Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Schwedischen Forschungsrat (90293501, A0290401, A0290402), Siebte Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung unterstützt Nr 602.699 (DIREKT), der NovoNordisk Stiftung, der Gurli und Edward Brunnberg Stiftung, Stamm Therapie, Vleugel Stiftung und Åke Wiberg Foundation.

HINWEIS: Das Blut wurde von gesunden Individuen durch offene Systemvenenpunktion bei der Genehmigung mit der Ethical Review Board in Uppsala (Permit No. 2008/264) erstellt. 1. Seeding Cells <ol><li> Kultur primären menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) bei 37 ° C in 5% CO 2 in T75-Flaschen mit 1% Gelatine in PBS pH 7,4 beschichtet. </li><li> Entfernen Kulturmedium aus einem T75-Kolben mit HUVEC (oder eine andere Art von primären humanen Endothelzellen) und wasche die Zellen mit 2,1 mM EDTA in PBS pH 7,4. Lösen die Zellen durch Zugabe von 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA und Inkubation für 2 - 3 min in 37 ° C. </li><li> Sammeln Zellen durch Spülen des Kolbens mit 9 ml 10% FBS in PBS pH 7,4 und übertragen die Zellsuspension in ein 15 ml Röhrchen. Spin down die Zellen bei 735 xg für 5 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet vorsichtig in endothelialen Zellwachstumsmedium mikrovaskulären (EG GMMV) und zählen Sie die Zellen in einer Bürker Kammer. Seed 21.000 cEllen / cm 2 in 1-Well-Zellkultur Dias und bei 37 ° C. 2 Tage der Kultur - Die HUVEC wird nach dem 1. konfluent werden. Überwachen Sie die Zellmorphologie und Konfluenz täglich unter einem Lichtmikroskop. </li></ol> 2. Herstellung von Vollblut <ol><li> Bereiten alle künstlichen Oberflächen, die mit Blut in Kontakt mit einer Doppelschicht aus immobilisiertem Heparin (CHS) sein wird gemäß den Anweisungen des Herstellers. CHS staub- beschichtete Materialien können bei Raumtemperatur bis zu 6 Monate ohne Funktionsverlust gelagert werden. </li><li> Verwenden offenes System der Blutabnahme, um Blut aus einem gesunden Spender kurz (&lt;30 min) vor dem Start des Blut endothelialen Kammer Experiment ziehen. Paar eine Injektionsnadel (18 G x 50 mm), um CHS beschichteten Silikonschlauch (Innendurchmesser: 2 mm) vor der Blutentnahme sorgfältig in ein CHS beschichteten 50-ml-Röhrchen. Supplement Blut mit unfraktioniertem Heparin, um eine Endkonzentration von 0,75 IU / ml zu erreichen. Mischen Sie das Blut sanft INVErting das Rohr 2 - 3 mal. </li></ol> 3. Blut Endothelial Chamber Modell <ol><li> Herstellung Blutkammern (1A, Draufsicht) in Acryl Polymethylmethacrylat (PMMA), die aus zwei Zylindern (Höhe 8 mm und der Radius 9 mm), die zu einer PMMA Schieber (25 x 75 mm) aufgeklebt werden. Montieren Sie die Kanten der Zylinder nach oben mit Gummi-O-Ringe, um die Blutkammer gegen die Glasobjektträger mit kultivierten Endothelzellen (Abbildung 1B) zu versiegeln. Drehen der Blutkammer zu dem Kulturträger mit Endothelzellen danach in einer vertikalen Position (1C) verbunden ist. </li><li> Verwenden Sie ein CHS beschichtet Pipettenspitze bis 1,5 ml Blut in jeder CHS beschichtet Kammer kümmert sich nicht um das Blut zu aktivieren übertragen. </li><li> 1 ml Blut in Mikrozentrifugenröhrchen mit 30 ul 0,34 MK 3 EDTA auf eine Endkonzentration von 10 mM K 3 EDTA zur Bestimmung der anfänglichen Plasmaproteinkonzentrationen zu erreichen mitein Enzym Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Vorsichtig das Blut und die Rohre halten auf Eis. </li><li> Entfernen Sie die Kunststoffwände der Zellkulturobjektträgern gemäß den Anweisungen des Herstellers und sorgfältig waschen Sie die Zellen in PBS pH 7,4. Achten Sie darauf, anschließend entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich aus den Folien. Lassen Sie sich nicht die Zellen austrocknen. </li><li> Legen Sie die Folie auf der Oberseite der Blutkammern, mit Zellen mit Blick auf das Blut. Sichern Sie den Schlitten, indem eine Klammer um das Blut von Endothelzellen Kammer. Verwenden Sie einen Kunststoff-Rutsche für zusätzliche Unterstützung zum Bruch der Zellkultur Glasobjektträger zu vermeiden, wenn Sie den Klemme. </li><li> Befestigen Sie den Blut Endothelzellen Kammer auf einem rotierenden Rad (40 cm Durchmesser) in einem 37 ° C Wasserbad. Drehen jeder Kammer auf