Institute for Translational Sciences UTMB-NIH 1UL1RR029876-01 und Alisha Prather für ihre Unterstützung bei der Videobearbeitung für dieses Manuskripts.

Ein. Tierische Vorbereitung <ol><li> Tierische Ankunft: Bei der Ankunft des Tieres Sicherheitsstufe 2 (ABSL2) Einrichtungen, damit sich die Tiere ein Minimum von 2 Tagen bis an ihre neue Umgebung zu gewöhnen. Nach dieser Ruhepause, überprüfen Sie die Tiere, um ihre Gesundheit und das allgemeine Aussehen bewerten. <ol><li> Bei Ausnutzung fluoreszierenden Reporter ist es wichtig, alle tierischen Probanden auf einer Luzerne freie Diät zu platzieren, um die Menge von GI Autofluoreszenz-und Hintergrund-Signal zu begrenzen. </li></ol></li><li> Shave Tiere: Um die Biolumineszenz-Signal von dem Oberkopf während der Bildgebung erkannt zu verbessern; rasieren die Köpfe aller Tiere. Betäuben die Tiere mit einem Gemisch aus Sauerstoffgas und verdampft Isofluran. Sobald die Tiere vollständig betäubt sind, verwenden elektrische Haarschneidemaschine den Kopf rasieren. Einmal mit Rasieren abgeschlossen, kehren die Tiere zu ihren Käfigen und beachten zur vollständigen Erholung von den Wirkungen der Anästhesie. </li><li> Bio Medic DatenSysteme (BMDS) Transponder Insertion (zu Ort nach der Rasur der Mäuse zu nehmen, während die Tiere narkotisiert sind voll): Für eine weniger invasive Mittel zur Temperatur Implantat verfolgen eine vorprogrammierte BMDS drahtlosen Transponder subkutan in die dorsale Region von jeder Maus. Diese Transponder können zur drahtlosen Identifikation und Temperatur Aufnahme. Nach der Implantation des Transponders, gelten ein Veterinär-grade Gewebeklebstoffes auf die Wunde. </li><li> Baseline-Kollektion: Vor der Infektion, notieren eine Grundlinie Temperatur und Gewicht für alle Tiere. Sammle Blut für Plaquereduktion Neutralisationstest (PRNT) Analyse durch retro-orbitale (RO) bluten, während die Mäuse unter Narkose sind. Nach der Blutentnahme, gelten Veterinär antibiotische Augensalbe mögliche sekundäre bakterielle Infektion zu verringern. Diese Basislinie Sammlung sollte unter Berücksichtigung der Anzahl von Malen die Tiere in Narkose durch Stress auf den Mäusen platziert abgeschlossen sein. Zukünftige RO Kollektionen should nach der Bebilderung abgeschlossen sein, während die Maus noch unter Betäubung. Die maximale Blut aus einer RO erhoben werden sollten rund 200 ul sein. </li><li> Infektion: Place Mäusen unter Narkose wie zuvor beschrieben. Beimpfen durch den intranasalen Weg mit einer Dosis von 5x10 6 bis 5x10 7 pfu TC83-Luciferase in einem Gesamtvolumen von 40 ul von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch intranasale Infektion. Nach der Infektion, legen die Mäuse in ihren Gehäusekäfig und beobachten Erholung. </li></ol> 2. Animal Imaging Disclaimer: Halten Mäuse innerhalb ihrer Wohneinheit, die Biosicherheitswerkbank (BSC) oder die XIC Aufbewahrungsbox zu allen Zeiten. Die genehmigten BSCs für dieses Protokoll sind eine Klasse II Typ B1 oder B2. <ol><li> Injizieren alle Tiere mit 10 ul pro Gramm Körpergewicht intraperitoneale (IP) Luciferin in einer Konzentration von 15 mg / ml. <ol><li> Mäuse, die Ampligen sind injecte seind IP in einer Dosis von 12,5 mg / kg Körpergewicht bei -4 h nach Infektion oder 48 h nach Infektion auf ihren Gruppe. </li></ol></li><li> Vor der Injektion mit Luciferin, trennen Sie die Mäuse in Gruppen von drei bis eine gute Passform im XIC-3 Aufbewahrungsbox gewährleisten. <ol><li> Für alle Bildgebung verwenden okularen Salbe / Schmiermittel, das Trocknen der Hornhaut während des gesamten Verfahrens zu verhindern. </li></ol></li><li> Öffnen Sie die LivingImage Software und drücken Sie auf Initialisieren, um die Imaging-box vorzubereiten; set auto sparen, Belichtungszeit auto (Belichtungszeit auf auto ist ein neues Feature des LivingImage Software 3.2 und höher), sehen Feld C und Filter zu öffnen, Feld aus betrachtet sich auf die Anzahl von Mäusen Sie sind bildgebende basiert; und Filter optimiert wie für andere Imagingprojekte benötigt. </li><li> Bestätigen Sie, dass die Luft Kohlefilter noch nicht abgelaufen sind, ist der Sauerstoff Tank voll, und die Isofluran Reservoir gefüllt ist. Legen Sie kleine Streifen Isolierband in der XIC-3 isolation