammeln Sie die Mischung aus dem Dialyseschlauch nach 24 Stunden und 1,5 ml der RNA-Montage-Puffer. </li><li> Übergeben dieses Gemisch durch eine Centricon-100-Säule durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (2000 × g) für 30 Minuten. </li><li> Die Säule wird einmal mit 1,5 ml Anordnung Puffer bei 4 ° C für 30 min. </li><li> Wiederholen Sie den obigen Waschschritt zweimal. </li><li> Schließlich eluieren wieder zusammengesetzt Virionen durch Zentrifugation bei 10.000 g bei 4 ° C für 5 min. </li><li> Schätzen Sie die Virion-Konzentration bei OD 260 nm. </li></ol> 6. Herstellung von optischen Viral Ghosts (OVGs) <ol><li> Fügen Sie Indocyaningrün (ICG) 8 dem gereinigten Kapsidprotein an gewünschten Konzentrationsverhältnis (das Gewichtsverhältnis von Indocyaningrün und Kapsidprotein in diesem Bericht verwendet wurde, war 1:10) ein<html> d gründlich mischen durch Pipettieren. </li><li> Dialysieren des Kapsidprotein und der ICG-Lösung gegen die OVG Anordnung (1 M NaCl, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA und 1 mM DTT, pH 4,8) bei 4 ° C für 24 Stunden. </li><li> Nach 24 Stunden, sammeln die Lösung von der Dialysebeutel (12 kDa Porengröße) und Zentrifuge bei 90.000 UpM für 1 Stunde bei 4 ° C (Bild B) </li><li> Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in auszusetzen BMV Suspensionspuffer durch Vortexen oder so dass sie von selbst in BMV Suspensionspuffer über Nacht auszusetzen bei 4 ° C </li><li> Überprüfen Sie die Morphologie der OVGs durch TEM (Abb. C). </li><li> Messen Sie die Absorption von 240 nm bis 950 nm mit Spektralphotometer (Cary 50, Varian Inc.), das Vorhandensein von ICG ist durch Unterschrift Absorptionspeaks etwa 700 nm und 790 nm 8 bestätigt. (Abb. D) </li><li> Die typischen ICG Fluoreszenzpeaks bei ~ 700 nm und ca. 800 nm auf 620 nm Anregung OVG Lösung (Bild D) unter Verwendung Spektrofluorometer (Fluorolog 3, Jobin Yvon-) gesehen werden. </li></ol>_title &quot;&gt; 7. repräsentative Ergebnisse <img alt="Abbildung A" src="/files/ftp_upload/3645/3645figA.jpg" /> Abbildung A. TEM-Aufnahme von negativ gefärbten BMV Virionen von N. gereinigt benthamiana agroinfiltrated mit einer Mischung aus allen drei Wildtyp BMV agroconstructs (Maßstab 100 nm). <img alt="Abbildung B" src="/files/ftp_upload/3645/3645figB.jpg" /> Abbildung B Pellet von in vitro zusammengebaut ICG-haltigen OVGs nach Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation. <img alt="Abbildung C" src="/files/ftp_upload/3645/3645figC.jpg" /> Abbildung C TEM-Aufnahme von negativ gefärbten ICG mit OVGs (Maßstab 100 nm). <img alt="Abbildung D" src="/files/ftp_upload/3645/3645figD.jpg" /> Abbildung D. Absorption (oben) und Fluoreszenz (unten) Spektren von OVGs. Die Anregungswellenlänge für OVG Emission w verwendetals 620 nm.