das Rad bei 0,5 × g für 30 min. </li><li> Nach der Inkubation zerlegen Blut Endothelzellen Kammer. Waschen Sie die Zellkulturträger in PBS pH 7,4 und fixieren die Zellen in eiskaltem 1% Paraformaldehyd (PFA) foder 10 min. 1 ml Blut aus jeder Kammer zu Mikrozentrifugenröhrchen mit 30 ul 0,34 MK 3 EDTA auf eine Endkonzentration von 10 mM K 3 EDTA zu erreichen, und die Röhrchen vorsichtig mischen. Halten Sie die Röhrchen auf Eis. </li><li> Zentrifugieren der Röhrchen bei 4.560 xg für 10 min bei 4 ° C. Übertragen Sie das Blutplasma, um neue Reaktionsgefäße und lagern in -70 ° C bis zur weiteren Analyse. </li></ol> 4. Analyse der Blut Endothelial Wechselwirkungen <ol><li> Zuführen Immunfluoreszenzfärbung mit Maus-anti-Mensch-CD16, gefolgt von sekundären Ziege-anti-Maus-Alexa 488 und Phalloidin-TexasRed. Führen Sie jede Färbung Schritt für 1 h bei Raumtemperatur und Waschen der Objektträger in PBS pH 7,4 zwischen jedem Schritt. Gegenfärbung der Zellkerne mit DAPI für 10 min bei Raumtemperatur. Analyse Blutkomponenten an die Endothelzellen durch Fluoreszenzmikroskopie in Kombination mit Bildanalyse unter Verwendung von geeigneten Bildanalysesoftware, wie CellProfiler gebunden. </li><li> Quantify die Reaktionen im Blut Fach mit Thrombin-Antithrombin (TAT) ELISA nach Herstellerangaben der Plasmaproben. </li><li> Verwenden geeigneter statistischer Instrumente, z. B., einem ungepaarten t-Test, um die Daten zu analysieren. </li></ol>

<ol>
	<li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice+and+Not+Men:+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology.">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li><li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li><li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin.">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li><li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In.">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li><li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro.">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li><li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials,+cells,+and+tissues:+basic+concepts,+test+models,+and+practical+guidelines.">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+the+endothelium.">Spatial and temporal dynamics of the endothelium.</a> J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).</li><li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders.">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li><li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors.">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li><li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation.">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li><li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular-Bed&#8211;Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States.">Vascular-Bed&#8211;Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Mehrere Interaktionen zwischen der Blutgefäßwand und werden normalerweise in einem Ruhezustand aufgrund der Nichtklebe und antithrombotische Beschaffenheit des Endothels gehalten. 7 Bei pathologischen Zuständen, die eine Entzündung, wird das Endothel mit einer resultierenden Zunahme der Haftrezeptorexpression 8 aktiviert und eine reduzierte Fähigkeit zur Hemmung der Hämostase. 9 Aktivierung der Kaskadenanlagen im Blut wiederum verstärkt die Thrombogenität des Endothels verursacht weitere Thrombose und Leukozytenrekrutierung. 10 Um ein besseres Verständnis für diese heikle Interaktionen zwischen Endothelzellen und Vollblut zu gewinnen, haben wir entwickelten ein neuartiges Verfahren, bei dem in vitro kultivierten Endothelzellen in Kontakt mit Vollblut gegeben. Nach unserem Wissen ist unser Setup der Erste, der Endothelzellen mit menschlichem Vollblut mit keinen oder sehr wenig Antikoagulans für längere Zeiträume inkubiert zeigen. nt &quot;&gt; Die Empfindlichkeit dieses Systems wird durch Venenpunktion offenen System in Kombination mit einer Schutzschicht aus immobilisiertem Heparin auf alle mit Blut in Kontakt gebracht Oberflächen ermöglicht. Die Verwendung eines offenen Systems während der Blutbeschaffungs reduziert die Aktivierung der Kaskadensysteme während der Blutentnahme während die die Verwendung einer selbstbestimmten Menge von Antikoagulans. Kommerziell erhältliche evakuierten Blutröhrchen kann jedoch abhängig von den beabsichtigten Endpunkte der Studie verwendet werden. Die Endkonzentration von Antikoagulans zu den meisten kommerziell erhältlichen geschlossenen System Röhrchen gegeben empfindlich hemmen und ansonsten schwer in der Setup studieren Wechselwirkungen. 