Box, die hilft bei der Verringerung der Tier-Bewegung während der Bildgebung. </li><li> Inject die Mäuse mit Luciferin IP wie in den Abschnitten 2.1 und innerhalb der Isofluran Ansaugkammer (mit geöffnetem Deckel) beschrieben für 3-5 min. </li><li> Nach 5 min, schließen Sie den Deckel der Ansaugkammer und starten Sie den Fluss von Isofluran. Die Narkose wird auf etwa 3-5% mit dem Sauerstoff der eingestellten Förderleistung bei etwa 2,0 L / min betrieben. Einmal vollständig unbewussten warten weitere 30 sec und übertragen Sie die Maus auf den XIC-3 Isolation Box. Sicherstellen, dass die Biosicherheitswerkbank wird ausgenutzt ermöglicht den sicheren Abfangen von Isofluran da dieses Verfahren Verlust von Isofluran aus der Ansaugkammer (die IVIS Gerät enthält einen eigenen Passive Messe Kanister und die XIC-3 Aufbewahrungsbox direkt an den in / out Anschlüsse umfassen wird zu enthalten Anästhesie Durchfluss zu gewährleisten). <ol><li> Übertragen Sie die Maus auf Chip / group Zahl basiert in den XIC-3 Isolation Box mit der Isofluran-Anschluss befestigt eind öffnen. Positionieren Sie die Maus, so dass sie in Brustlage mit Köpfen sanft ruhen auf den Klebestreifen gelegt. </li></ol></li><li> Wischen Sie die XIC Aufbewahrungsbox mit Ethanol, Spray Hände und Unterseite des XIC-3 mit CaviCide, und Transfer zum IVIS Bildgebung Kammer. Schließen Sie die Anästhesie der Aufbewahrungsbox einmal in der Bildeinheit. </li><li> Nach 10 min nach der Injektion von Luciferin, Bild die Mäuse durch die lebende Bildsoftware. </li><li> Nach anfänglichen Bildgebung mit einem offenen Filter, initiieren DLIT 3-Dimensional Imaging mit der Sequenzanalyse und Image Wizard Setup für Biolumineszenz Glühwürmchenluciferase. Dieses Abbildungsverfahren dauert 4-5 Minuten und sollte bei einem Sichtfeld, die für die gewünschte Anzahl an Mäusen durchgeführt werden. <ol><li> Ex-vivo-Analyse möglich folgenden Sektion und Sammlung des Gehirns. Legen Sie das Gehirn auf eine sterile Petrischale, tropft 50-100 ul auf Lager Luciferin am Anfang, und innerhalb der imaGing Box. </li></ol></li><li> Finalize einen zweiten offenen Filter Bild bei 15-17 min nach der Infektion nach Abschluss der DLIT Bildgebung. Stellen Sie sicher, Sequenzanalyse ausgeschaltet ist und das Sichtfeld und Filter-Einstellungen werden auf die vorherigen Einstellungen zurück. </li></ol> 3. Zurück Mice and Data Analysis <ol><li> Schalten Sie das Isofluran Verdampfer und übertragen die XIC Aufbewahrungsbox zurück zum Biosicherheitswerkbank. </li><li> Legen Sie die Maus zurück in ihre Wohneinheit, schließen Sie die obere, sprühen Sie das Gehäuse mit geeigneten Desinfektionsmittel und Ort wieder auf das Gehäuse Rack. <ol><li> Stellen Sie sicher, Mäusen vollständig aus der Narkose erholt. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie den Vorgang, wie das Experiment benötigt, bis Bildgebung abgeschlossen ist. </li><li> Desinfizieren Sie die BSC, fahren Sie das Gerät, und übertragen alle Daten auf einem externen Labor Standort für die weitere Analyse. </li><li> Analysieren Sie die Daten und generieren 3-dimensionale Bilder auf IVIS Ergebnisse uti BasisLízing die LivingImage Software. <ol><li> Sicherstellen, dass das Bild korrekt ausgerichtet ist und Beleuchtung / Farbbalance eingestellt ist. Innerhalb der Werkzeug-Palette der Optionen gehören Bildeinstellung, Korrekturen, Bildinformationen und ROI Tools. </li><li> Nutzen ROI Formen zu bestimmten Signalstärken nach Standort zu identifizieren. </li><li> Rekonstruktion der Oberflächentopographie mit der Maus Körper markieren, initialisieren 3D DLIT Wiederaufbau, und verwenden lineare Anpassung an die Orgel Karte der topographischen Rekonstruktion gesetzt. </li></ol></li><li> Weitere virale Titration Analyse kann durch die Sammlung von Blut und Organen abgeschlossen sein. Titration in dieser Studie durch Homogenisierung von Gehirngewebe in modifiziertem Eagles Medium (MEM) fertig gestellt. Das Homogenat wurde seriell verdünnt und wir infiziert eine 6-Well-Platte von Vero-Zellen für 1 Stunde. Die Zellen wurden mit einer 1,5% agarose/2xMEM Overlay abgedeckt und für 2 Tage bei 37 Grad. Zellen wurden mit 10% Formalin für 30 Minuten fixiert und mitKristallviolett. </li></ol>