<ol>
	<li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta:+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging.">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li><li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses:+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration.">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li><li>Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).</li><li>Lane, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromoviruses.">The bromoviruses.</a> Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).</li><li>Choi, Y. G., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+studies+on+bromovirus+capsid+protein.+VII.+Selective+packaging+on+BMV+RNA4+by+specific+N-terminal+arginine+residuals.">Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals.</a> Virology. 275, 207-217 (2000).</li><li>Sambrrok, J., Russel, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+in+vivo+of+mutant+brome+mosaic+virus+RNAs+defective+in+aminoacylation.">Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation.</a> J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).</li><li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+nano-constructs+composed+of+genome-depleted+brome+mosaic+virus+doped+with+a+near+infrared+chromophore+for+potential+biomedical+applications.">Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications.</a> A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Agroinfiltration hier vorgestellte Ansatz kann allgemein anwendbar auf eine Vielzahl von Pflanzenviren. Ein Erkennungsmerkmal dieses Ansatzes erfolgt die Lieferung mehrerer agroconstruct zu derselben Zelle ein großer Nachteil häufig mit routinemäßig zur mechanischen Inokulation von Pflanzenviren verbunden synchronisiert. In vivo und in vitro-Studien mit Montage Trespenmosaik-Virus als Modell effizient durch geführt werden folgenden einige Tipps. (i) Für die erfolgreiche Infiltration von N. be...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> MES Natriumsalze </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2993 </td></tr><tr><td> Indocyaningrün </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2633 </td></tr><tr><td> Beckman Ultrazentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> Modell: L8-70M </td></tr><tr><td> Centricon-100-Säule </td><td> Millipore </td><td> YM-100 </td></tr><tr><td> Spektrophotometer </td><td> Cary 50, Varian Inc. </td><td> Teilenummer 10068900 </td></tr><tr><td> Spektrofluorometer </td><td> Fluorolog 3, Jobin-Yvon. </td><td> Teilenummer FL3-21 </td></tr></tbody></table>

simple and robust in vivo and in vitro approach for studying virus assembly

Bei Viren mit positiv-sense-RNA-Genome pathogen für Mensch, Tier und Pflanzen, Nachkommen Enkapsidierung zu reifen und stabilen Virionen ist ein Kardinal Phase während die Etablierung der Infektion in einem bestimmten Host. Folglich entziffert Studie von Enkapsidierung die Informationen bezüglich des Know-how des Mechanismus zur Regelung Virus Montage zu infektiösen Virionen zu bilden. Solche Informationen sind bei der Formulierung neuer Methoden zur Eindämmung des Virus Ausbreitung und Bekämpfung der Seuche von entscheidender Bedeutung. Virus Einkapselung kann in vivo und in vitro untersucht werden. Genome Enkapsidierung in vivo ist ein stark regulierter Prozess, der selektive makromolekularen Interaktionen und subzelluläre Kompartimentierung. Daher untersuchen, die zu sezieren Veranstaltungen umfasst Enkapsidierung Virus in vivo würde Basiswissen vermitteln zu verstehen, wie Viren und vermehren sich versammeln. Kürzlich in vitro Einkapselung für die Forschung auf dem Gebiet der biomedizinischen ima ausgenutztGing und therapeutische Anwendungen. Nicht-umhüllten Viren Anlage stehen weit vorne in der Venture von In-vitro-Verpackung der negativ geladenen Fremdkörper. Trespenmosaik-Virus (BMV), ein nicht-umhülltes RNA-Virus Mehrkomponenten pathogenen Pflanzen, wurde als Modellsystem für die Untersuchung Genom Verpackung in vivo und in vitro verwendet. Für Assays Einkapselung in Nicotiana benthamiana, Agrobacterium-vermittelte transiente Expression als Agroinfiltration beziehen, ist eine effiziente und robuste Technik für die synchronisierte Zuführung und Expression von mehreren Komponenten zu der gleichen Zelle. Bei diesem Ansatz wird eine Suspension von Agrobacterium tumefaciens-Zellen, die binäre Plasmid-Vektoren, die Durchführung von cDNAs desiredviral mRNAs in den Interzellularraum withina Blatt mit nichts komplizierter als einer 1 ml Einwegspritze (ohne Nadel) infiltriert. Dieses Verfahren führt zu der Übertragung von DNA-Inserts in Pflanzenzellen, die T-DNAEinsatz bleibt vorübergehend in dem Kern und wird dann durch den Host-Polymerase II transkribiert, die zur transienten Expression. Das resultierende mRNA-Transkript (Obergrenze und die polyadenylierte) wird dann in das Zytoplasma für die Übersetzung ausgeführt. Nach etwa 24 bis 48 Stunden Inkubation, können Teile des infiltrierten Blätter microscopyor biochemische Analysen entnommen werden. Agroinfiltration ermöglicht eine große Anzahl (Hunderte bis Tausende) von Zellen gleichzeitig transfiziert werden. Für In-vitro-Einkapselung sind gereinigten Virionen von BMV dissoziiert Kapsidprotein durch Dialyse gegen Dissoziationspuffer, enthaltend Calciumchlorid durch Entfernen von RNA und undissoziiert Virionen, gefolgt von Zentrifugation. Genome abgereicherten Kapsid-Protein-Untereinheiten werden dann mit den gewünschten viralen Genoms Komponenten oder nicht-viralen Komponenten wie Indocyanin Farbstoff zusammengesetzt.

