Diese Arbeit wird von den Young Investigator Research Program gefördert, vom Zentrum für Infektionsforschung (zinf) von der Universität Würzburg. Juan Garcia-C Betancur ist ein Doktorand von der Graduate School of Life Sciences (GSLS) der Universität Würzburg.

1. Labeling B. subtilis und Biofilm-Assay <ol><li> Amplify von PCR, das die Promotorregion des Gens von Interesse. Wir zeigen, wie beispielsweise das Klonen von P Tapa, der Promotor der Gene, die für die Herstellung von Tasa Matrixprotein 26. Klon P Tapa in pkm008 Vektor (erstellt von der Rudner Labor, Harvard Medical School. Boston, USA) (Abb. 2). </li><li> Linearisieren die Plasmide durch enzymatische Verdauung (Enzyme empfohlen, XhoI). </li><li> Induzieren natürliche Kompetenz in B. subtilis Stamm 168, indem Sie die Ein-Schritt-Protokoll zuvor von Harwood beschrieben und Schneiden 27. </li><li> Fügen Sie die linearisierten Plasmide in die Kultur der kompetenten Zellen und wählen Sie für Spectinomycin-Resistenz nach zwei Stunden Inkubation. </li><li> Stämme erhalten wurden, die das Konstrukt in die neutrale amyE Locus von B. eingesetzt subtilis durch doppelte Rekombination (Abb. 4). So erstellen SieDoppel-markierten Stamm, die Integration von zweiten Reporter in die neutrale Locus Laca mit dem Plasmid pDR183 stellen wir in der Abbildung 3. Fügen Sie diesen Reporter mit der gleichen Technik, die wir oben beschrieben für die Insertion von Reportern in pKM008 geklont. </li><li> Übertragen Sie die Reporter aus dem Stamm 168 bis NCIB3610, die in der Lage, Biofilme zu bilden. Verwenden Sie die SPP1 Phagen Transduktion Protokoll 28,29. Grow Donorstamm in TY-Medium (LB 10 mM MgSO 4 10 uM MnSO 4). Mischen Sie 200 ul der Kultur mit 100 ul Phagen Lager Verdünnung. 3 ml Soft-Agar nach 30 min Inkubation und erlauben Phagen Halos entstehen bei 37 ° C </li><li> Sammeln Sie die Soft-Agar. Zentrifugieren es und die überstehende dachte eine Spritze 0,22 um-Filter. Mit dieser Überstand, um eine Kultur des Rezipienten-Stamm in TY-Medium zu infizieren. In 30 ul bis 10 ml Kultur 1:10 verdünnt. Inkubieren für 30 min und wählen Sie für Antibiotika-Resistenz nach 24 h Inkubation. </li><li> Sewählt einen geeigneten Kolonie wachsen und es über Nacht auf LB bei 37 ° C </li><li> Spot 3 ul der Übernachtkultur auf festen Biofilm-induzierenden Medium MSgg 1,5% Agar 30. Willkommen Zellen während 72 Stunden bei 30 ° C (3) wachsen. Nach drei Tagen Wachstum entwickelt Biofilme auf der Oberfläche des MSgg Agar bilden einen Komplex morphologischen Architektur in der Oberfläche des Agar. </li></ol> 2. Biofilmdispersion und Zellfixierung <ol><li> Entfernen Sie den Biofilm bilden die Oberfläche des MSgg Agar mit einem Zahnstocher oder einer Pinzette. Die Konsistenz des Biofilms sollte es Ihnen ermöglichen, um diese abziehen von der Oberfläche des Agars in einem Stück. </li><li> Setzen Sie den Biofilm in 3 ml PBS-Puffer und verteilen den Biofilm durch wiederholte Passage durch eine Pipette oder einer Nadel. Alternativ können Biofilm Dispersion erfolgt mit milden Beschallung werden. Milde Beschallung benötigt 12 Impulsen mit einer Leistung von 3 und Amplitude von 0,7 Sekunden. </li><li> Fix Proben vor Zell-Single-Analyse. Resuspend 300 ul der Zellsuspension in 1 ml 4% Paraformaldehyd Lösung, Inkubation bei Raumtemperatur für genau sieben Minuten. Zusammensetzung von 4% Paraformaldehyd-Lösung: 2 g Paraformaldehyd 50 ml PBS-Puffer 4 ul 10 N NaOH Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 um Filter und aliquoten </li><li> Waschen der Zellen nach der Fixierung in PBS-Puffer dreimal und resuspendieren ihnen in 300 ul PBS-Puffer. </li></ol> 3. Fluoreszenz-Mikroskopie <ol><li> Gießen Sie 200 ul 0,8% Agarose über einen Objektträger und sorgfältig bedecken Sie es mit einer anderen Folie. Entfernen der oberen Folie sanft nach 2 Minuten, um eine Schicht von Agarose an der Folie des Bodens zu erhalten. </li><li> Spot 2 ul der fixierten Zellen auf der Oberfläche der Agarose-Schicht und bedecken Sie es mit einem Mikroskop Deckglas. </li><li> Legen Sie die Probe im Fluoreszenzmikroskop. Wir verwenden ein Fluoreszenzmikroskop Leica DMI6000B ausgestattet mit einem Leica CRT6000 iIluminatIonen-System. Die Filter sind für YFP Ex: BP500/20, Em: BP535/30 und für CFP sind Ex: BP426/20, Em: 480/40 </li><li> Setzen Sie Ihre Probe einer Anregung Fluoreszenz zwischen 50-200 ms. Stellen Sie die Erregungsperiode gemäß einer negativen Kontrolle, die keine Fluoreszenz in den Bedingungen für das Experiment ausgewählt zeigt. </li><li> Siehe die Fluoreszenz