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	<li>Steele, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Neurovirulence+and+Tissue+Tropism+of+Wild-type+and+Attenuated+Strains+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+Administered+by+Aerosol+in+C3H/HeN+and+BALB/c+Mice.">Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice.</a> Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).</li><li>Ludwig, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+neurovirulence+of+attenuated+and+non-attenuated+strains+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus+in+mice.">Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).</li><li>Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Neuroinvasion+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+in+the+Mouse.">Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse.</a> Virology. , 208-662 (1995).</li><li>Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficient+packaging+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus-specific+RNAs+into+viral+particles+is+determined+by+nsP1-3+synthesis.">The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis.</a> Virology. 344, 315-327 (2006).</li><li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+non-invasive+imaging+of+alphaviral+brain+infection:+Reducing+animal+numbers+and+morbidity+to+identify+efficacy+of+potential+vaccines+and+antivirals.">Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals.</a> Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).</li><li>Cook, S. H., Griffin, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase+Imaging+of+a+Neurotropic+Viral+Infection+in+Intact+Animals.">Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals.</a> J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).</li><li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+indicators+in+living+mammals.">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nat. Med. 4, 245-247 (1998).</li><li>Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Monkeypox+Viruses+Pathogenesis+in+Mice+by+In+Vivo+Imaging.">Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging.</a> PLoS ONE. 4, e6592 (2009).</li><li>Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+Imaging+Reveals+Systemic+Dissemination+of+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+in+the+Absence+of+Interferon+Receptors.">Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors.</a> J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).</li><li>Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+mouse+model+for+the+evaluation+of+potential+antiviral+compounds:+results+with+Venezuelan+equine+encephalomyelitis+virus.">Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).</li><li>Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pegylated+Alpha+Interferon+Is+an+Effective+Treatment+for+Virulent+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+and+Has+Profound+Effects+on+the+Host+Immune+Response+to+Infection.">Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection.</a> J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Während dieses Protokoll umfasst die bildgebende Aspekte für die in vivo-Analyse ist es wichtig, um die biolumineszierende Vektor als ein Schlüsselfaktor für zukünftige Studien erkannt. Unsere Ausnutzung TC83, einem attenuierten Impfstamm von VEEV, als Vektor für die Expression von Luciferase gewährleistet, daß große Mengen des Enzyms produziert werden aufgrund der sehr Replikation des Virus im ZNS, wie zuvor 1-4 beschrieben. Während die Zugabe eines zweiten subgenomischen Promotor und den ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> D-Luciferin </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xenogen IVIS System (Spectrum) </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> XGI-8-Gas Anästhesie-System </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> XIC-3 Containment Box </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LivingImage 4,0 Software </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Telemetrie / Identifikations-Chips </td><td> Bio Medic Data Systems </td><td> IPTT-300 </td><td> Tier-ID und Tempertur </td></tr><tr><td> BD Integra 1ml TB Spritze mit 26 gx 3/8 &quot;Nadel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305279 </td><td></td></tr><tr><td> Vet Bond Gewebekleber </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9259532 </td><td></td></tr><tr><td> Vetropolycin Augensalbe </td><td> Webster Veterinary Products </td><td> 78444656 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos Phosphat-gepufferte Saline 1X </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> BMDS Chip Reader </td><td> Bio Medic Data Systems </td><td> DAS-7007S </td><td></td></tr><tr><td> DAS-HOST Software </td><td> Bio Medic Data Systems </td><td></td><td> Dient zur Sonde Informationen downloaden </td></tr></tbody></table>