6 eine Schutz Heparin Oberfläche beseitigt weiterhin die Aktivierung des Blutes durch Oberflächenkontakt mit anderen als den Endothelzellen Oberflächen. 5 Tatsächlich Inkubation von Vollblut mit einer kleinen Menge an unfraktioniertem Heparin ergänzt Kammer ohne den Schutz der CHS in Folge der Gerinnselbildung. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Die Luftblase in der Kammer ermöglicht Mischen des Blutes während der Inkubation mit den Endothelzellen. Um die Wirkung des Luftblasengröße zu bewerten, haben wir zwei verschiedene Blutvolumen. In diesem Modell messen wir ähnliche TAT Ebenen unabhängig von Luftblasengröße in Kammern mit HUVEC inkubiert. TAT war, stieg jedoch mit einem kleineren Luftblasengröße in den voll CHS behandelten Kammern. Diese in Übereinstimmung mit den zuvor beschriebenen Eigenschaften der Endothelzellen 11 zeigt eine regulatorische Wirkung auf die verstärkte Aktivierung der Gerinnung durch die Endothelzellen, die in der inerten CHS Kammer fehlt vorgesehen. Die Luftblase in dem System erzeugt eine Strömung bei einer Drehung der Kammer. Die Größe der Blase ist, die Kräfte in diesem Drehsystem beeinflussen. Dies wird durch unsere Ergebnisse in 2D gezeigt waren eine kleinere Blase erzeugt höhere TAT Werten, die eine verringerte Kraft auf den Blut dh die Blutbewegunginnerhalb der Kammer geringer ist und dadurch die Aktivierung des Kaskadensystems in einem höheren Ausmaß auftritt. Es sollte erwähnt werden, dass in diesem System schaffen wir eine rotierende Strömung, die in der Geschwindigkeit verschieden sein wird über die Kammer mit der höchsten Geschwindigkeit auf den Wänden und dem niedrigsten in der Mitte. Dies ist offensichtlich nicht eine optimale Umgebung hinsichtlich Strömung und Scherbeanspruchung für die Endothelzellen, aber wir haben ein System Herstellung von stabilen und reproduzierbaren Ergebnissen. Weitere optimalen Bedingungen würde beinhalten zirkulierenden laminare Strömung in der Abwesenheit von Turbulenzen. Dies ist jedoch nicht möglich, in der hier dargestellten Modells und unseres Wissens ein solches System nicht verfügbar ist aktuell. Obwohl es mehrere mikrofluidische Systeme im Handel erhältlich, die nicht möglich ist, mit Vollblut ohne oder mit geringen Mengen von Antikoagulans zu dem System hinzugefügt werden, wodurch kombinieren können korrekten empfindliche Auswertung der Wechselwirkungen zwischen allen im Blut und Endothelzellen Komponenten ermöglichen. Weiterhin gab es eine 2-fache Zunahme bei der Einstellung von Blutzellen in Richtung TNF aktiviert HUVEC in Kombination mit einem verdoppelten Bildung von TAT unabhängig von dem Blutvolumen. Dies belegt die Stabilität des Modellsystems und zeigt auch die Möglichkeit, ein aktiviertes Endothel in Kombination mit Vollblut verwenden. Zukunft der Blutkammer Endothelzellen verwendet werden, um Blutzellrekrutierung zu aktivierten Endothelzellen durch eine Vielzahl von Markern auf Zellen unter verschiedenen Bedingungen und Stufen der Aktivierung exprimiert untersuchen. Darüber hinaus kann das Modell in Kombination mit pharmakologischen Mitteln, um Auswirkungen auf Entzündungszustände auswerten verwendet werden. Zusammenfassend zeigen wir den großen Vorteil der Kombination einer Kammermodell mit menschlichem Blut und Gefäßzellen, um eine vollständige menschliche in vitro-System die relevanten Untersuchungen von Gefäßerkrankungen durchführen zu erstellen.