Bild auf dem gleichen Bild mit hellen Feld erhalten. Zusammenführen der beiden Bilder in einem Bild. Die Ergebnisse fließen Fluoreszenz-Mikroskopie mit einem einfach markierten Stamm, der den Reporter P Tapa-YFP in 6 dargestellt werden erhalten. </li></ol> 4. Die Quantifizierung einzelner Zellen mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Disperse die Stichprobe der fixierten Zellen mit milden Beschallung. Die Probe mit Ultraschall Durchführen 2-Serie von 12 Pulsen mit einer Leistung von 5 und Amplitude von 0,7 Sekunden, um Klumpen in einzelne Zellen zu dispergieren, ohne zur Zell-Lyse. Bestätigen Sie die Effizienz der Zelle Dispersion mittels Lichtmikroskopie. </li&gt; <li> Verdünnen der Probe 1:100 in PBS-Puffer, bevor Durchflusszytometrie-Analyse. Wir verwenden ein Durchflusszytometer BD FACS Canto II. Für YFP-Fluoreszenz, verwenden Sie einen Laser-Anregung bei 488 nm mit 530/30 Filter gekoppelt. Für GFP-Fluoreszenz, verwenden Sie den Laser-Anregung bei 405 nm mit einem 408/40 Filter gekoppelt. </li><li> Kalibrieren Sie das Durchflusszytometer Maschine mit zwei negativen Kontrollen. Eine Probe von PBS-Puffer ohne Zellen in Suspension sollte als Negativkontrolle für die Größe der Teilchen, erfasst durch das Durchflusszytometer zu dienen. Eine Probe ohne Fluoreszenz-Reporter markiert ist als negative Kontrolle für die Fluoreszenz-Empfindlichkeit des Durchflusszytometer dienen. </li><li> Legen Sie die Probe mit dem fluoreszierenden Reporter im Durchflusszytometer beschriftet. Für jede Probe zu analysieren mindestens 50.000 Ereignisse mit einer Strömungsgeschwindigkeit zwischen 300 und 3000 pro Sekunde. </li><li> Erfassen von Daten mittels FACS Diva Software (BD Biosciences) und analysieren sie mit Hilfe FlowJo 8.5.2 Software. Siehe Fluoreszenz-Signale an die Steuerung, die zeigen,s keine Fluoreszenz. </li><li> Präsentieren der Daten Überwachung der Fluoreszenz-Signal von einem einfach markierten Stammes in einem Zwei-Achsen-Grafik. Zur Erstellung der Fluoreszenzsignal in der X-Achse und der Anzahl von Zellen, die die verschiedenen Ebenen der Fluoreszenz in der Y-Achse erfaßt. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung einer einzigen markierten Stamm, der den Reporter P Tapa-YFP in Abbildung 8 dargestellt werden erhalten. </li><li> Präsentieren der Daten Überwachung der Fluoreszenz-Signal von einer doppelt markierten Stamm in einem Drei-Achsen-Grafik. Zur Erstellung der Fluoreszenz-Signal von jedem der Kanäle in X und Y-Achse (beispielsweise GFP würde in der X-Achse und GFP in der Y-Achse gemessen werden) überwacht. Plot in der Z-Achse die Anzahl der Zellen, die jedes Reporterkügelchen und sie als Kontur Isolinien, die senkrecht wäre der Ebene des Papiers (Abb. 9 und 10). </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Wenn B. subtilis wächst auf einem Teller des biofilm-induzierenden Medium MSgg, Biofilmbildung wird nach drei Tagen Inkubation bei 30 ° C 30 beobachtet. Der Biofilm zeigt starke Kohärenz und es könnte von der Oberfläche des Mediums werden in einem Stück abgezogen werden. Darüber hinaus zeigt sich der Biofilm eine komplexe morphologische Architektur, die ein Indikator für die verschiedenen beteiligten Zell-Subpopulationen (Abb. 5) ist. Zum Beispiel wird die Produktion der extrazellulären Matrix in Biofilmen in der Bildung von Falten auf der Oberfläche der Kolonie. Diese Funktion kann mit der Differenzierung der Subpopulation von 19 Herstellern Matrix korreliert werden. In ähnlicher Weise ist die Ansammlung von Luft Strukturen auf der Oberfläche des Biofilms auf die Anwesenheit einer Subpopulation von sporenbildenden Zellen, da die Sporen in der apikalen Bereich dieser Strukturen 30 lokalisiert. Beispiele der Visualisierung von Zelldifferenzierung in einem einfach markierten und eine doppelt markierte Stamm unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie sind represented in 6 bzw. 7. Die einfach markierten Stamm birgt die fluoreszierenden Reporter P Tapa-GFP, die in der Subpopulation von Matrix-produzierenden Zellen exprimiert wird. Diese Subpopulation ist verantwortlich zur Produktion und Sekretion der extrazellulären Matrix, die den Biofilm (6) bildet. Die Doppel-markierten Stamm birgt die Reporter P Tapa-GFP-26 und die zusätzliche Reporter P srfAA-YFP 31. Diese zweite Reporter ermöglicht es, die Subpopulation von Zellen verantwortlich, die Signalmolekül Surfactin, was die Signalkaskade ausgelöst, um die Differenzierung der Matrix Produzenten (Abb. 7) absondern zu überwachen. Subpopulation der Matrix Produzenten sind falsch in blau gefärbten während die Subpopulation von Surfactin Produzenten falsch ist gelb gefärbt. Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung einer einzigen markierten Stamm, der Reporter P Tapa-YFP in Abbildung 8 dargestellt. Unbehandelte Kontrollstamm nicht beherbergenkeine fluoreszierende Protein Gene zeigte eine einzelne Population niedrigen relativen Fluoreszenz. Zellen, die P Tapa-YFP in nicht Biofilm-induzierenden Bedingungen nicht unterscheiden die Subpopulation von Matrix-Produzenten und die ganze Bevölkerung zeigten eine geringe relative Fluoreszenz. In Biofilm-induzierenden Bedingungen, kam es zu einer Subpopulation von Zellen mit einer hohen relativen Fluoreszenz beobachtet als eine Schulter auf der rechten Seite der niedrigen relativen Fluoreszenz Peak 23. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung eines Doppel-markierten Stammes sind in Abbildung 9 und 10 vertreten. Abbildung 9 überwacht die Subpopulationen der Matrix Produzenten und Produzenten Surfactin mit der Doppel-markierten Stamm P Tapa-GFP, P srfAA-YFP. Als Kontrolle der Hintergrundfluoreszenz verwendeten wir eine Stamm nicht beherbergen keine fluoreszierende Protein Gene. Als nächstes entdeckt man jede Subpopulation von Matrix-Produzenten und Surfactin Hersteller auf jedem Kanal Fluoreszenz unter Verwendung von Ein-markierten Stamm<html> s als Kontrollen. Die Doppel-markierten Stamm P Tapa-GFP, P srfAA-YFP zeigte zwei Subpopulationen von Zellen, die hohe Konzentrationen der fluoreszierenden Reporter. Jede Population wird gerahmt, die zeigen, dass es keine Überschneidungen bei der Expression der Reporter zwischen den beiden Subpopulationen von spezialisierten Zellen 15. Ebenso Durchflusszytometrie-Analyse mit Doppel-markierten Stamm P SKF-YFP, P Tapa-YFP ist in Abbildung 10 dargestellt. Der Reporter-Gen für die SKF überwacht die Differenzierung der Subpopulation von Kannibalen 32, die beschrieben worden ist, um koordinativ differenzieren mit der Subpopulation von Matrix 24 Herstellern. In diesem Fall hatte die doppelt markierte Stamm eine einzelne Subpopulation von fluoreszierenden Zellen, die sowohl YFP und GFP. Dies zeigte, dass beide Wege Zelldifferenzierung koordinativ sind in der gleichen Subpopulation aktiviert. 1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Insgesamt Schema des Experiments. Das Protokoll ist in drei Hauptbereiche unterteilt. Der erste Schritt erfordert die Kennzeichnung der Stamm von B. subtilis mit dem Reporter, der die Fusion Subpopulation von Interesse überwacht. Zweitens wachsen beschriftet Stämme in Biofilm-induzierenden Bedingungen. Drittens, verteilen den Biofilm und durchzuführen Single-Cell-Analyse der Population mit der Fluoreszenz-Mikroskop und Durchflusszytometrie. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung der Integration Vektor pKM008. Dieser Vektor integriert die Reporter Fusion von Interesse in der neutralen Ort amyE durch doppelte Rekombination. Der Promoter von Interesse (P Tapa) in Vektor mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII. Dann wird die Expression des GFP-Gen unter der Kontrolle des Promotors P Tapa. Die orientatIonen der Gene in das Plasmid wird durch einen Pfeil dargestellt. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig3.jpg" /> Abbildung 3. Schematische Darstellung der Integration Vektor pDR183. Dieser Vektor integriert die Reporter Fusion von Interesse in der neutralen Ort Laca durch doppelte Rekombination. Die Fusion von Interesse (P Tapa - GFP) ist in den Vektor mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI. Die Orientierung der Gene im Plasmid wird durch einen Pfeil dargestellt. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig4.jpg" /> Abbildung 4. Schema der Integration der Reporter in das Chromosom von B. subtilis durch doppelte Rekombination. (A) B. subtilis-Chromosom besitzt zwei neutrale Loci, amyE und Laca, zu Fusionen Reporter ohne Auswirkungen auf die Entwicklung des Biofilms zu integrieren. (B) </sTrong&gt; Prozess der doppelten Rekombination von pKM008. Linearisierte Plasmid integriert in das Genom von B. subtilis durch doppelte Rekombination. Der Reporter Fusion integriert in die neutrale Locus in einer stabilen Weise. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig5.jpg" /> Abbildung 5. Biofilmbildung von B. subtilis NCIB3610. Prozess der bioflm Bildung des Stammes B. subtilis NCIB 3610 beim Anbau auf dem Biofilm-induzierenden Medium MSgg während der drei Tage bei 30 ° C Sequential Bilder von der Entwicklung des Biofilms wurden alle 12h genommen. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig6.jpg" /> Abbildung 6. Visualisierung der Subpopulation der Matrix Produzenten unter dem Fluoreszenzmikroskop. Eine Probe aus einem Biofilm von B. subtilis P Tapa - GFP wurde fixiert und unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht. 200 ms der FluoreszenzAnregung zeigte eine Subpopulation von Zellen emittieren höhere Fluoreszenz als der Rest der Zellen. Wir haben über diese Subpopulation als Subpopulation von Matrix-produzierenden Zellen. Maßstabsbalken ist 3 um. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig7.jpg" /> Abbildung 7. Visualisierung der Subpopulation der Matrix Produzenten und Surfactin Produzenten unter dem Fluoreszenzmikroskop. Stichprobe aus einem Biofilm der B. subtilis P Tapa-GFP, YFP-P srfAA Doppel-markierten Stamm wurde fixiert und unter dem Fluoreszenzmikroskop. Belichtungszeit von 250 ms belegt zwei Subpopulationen von Zellen emittieren höhere Fluoreszenz als der Rest der Zellen. Eine Subpopulation exprimiert YFP und es wurde festgestellt ausschließlich unter Verwendung des YFP-Kanal (false gelb gefärbt). Dies ist die Subpopulation von Surfactin Hersteller. Eine weitere Subpopulation exprimiert GFP und es wurde ausschließlich unter Verwendung der GFP chann<html> el. Dies ist die Subpopulation der Matrix Hersteller. Maßstabsbalken ist 3 um. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig8.jpg" /> 8. Die Quantifizierung der Subpopulation der Matrix Produzenten mit 2-D-Durchflusszytometrie. Verstreute Zellen aus einem Biofilm von B. subtilis P Tapa-YFP wurden mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Das Durchflusszytometer gezählt 50,000 Ereignisse und das Fluoreszenzsignal für jedes Ereignis überwacht wurde. Anzahl der Zellen gezählt wird in Y-Achse aufgetragen, während die Intensität von YFP-Signal in der X-Achse aufgetragen ist. Die Zellen wurden in LB-Medium nicht-induzierenden Bedingungen Biofilm zu erhalten. Die Zellen wurden in MSgg mittel-bis Biofilm-induzierenden Bedingungen zu erhalten gewachsen. Die Subpopulation von Matrix-Produzenten unterscheidet nur in Biofilm-induzierenden Bedingungen. Diese Zahl wurde von López et al angepasst., PNAS (2009) 106 :280-285. s/ftp_upload/3796/3796fig9.jpg &quot;/&gt; Abbildung 9. Quantifizierung der Subpopulation der Matrix Hersteller und Produzenten Surfactin unter Verwendung von 3-D Durchflusszytometrie. Fluoreszenzsignal der Kanäle überwacht werden in der X-Achse (YFP) und Y-Achse (GFP) dargestellt. Die Z-Achse misst die Anzahl von Zellen, die sich Reporter und wird quantifiziert als Kontur Isolinien der Ebene des Papiers senkrecht. Die Anzahl der Ereignisse in diesem Experiment beobachtet wurde 50,000 Ereignisse. Linke obere Fenster enthält eine Steuerung der Hintergrund-Fluoreszenz beherbergen keine fluoreszierende Protein Gene. Rechte obere Panel erkennt die Subpopulation von Surfactin Produzenten in der YFP-Fluoreszenz-Kanal (gerahmt in gelb) mit einem einzigen Stamm P-markierten srfAA-YFP. Linke untere Platte erkennt die Subpopulation von Matrix-Produzenten in den GFP-Fluoreszenz-Kanal (blau umrandete Bilder) mit einem einzigen Stamm P-markierten Tapa-GFP. Die Doppel-markierten Stamm P Tapa &lt;/ Em&gt;-GFP, P srfAA-YFP ist in der rechten unteren Panel überwacht. Es zeigte zwei Subpopulationen, die in gelb und blau eingerahmt werden. Diese Zahl wurde von López et al angepasst., Genes and Development (2009) 23 :1631-1638. <img alt="Abbildung 10" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig10.jpg" /> Abbildung 10. Quantifizierung der Subpopulation der Matrix Hersteller und Kannibalen unter Verwendung von 3-D Durchflusszytometrie. Fluoreszenzsignal der Kanäle überwacht werden in der X-Achse (YFP) und Y-Achse (GFP) dargestellt. Die Anzahl der Ereignisse in diesem Experiment überwacht war 50,000. Rechte obere Panel erkennt die Subpopulation von Kannibalen in der YFP-Fluoreszenz-Kanal (gerahmt in gelb) in einem einzigen Stamm P-markierten SKF-YFP. Linke untere Platte erkennt die Subpopulation von Matrix-Produzenten in den GFP-Fluoreszenz-Kanal (blau umrandete Bilder) in einem einzigen Stamm P-markierten Tapa-GFP. Das d-markierte das Gerät auch Stamm P Tapa-GFP, P SKF-YFP zeigte nur eine Subpopulation von Zellen in der Diagonale auf die X-und Y-Achse (grün umrahmt). Diese Subpopulation ist in der YFP-und CFP-Kanal erkannt, weil es die zwei Reporter gleichzeitig drückt. López et al., Genes and Development (2009) 23 :1631-1638.