in vivo imaging systems (ivis) detection of a neuro-invasive encephalitic virus

Moderne Entwicklungen in der Imaging-Technologie zu fördern Weiterentwicklung und Verfeinerung in der Weise viralen Forschung durchgeführt. Zunächst von Russel und Burch in Humes 3R vorgeschlagen (Replacement, Reduction, Refinement), ist die Verwendung von Tiermodellen in der wissenschaftlichen Forschung unter dem ständigen Druck, neue Methoden zu identifizieren zu Tierversuchen zu reduzieren, während die Verbesserung der wissenschaftlichen Genauigkeit und Geschwindigkeit. Eine große Herausforderung für Humes Schulleiter ist jedoch, wie zu gewährleisten, die Studien sind statistisch genaue gleichzeitiger Reduzierung von Tierseuchen Morbidität und Gesamtzahlen. Die Wirksamkeit des Impfstoffes Studien verlangen derzeit eine große Anzahl von Tieren, um als statistisch signifikant werden und oft in hohen Morbidität und Mortalität Endpunkte zur Identifizierung von Immunschutz führen. Wir verwendeten in-vivo Imaging Systems (IVIS) in Verbindung mit einem Glühwürmchen biolumineszenten Enzyms schrittweise verfolgt die Invasion des zentralen Nervensystems (ZNS) von einem ENCEphalitic Virus in einem Mausmodell. Typischerweise wird die Krankheit relativ langsam voranschreitet, jedoch Virusvermehrung erfolgt rasch, insbesondere innerhalb des ZNS, und kann zu einer oft letalen Ausgang führen. Nach intranasale Infektion der Mäuse mit TC83-Luc, ein attenuiertes modifiziertes venezolanischen Pferde-Enzephalitis-Virus-Stamm zu drückt ein Luciferase-Gen; können wir Virusreplikation innerhalb des Gehirns sichtbar mindestens drei Tage vor der Entwicklung klinischer Krankheitssymptome. Mit Hilfe CNS Invasion als Schlüssel encephalitische Krankheitsentwicklung Endpunkt sind wir in der Lage, schnell zu identifizieren therapeutische und Impfschutz gegen TC83-Luc Infektion bevor klinische Symptome entwickeln. Mit IVIS Technologie sind wir in der Lage, die schnelle und genaue Prüfung von Medikamenten Therapeutika und Impfstoffe zeigen, bei gleichzeitiger Reduzierung der Anzahl der Tiere und Morbidität.