Methoden zur Analyse von Blut-Kreislauf-Interaktionen bei kardiovaskulären Erkrankungen sind generell mit Tierforschung Experimente. Ergebnisse in experimentellen Tiermodellen erstellt Forschung kann jedoch nur wenig oder keine Auswirkungen auf die menschliche Erkrankung. 1,2 Als solches gibt es einen Bedarf für eine gute und zuverlässige in-vitro-Modellen, um zelluläre Wechselwirkungen zwischen dem Blutabteil und vaskuläre Endothelzellen zu untersuchen eine menschenähnliche System. Wir haben deshalb eine Blut Endothelzellen Kammer Modell etabliert. Dieser basiert auf einer zum Wechselwirkungen zwischen Biomaterialien und menschlichem Vollblut untersuchen zuvor beschriebenen Modell. 3 Im Gegensatz zu anderen In-vitro-Setups, wo in der Regel beschränkte Anzahl gereinigten Komponenten, dh, Thrombozyten, Leukozyten oder Endothelzellen zur Verfügung stehen, enthält das vorliegende Modell alle die Komponenten präsentieren in einem Blutgefäß. Der Aufbau der Blut endothelial cell Kammer-Modell ist auf die Verwendung von frisch entnommenen menschlichen Blutes mit wenig oder ohne Zusatz von Antikoagulans zu ermöglichen. Blut während längere Zeiträume gespeichert erwerben sogenannten Lagerläsionen, wo Abbau von Erythrozyten kann mit empfindlichen Wechselwirkungen zwischen Blut und Endothelzellen stören. 4 Gerinnselbildung während der Handhabung von Vollblut ex vivo zu vermeiden erfordert entweder hohe Dosen von Antikoagulans oder das gesamte Material in Kontakt mit Blut nicht-aktivierende sein. Als nicht-aktivierenden Oberflächen sind selten in der Laborumgebung können Materialien wahlweise mit einer Schutzschicht aus immobilisiertem Heparin ausgestattet werden. Eine Schutzschicht aus immobilisiertem Heparin, die meisten Materialien schaffen eine Oberfläche, wo Blutkontakt kann ohne eine Aktivierung der Gerinnungskaskade auftreten, angewendet werden kann (nachstehend als Corline Heparin Fläche (CHS) bezeichnet). 5 Somit kann durch Ausstattung der Kammern mit CHS, das Blut endothelialen cell Kammer Modell ermöglicht die Verwendung von sehr geringen Konzentrationen von Antikoagulans im Blut. Vermeidung der Zugabe von hohen Konzentrationen von Antikoagulans im Blut endothelial Kammer Modell ermöglicht es, empfindliche Wechselwirkungen innerhalb eines Blutgefäßes, die andernfalls verdeckt sein könnten, zu prüfen. 6 Das Blut Endothelzellen Kammer Modell besteht aus zwei Kammern, die durch Anbringen Kunststoffzylinder ausgebildet (Höhe: 8 mm; Radius: 9 mm) zu einem Kunststoffobjektträger. Die Kanten nach oben auf den Zylinder mit Nuten, die mit Gummi-O-Ringe zur Abdichtung der Kammern gegenüber dem Zellkulturträger ausgestattet sind, verwendet, ausgestattet. Die Kammern nur teilweise mit Blut gefüllt, wenn die Luft in die Kammer gelassen hält Blut in Bewegung, wenn die Kammern werden anschließend in eine vertikale Position (Figur 1) gedreht wird. Um die Funktionalität des Modells zu bewerten, führten wir Experimente mit entweder einer vollständig beschichteten CHSKammer oder menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC). Zwei getrennte Blutvolumina wurden untersucht und die Bildung von Thrombin, Antithrombin (TAT) -Komplexe (ein indirekter Marker der Koagulation) wurde mit Enzym-gebundenen Immunosorbent-Assay (ELISA) gemessen. Wir haben dann beurteilt die Wirkung von Blutvolumina und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) stimuliert Endothelzellen auf Leukozytenrekrutierung durch Bildanalyse. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Aufbau des Blut Endothelzellen Kammer-Modell. (A) Draufsicht schematische Zeichnung der Blutkammer in PMMA. (B) Primäre humane Endothelzellen auf 1-well Kammer-Objektträgern kultiviert werden. Frisches menschliches Blut wird einem zwei Kammern auf einem Objektträger zugegeben. Die Kammern und zur Handhabung des Blutes verwendet alles Material mit einer Schutzbeschichtung HS behandelt. Nach dem Entfernen der Wände des cell Kulturträger, die Zellen gegenüber dem Blut angeordnet und das System gespannt wird geschlossen. (C) Das Blut endothelialen Zellkammern werden dann unter Drehung in 37 ° C inkubiert. Danach können die Reaktionen in der Blutkammer durch ELISA analysiert und die Endothelzellen kann durch Mikroskopie analysiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:91px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:272px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-12200</td>
			<td style="width:272px;">Any other type of primary human endothelial cell may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-22120</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G-2500</td>