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	<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+microbial+biofilms.">Overview of microbial biofilms.</a> J. Ind. Microbiol. 15, 137-140 (1995).</li><li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms:+from+ecology+to+molecular+genetics.">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 847-867 (2000).</li><li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+microbial+communities:+biofilms,+interactions,+and+genetic+systems.">Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 413-437 (2000).</li><li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+as+microbial+development.">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg. Infect. Dis. 8, 881-890 (2002).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms.">Biofilms.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a000398-a000398 (2010).</li><li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+matrix+revisited.">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li><li>Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+protein+component+of+the+Bacillus+subtilis+biofilm+matrix.">A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix.</a> Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).</li><li>Latasa, C., Solano, C., Penades, J. R., Lasa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-associated+proteins.">Biofilm-associated proteins.</a> C. R. Biol. 329, 849-857 (2006).</li><li>O'Gara, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ica+and+beyond:+biofilm+mechanisms+and+regulation+in+Staphylococcus+epidermidis+and+Staphylococcus+aureus.">ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus.</a> FEMS Microbiol Lett. 270, 179-188 (2007).</li><li>Chai, Y., Chu, F., Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability+and+biofilm+formation+in+Bacillus+subtilis.">Bistability and biofilm formation in Bacillus subtilis.</a> Mol. Microbiol. 67, 254-263 (2008).</li><li>Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+sigmaD-dependent+autolysins+in+Bacillus+subtilis+population+heterogeneity.">Role of the sigmaD-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity.</a> J. Bacteriol. 191, 5775-5784 (2009).</li><li>Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EpsE+flagellar+clutch+is+bifunctional+and+synergizes+with+EPS+biosynthesis+to+promote+Bacillus+subtilis+biofilm+formation.">The EpsE flagellar clutch is bifunctional and synergizes with EPS biosynthesis to promote Bacillus subtilis biofilm formation.</a> PLoS Genet. 6, e1001243-e1001243 (2010).</li><li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+population+heterogeneity+during+growth+of+Bacillus+subtilis.">Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 19, 3083-3094 (2005).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+signaling+in+a+bacterium.">Paracrine signaling in a bacterium.</a> Genes Dev. 23, 1631-1638 (2009).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Jongbloed, J. D., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+differential+gene+expression+by+improved+cyan+fluorescent+protein+and+yellow+fluorescent+protein+production+in+Bacillus+subtilis.">Visualization of differential gene expression by improved cyan fluorescent protein and yellow fluorescent protein production in Bacillus subtilis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6809-6815 (2004).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+gene+expression+patterns+of+competence+development+and+initiation+of+sporulation+in+Bacillus+subtilis+grown+on+chemically+defined+media.">Single cell analysis of gene expression patterns of competence development and initiation of sporulation in Bacillus subtilis grown on chemically defined media.</a> J. Appl. Microbiol. 101, 531-541 (2006).</li><li>Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+phosphorelay+perturbations+on+architecture,+sporulation,+and+spore+resistance+in+biofilms+of+Bacillus+subtilis.">Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 188, 3099-3109 (2006).</li><li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community.">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 199-210 (2008).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability,+epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li><li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Guzman, A., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KinD+is+a+checkpoint+protein+linking+spore+formation+to+extracellular-matrix+production+in+Bacillus+subtilis+biofilms.">KinD is a checkpoint protein linking spore formation to extracellular-matrix production in Bacillus subtilis biofilms.</a> MBio. 1, (2010).</li><li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis.">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannibalism+enhances+biofilm+development+in+Bacillus+subtilis.">Cannibalism enhances biofilm development in Bacillus subtilis.</a> Mol. Microbiol. 74, 609-618 (2009).</li><li>Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactin,+a+crystalline+peptidelipid+surfactant+produced+by+Bacillus+subtilis:+isolation,+characterization+and+its+inhibition+of+fibrin+clot+formation.">Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).</li><li>Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accessory+protein+required+for+anchoring+and+assembly+of+amyloid+fibres+in+B.+subtilis+biofilms.">An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms.</a> Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).</li><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Novick, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+systems+in+staphylococci.">Genetic systems in staphylococci.</a> Methods Enzymol. 204, 587-636 (1991).</li><li>Yasbin, R. E., Young, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+in+Bacillus+subtilis+by+bacteriophage+SPP1.">Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1.</a> J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).</li><li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li><li>Nakano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=srfA+is+an+operon+required+for+surfactin+production,+competence+development,+and+efficient+sporulation+in+Bacillus+subtilis.">srfA is an operon required for surfactin production, competence development, and efficient sporulation in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 173, 1770-1778 (1991).</li><li>Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannibalism+by+sporulating+bacteria.">Cannibalism by sporulating bacteria.</a> Science. 301, 510-513 (2003).</li><li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+about+Bacillus+subtilis+as+a+multicellular+organism.">Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).</li><li>Shapiro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms.">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Tatsache, dass bakterielle Gemeinschaften Subpopulationen von Zellen, die bestimmte Gruppe von Genen, beweist die Komplexität mikrobieller Gemeinschaften 33,34 zeigen. Dieses Protokoll soll helfen, festzustellen, ob die Expression eines beliebigen Gens von Interesse für eine bestimmte Subpopulation von spezialisierten Zellen innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft beschränkt. Die Visualisierung dieser Subpopulationen erfordert die Entwicklung neuer Techniken, da herkömmliche Methoden Genexpression ode...