Mit einem genetisch veränderten Virus, TC83-Luciferase, sahen wir einen Anstieg der Biolumineszenz Signalstärke als die Virusvermehrung bewegt sich von der nasalen Region in den zentralen CNS (Abbildung 1). Aufgrund der hohen Rate Virusreplikation erwarten wir hohe biolumineszenten Signals (2A) in Abhängigkeit von dem Vektor und dem Tier Immunreaktion auf den Vektor zu erkennen. Wir erwarten, dass diese Signalanhebung auf einen Spitzenwert weiterhin, zwischen den Tagen 5-7 nach der I...

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In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Mit Hilfe Luciferase und in vivo bildgebende Systeme (IVIS) als neuartiges Mittel gegen Krankheiten Endpunkte zu identifizieren, bevor klinische Entwicklungen auftreten. IVIS hat uns erlaubt, in Echtzeit visualisiert die Invasion der encephalitische Viren über mehrere Tage, eine genauere Krankheit Modell für zukünftige Studie. Es hat uns auch die Möglichkeit, die potenziellen Schutzfunktionen von Virostatika und Impfstoffen schneller als derzeit genutzt Tiermodellen zu identifizieren. Die Fähigkeit, einzelne Tiere über mehrere Zeitpunkte zu nutzen sorgt für reduzierte Tier, Kosten und allgemeine Morbidität der Tiere genutzt sorgt für eine menschlichere und wissenschaftlichen Mitteln der Krankheit Studie.

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Nachweis eines Neuro-Invasive encephalitische Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

in-vivo-imaging-systems-ivis-detection-neuro-invasive-encephalitic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

20.5K Aufrufe.  University of Texas Medical Branch. Mit Hilfe Luciferase und in vivo bildgebende Systeme (IVIS) als neuartiges Mittel gegen Krankheiten Endpunkte zu identifizieren, bevor klinische Entwicklungen auftreten. IVIS hat uns erlaubt, in Echtzeit visualisiert die Invasion der encephalitische Viren über mehrere Tage, eine genauere Krankheit Modell für zukünftige Studie. Es hat uns auch die Möglichkeit, die potenziellen Schutzfunktionen von Virostatika und Impfstoffen schneller als derzeit genutzt Tiermodellen z...

Serie: In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

In-vivo-Imaging von transgenen Leishmania Parasiten in einer Live-Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative estimates of this process is critical as we can then develop better models of microbial community structure and function as well as advance our understanding of how viruses work to alter aquatic biogeochemical cycles. The virus reduction technique allows researchers to estimate the rate at which virus particles are released from the endemic microbial community. In brief, the abundance of free (extracellular) viruses is reduced in a sample while the microbial community is maintained at near ambient concentration. The microbial community is then incubated in the absence of free viruses and the rate at which viruses reoccur in the sample (through the lysis of already infected members of the community) can be quantified by epifluorescence microscopy or, in the case of specific viruses, quantitative PCR. These rates can then be used to estimate the rate of microbial mortality due to virus-mediated cell lysis.

The turnover rate of viruses in marine and freshwater systems can be estimated by a reduction and reoccurrence technique. The data allow researchers to infer rates of virus-mediated microbial mortality in aquatic systems.

Die Schätzung Virus Produktionsraten in aquatischen Systemen

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Mit Bioluminescent Imaging, um Synergie von Untersuchen Streptococcus pneumoniae Und Influenza A Virus in Infant Mäuse

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Nasal Tücher für Influenza-A-Virus-Erkennung und Isolierung von Schweine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

Erkennung und Entfernung von Nuklease Kontamination während der Reinigung von rekombinanten Prototyp schaumig Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...