			<td style="width:272px;">Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">TAT ELISA</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Lab.</td>
			<td style="width:119px;">TAT-EIA-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Mouse anti-human CD16</td>
			<td style="width:91px;">DAKO</td>
			<td style="width:119px;">F7011</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Goat anti-mouse Alexa 488</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A11001</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Phalloidin-Texas Red</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A22287</td>
			<td>Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>Dilution 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E-6758</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Tecnologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10437</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1 well cell culture slides</td>
			<td style="width:91px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">354101</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Blood Chambers</td>
			<td style="width:91px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Clamps</td>
			<td style="width:91px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">2052204</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Corline Heparin Surface (CHS)</td>
			<td style="width:91px;">Corline Systems AB</td>
			<td style="width:119px;">945-00</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hypodermic needle</td>
			<td style="width:91px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-1850R</td>
			<td style="width:272px;">Size: 18 G x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Unfractionated Heparin (UFH)</td>
			<td style="width:91px;">Leo Pharma</td>
			<td style="width:119px;">585679</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">K3EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">1709958</td>
			<td style="width:272px;">Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">PFA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-6148</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">80i</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Light microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">TS100</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:91px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:119px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:272px;">Available for free at www.cellprofiler.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium

Die Mehrzahl aller bekannten Krankheiten, die durch Störungen des kardiovaskulären Systems begleitet. Studien über die Komplexität der Interaktion Wege während kardiovaskulärer Pathologien aktiviert werden, jedoch durch das Fehlen von robusten und physiologisch relevante Verfahren beschränkt. Um pathologischen vaskulären Ereignissen modelliert haben wir ein in-vitro-Assay zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Endothel und Vollblut entwickelt. Der Assay besteht aus primären humanen Endothelzellen, die in Kontakt mit dem menschlichen Gesamtblut gegeben werden. Das Verfahren nutzt Nativblut mit keiner oder sehr wenig Antikoagulans, sodass Studie von empfindlichen Wechselwirkungen zwischen in einem Blutgefäß vorliegenden molekularen und zellulären Komponenten. Wir untersuchten die Funktionalität des Tests durch Vergleichen der Gerinnungsaktivierung durch verschiedene Blutvolumen mit oder ohne menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC) inkubiert. Während ein größeres Blutvolumen trugen zueine Zunahme der Bildung von Thrombin Antithrombin (TAT) -Komplexe, der Anwesenheit von HUVEC zu einem Abfall der Aktivierung der Gerinnung. Ferner verwendeten wir die Bildanalyse von Leukozyten-Bindung an HUVEC stimuliert mit Tumornekrosefaktor (TNF) und fanden das Vorhandensein von CD16 + Zellen signifikant höher auf TNF-stimulierten Zellen im Vergleich zu nicht stimulierten Zellen nach dem Kontakt mit Blut sein. Abschließend kann der Assay verwendet werden, um vaskuläre Pathologien, wobei Wechselwirkungen zwischen dem Endothel und der Blutkammer gestört werden studieren.