<table border="1"><tbody><tr><td> Technik </td><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td rowspan="11"> MSgg Zusammensetzung </td><td> 5 mM Kaliumphosphat </td><td> Roth </td><td> 6878 </td></tr><tr><td> 100 mM MOPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> 2 mM Magnesiumchlorid </td><td> Roth </td><td> 2189,1 </td></tr><tr><td> Calciumchlorid 700μM </td><td> Roth </td><td> A119.1 </td></tr><tr><td> Eisenchlorid 50 uM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 157740 </td></tr><tr><td> Zinkchlorid 1 &amp;mgr; M </td><td> Applichem </td><td> A2076 </td></tr><tr><td> Thiamin 2 &amp;mgr; m </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74625 </td></tr><tr><td> Glycerin 0,5% </td><td> Roth </td><td> 7533 </td></tr><tr><td> GlutaMate 0,5% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 49621 </td></tr><tr><td> Tryptophan 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0254 </td></tr><tr><td> Phenylalanin 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2126 </td></tr><tr><td> Zellfixierung </td><td> Paraformaldehyd </td><td> Roth </td><td> 0335 </td></tr><tr><td></td><td> Bezeichnung des Geräts </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Ultraschallbehandlung </td><td> Zelle Sonicator </td><td> Bandelin </td><td> D-1000 </td></tr><tr><td> Fluoreszenz-Mikroskopie </td><td> Fluoreszenz-Mikroskop </td><td> Leica </td><td> DMI6000B </td></tr><tr><td></td><td> Name der Software </td><td> Firma </td><td> Katalog-Zahl </td></tr><tr><td> Fluoreszenz-Mikroskopie </td> &lt;td&gt; Asaf </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Die Durchflusszytometrie </td><td> FCASDiva </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> Die Durchflusszytometrie </td><td> FlowJo </td><td> Treestar </td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell analysis of bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry

Biofilm-Bildung ist ein allgemeines Attribut auf fast allen Bakterien 6.1. Wenn Bakterien Biofilme zu bilden, sind Zellen, in der extrazellulären Matrix, die hauptsächlich gebildet wird von Proteinen und Exopolysacchariden, neben anderen Faktoren 7-10 umhüllt. Die mikrobielle eingeschlossen innerhalb der Biofilme häufig zeigt die Differenzierung von unterschiedlichen Subpopulation von spezialisierten Zellen 11-17. Diese Subpopulationen koexistieren und zeigen oft räumliche und zeitliche Organisation innerhalb des Biofilms 18-21. Biofilm-Bildung in den Modellorganismus Bacillus subtilis erfordert die Differenzierung von Subpopulationen von spezialisierten Zellen. Unter ihnen ist die Subpopulation der Matrix Hersteller verantwortlich zu produzieren und sezernieren die extrazelluläre Matrix des Biofilms wesentlichen für die Biofilmbildung 11,19. Daher ist die Differenzierung von Matrix-Produzenten ein Markenzeichen der Biofilmbildung bei B. subtilis. Wir haben fluoreszierenden Reporter zur Visualisierung und Quantifizierung der Subpopulation der Matrix Produzenten in Biofilmen von B. subtilis 15,19,22-24. Konkret haben wir beobachtet, dass die Subpopulation der Matrix Hersteller in Reaktion auf das Vorhandensein von selbst produzierten extrazelluläres Signal Surfactin 25 unterscheidet. Interessanterweise wird Surfactin von einer Subpopulation von spezialisierten Zellen unterscheidet sich von der Subpopulation von Matrix 15 Herstellern produziert. Wir haben in diesem Bericht die technischen Ansatz notwendig, visualisieren und quantifizieren die Subpopulation von Matrix-Produzenten und Surfactin Produzenten innerhalb der Biofilme von B. subtilis beschrieben. Um dies zu tun, sind fluoreszierende Reporter von Genen für Matrix-Produktion und die Produktion benötigten Surfactin in das Chromosom von B. eingefügt subtilis. Reporter werden nur in einer Subpopulation von spezialisierten Zellen exprimiert. Dann können die Subpopulationenüberwacht mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie (siehe Abb. 1). Die Tatsache, dass unterschiedliche Subpopulationen von spezialisierten Zellen in vielzelligen Gemeinschaften von Bakterien koexistieren gibt uns eine andere Perspektive über die Regulation der Genexpression in Prokaryoten. Dieses Protokoll befasst sich mit diesem Phänomen experimentell und es kann leicht zu einer anderen Arbeits-Modell angepasst werden, um die molekularen Mechanismen der phänotypischen Heterogenität innerhalb einer mikrobiellen Gemeinschaft aufzuklären.