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Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Eine einfache, effiziente und robuste Art, die Bereitstellung von mehreren viralen Komponenten auf Pflanzenzellen zu synchronisieren über<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Vermittelte transiente Expression beschrieben. Dieser Ansatz ist zugänglich für die Untersuchung der Replikation, gefolgt von Enkapsidierung<em&gt; In-vitro-</em&gt; Zusammenbau von nicht-viralen Komponenten in optischen viralen Genoms erschöpft Geister geeignet für biomedizinische Anwendungen.

Einfach und robust In-vivo- Und In-vitro- Ansatz für das Studium Virusassemblierung

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

simple-robust-vivo-vitro-approach-for-studying-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

12.2K Aufrufe.  University of California, Riverside. Eine einfache, effiziente und robuste Art, die Bereitstellung von mehreren viralen Komponenten auf Pflanzenzellen zu synchronisieren über Agrobacterium-Vermittelte transiente Expression beschrieben. Dieser Ansatz ist zugänglich für die Untersuchung der Replikation, gefolgt von Enkapsidierung In-vitro- Zusammenbau von nicht-viralen Komponenten in optischen viralen Genoms erschöpft Geister geeignet für biomedizinische Anwendungen.

Serie: Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Forschung

Immunologie und Infektion

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Nachweis eines Neuro-Invasive encephalitische Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways activated during cardiovascular pathologies are, however, limited by the lack of robust and physiologically relevant methods. In order to model pathological vascular events we have developed an in vitro assay for studying the interaction between endothelium and whole blood. The assay consists of primary human endothelial cells, which are placed in contact with human whole blood. The method utilizes native blood with no or very little anticoagulant, enabling study of delicate interactions between molecular and cellular components present in a blood vessel.
We investigated functionality of the assay by comparing activation of coagulation by different blood volumes incubated with or without human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Whereas a larger blood volume contributed to an increase in the formation of thrombin antithrombin (TAT) complexes, presence of HUVEC resulted in reduced activation of coagulation. Furthermore, we applied image analysis of leukocyte attachment to HUVEC stimulated with tumor necrosis factor (TNF&#945;) and found the presence of CD16+ cells to be significantly higher on TNF&#945; stimulated cells as compared to unstimulated cells after blood contact. In conclusion, the assay may be applied to study vascular pathologies, where interactions between the endothelium and the blood compartment are perturbed.

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell für die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen humanem Vollblut und Endothel

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

In-vitro-Analyse Myd88-vermittelte zelluläre Immunantwort gegen das West-Nil-Virus-Infektion Mutantenstamm

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by pharmaceutical companies is a market opportunity, but it is also a strategy to increase drug accessibility and reduce therapy-associated costs. The protocols detailed here describe the evaluation of target binding and CDC induction by rituximab in Daudi cells. These two functions require different structural regions of the antibody and are relevant to the clinical effect induced by rituximab. The protocols allow the side-to-side comparison of a reference rituximab and a marketed rituximab biosimilar. The evaluated products showed differences both in target binding and CDC induction, suggesting that there are underlying physicochemical differences and highlighting the need to analyze the impact of those differences in the clinical setting. The methods reported here constitute simple and inexpensive in vitro models for the evaluation of the activity of rituximab biosimilars. Thus, they can be useful during biosimilar development, as well as for quality control in biosimilar production. Furthermore, the presented methods can be extrapolated to other therapeutic mAbs.

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

This protocol describes the in vitro comparison of two key functional characteristics of rituximab: target binding and complement-dependent cytotoxicity (CDC) induction. The methods were employed for a side-to-side comparison between reference rituximab and a rituximab biosimilar. These assays can be employed during biosimilar development or as a quality control in their production.

In - vitro - Methoden zum Vergleich der Zielbindungs und CDC Induktion zwischen Therapeutische Antikörper: Anwendungen in Biosimilarity Analyse

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

Eine effiziente und einfache Methode, NK und T-Zell-Linien von Patienten mit chronischen aktiven Epstein - Barr-Virus-Infektion zu etablieren

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

Eine einfache Durchflusszytometrie basierten Test um festzustellen, In-vitro- Antikörper abhängige Verbesserung des Dengue-Virus mit Zika-Virus genesenden Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...