Die Notwendigkeit der CHS Coating Um Reaktionen in Vollblut spezifisch für die von den Endothelzellen hervorgerufen zu messen, müssen alle für das Blut Endothelzellen Kammer verwendeten Materialien mit einer CHS Schlichte vor Gebrauch eingerichtet werden. 2A (links) zeigt eine unbeschichtete Kammer nach 30 min Blutkontakt mit einem deutlich sichtbaren vorliegenden gerinnen. Behandeln der Kammer mit CHS (2A, rechts) auf der anderen Seite schützt das Blut aus unkontrollierte Aktivierung, so dass die Ergebnisse aufgrund der Endothelzellen Blut Wechselwirkungen. Die Wirkung des Blutvolumen in der Kammer Aktivierung der Koagulation ist als die Wahrscheinlichkeit der Wechselwirkung zwischen aktivierten Gerinnungsfaktoren erhöht wird wahrscheinlicher in stagnierenden Blut. Im Blut von Endothelzellen Kammer-Modell, wird das Blut in Bewegung aufgrund der Zirkulation einer Luftblase im Inneren der Kammer gehalten. In order, um die Wirkung von Änderungen des Blutvolumens Luftblasengröße zu bestimmen, und damit auch wurde eine CHS beschichtet Kammer zu einer CHS beschichteten Glasobjektträger, die mit 1,5 ml oder 1,75 ml Vollblut für 30 min getestet wurde, verbunden ist. Das Blutvolumen ohne Bewegung der Luftblase ist 2,5 Mal größer als 1,75 ml Blut in die Kammer aufgenommen Vergleich dazu, wenn 1,5 ml Blut verwendet wird (2B). Die gemessenen TAT-Werte vorgeschlagen TAT-Bildung mit einem erhöhten Blutvolumens (2D) erhöht. Wenn HUVEC (2C) wurden entweder mit 1,5 oder 1,75 ml Vollblut inkubiert wurde kein Unterschied zwischen den beiden Gruppen festgestellt, was darauf hindeutet, dass endotheliale Zellen die Aktivierung der Koagulation (2D) zu modulieren. Die Wirkung von TNF auf Blood Cell Rekrutierung und Aktivierung von Gerin Um die Wirkung von TNF auf die Rekrutierung von Leukozyten zu untersuchen, wurden HUVEC treated mit 20 ng / ml TNF &amp; agr; 4 Stunden vor der Blutkontakt. Blutkontakt - entweder mit 1,5 ml oder 1,75 ml Blut - wurde für 30 min, wonach die Kulturträger wurden für CD16 (2F) gefärbt fort, abgebildet und die Zahl der CD16 + Zellen quantifiziert wurde. Die Rekrutierung von CD16 + Zellen signifikant erhöht mit TNF-Behandlung (2E) 100-256 CD16 + Zellen / mm 2 (p &lt;0,0001) mit 1,5 ml Blut und 172 bis 378 (P &lt;0,0001) mit 1,75 ml Blut. Die Bildung von TAT-Komplexe wurden in den entsprechenden Plasmaproben Blut entweder mit TNF behandelten oder unbehandelten Zellen (Figur 2G) inkubiert gemessen. TNF-stimulierten Zellen induzierte eine ungefähre Verdoppelung der TAT-Komplexe im Vergleich zu unbehandelten Zellen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" /> Feigeure 2: Funktionalität des Blutes Endothelzellen Kammer-Modell. (A) Chambers mit oder ohne CHS wurden mit Vollblut inkubiert. Ohne CHS wurde ein Gerinnsel nach 30 min gebildet. Messung der Thrombin-Antithrombin (TAT) -Komplexe, indirekter Marker der Gerinnung in