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Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Mikrobielle Biofilme sind in der Regel bestehend aus Subpopulationen von spezialisierten Zellen. Einzelzell-Analyse dieser Subpopulationen setzen die Verwendung von fluoreszierenden Reporter. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu visualisieren und überwachen mehrere subpopulationswithin<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilmen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie.

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

single-cell-analysis-bacillus-subtilis-biofilms-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

20.3K Aufrufe.  University of Würzburg. Mikrobielle Biofilme sind in der Regel bestehend aus Subpopulationen von spezialisierten Zellen. Einzelzell-Analyse dieser Subpopulationen setzen die Verwendung von fluoreszierenden Reporter. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu visualisieren und überwachen mehrere subpopulationswithin B. subtilis Biofilmen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie.

Serie: Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two Sprague-Dawley rats were used in this study. Animals were orally treated twice a day for two days with B. subtilis BSB3 strain or PBS. The next day after the last treatment, each group was divided and two experimental groups (one treated with PBS and one treated with B. subtilis) were placed at 45 oC for 25 min. Two control groups stayed for 25 min at room temperature. All rats were euthanized and different parameters were analyzed in all groups. Adverse effects of heat stress are registered by the decrease of villi height and total mucosal thickness in the intestinal epithelium; translocation of bacteria from the lumen; increased vesiculation of erythrocytes and elevation of the lipopolysaccharides (LPS) level in the blood. The protective efficacy of treatment is evaluated by prevention of these side effects. The protocol was set up for the oral treatment of rats with bacteria for prevention of heat stress complications, but this protocol can be modified and used for other routes of administration and for analysis of different compounds.

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

We described a protocol for prevention of heat stress effects in rats by oral pre-treatment with beneficial bacteria. This protocol can be modified and used for various routes of administration and for analysis of different compounds.

Prävention von Hitzestress Unerwünschte Wirkungen bei Ratten durch<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Dehnungs

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Methodologien für das Studium<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilme als Modell für kleine Molekül-Inhibitoren Biofilm Charakterisieren

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies in an attempt to understand the precise mechanisms that lead to the breakdown of self-tolerance and subsequent autoimmunity. Approaches thus far have been based on the study of one specific aspect of the immune system (a single or few cell types or cytokines), and do not offer a global assessment of complex autoimmune disease. While patient sera-based studies have afforded important insights into autoimmunity, they do not provide the specific cellular source of the dysregulated cytokines detected. A comprehensive single-cell approach to evaluate cytokine production in multiple immune cell subsets, within the context of &#34;intrinsic&#34; patient-specific plasma circulating factors, is described here. This approach enables monitoring of the patient-specific immune phenotype (surface markers) and function (cytokines), either in its native &#34;intrinsic pathogenic&#34; disease state, or in the presence of therapeutic agents (in vivo or ex vivo).

Here we describe a single-cell proteomic approach to evaluate immune phenotypic and functional (intracellular cytokine induction) alterations in peripheral whole blood samples, analyzed via mass cytometry.

Einzellige Analyse der Immunophenotype und Produktion von Zytokinen im peripheren Blut über Masse Zytometrie

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...