Vollblut ohne CHS inkubiert war&gt; 6000 pg / ml. (B) Das Blutvolumen nicht in Bewegung gehalten durch den rotierenden Luftblase mit unterschiedlichen Blutvolumina variieren. Mit der Zugabe von 1,5 ml des Blutes wird dieses Volumen 0,3 ml sein, während es auf 0,74 ml unter Zusatz von 1,75 ml zu erhöhen. (C) abgebildeten HUVEC mit Phasenkontrastmikroskopie zeigen typische endotheliale Zellmorphologie einer konfluenten Monoschicht vor Blutkontakt. (D) TAT-Werte für vollständig CHS beschichteten Kammern zeigen eine geringe Differenz, wenn verschiedene Blutvolumina werden hinzugefügt. Die Zugabe von 1,5 ml Blut in Folge 35 ± 11 pg / ml (n = 7) im Vergleich zu 1,75 ml, das in 85 resultierte77; 70 &amp; mgr; g / ml TAT (n = 8). Dieser Unterschied ist nicht mehr vorhanden, wenn HUVEC mit den gleichen Blutmengen inkubiert; 66 ± 55 ug / ml 1,5 ml (n = 5) und 66 ± 29 pg / ml 1,75 ml (n = 7). (E) Quantifizierung der Zahl der CD16 + Zellen auf entweder unstimuliert oder stimuliert TNF &amp; agr vorliegenden HUVECs nach Blutkontakt. Die Zahl der CD16 + Zellen signifikant erhöht mit TNF stimulierten Zellen, die entweder mit 1,5 ml (basal: 100 ± 40 Zellen / mm; TNFa: 256 ± 121 Zellen / mm) inkubiert und 1,75 ml (basal: 172 ± 67 Zellen / mm; TNF: 378 ± 185 Zellen / mm) von Vollblut (F) Repräsentative Bilder der unstimulierten und TNF-stimulierte HUVEC für Phalloidin (rot gefärbt), CD16 (grün) und DAPI (blau).. Maßstabsbalken = 250 &amp; mgr; m (g) die Bildung von TAT-Komplexe wird grob durch TNF stimulierten Zellen verdoppelt im Vergleich zu unbehandelten Zellen mit Blut (1,5 ml inkubiert. 2.1 ± 0,1 mal mehr TAT, n = 3; 1,75 ml: 1,7 ± 1,0 mal mehr TAT, n = 4). Alle Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt; p-Werte wurden durch ungepaarte t-Tests berechnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell für die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen humanem Vollblut und Endothel

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

9.3K Aufrufe.  Uppsala University. The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

Serie: A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Wiederkehrende Herpetic Stromakeratitis in Mäuse, ein Modell für das Studium der menschlichen HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Studieren Mikrobielle Gemeinschaften<em&gt; In-vivo-</em&gt;: Ein Modell von Host-vermittelte Interaktion zwischen<em&gt; Candida albicans</em&gt; Und<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In den Atemwegen

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

Entwicklung und Identifizierung eines neuen Subpopulation von humanen neutrophilen abgeleiteten Riesen Phagozyten<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran erhöht die Effizienz der Lentivirale Transduktion von murinen und menschliche primäre NK-Zellen

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...