Wir danken Matt Parsek an der University of Washington (Seattle, WA) zur Bereitstellung von P. aeruginosa und E. coli-Stämme und Roger Nokes an der University of Canterbury (Neuseeland) für den Zugriff auf Streams Software. Diese Arbeit wurde durch Zuschuss R01AI081983 von den National Institutes of Health, Nationalen Institut für Allergien und Infektionskrankheiten unterstützt. Konfokale Bildgebung wurde an der Northwestern Biological Imaging Facility (BIF) durchgeführt.

1. Durchflusszelle einrichten und Inokulation . HINWEIS: Verwenden Sie ein im Song et al Doppeleinlass mikrofluidischen Durchflusszelle, 2014 14, Biofilme wachsen. Diese Durchflusszelle ist in der Lage, gut definierte glatte chemische Gradienten erstellen. Die Durchflusszelle ist in Abbildung 1 unter Verwendung von P. gezeigt und Durchflusszellenherstellung wurde zuvor in Song et al., 2014 14. Hier werden wir ausführlich unsere Methoden aeruginosa und E. coli, Biofilme zu bilden, aber andere Arten können geeignet zu sein. Wir verwendeten P. aeruginosa PAO1- gfp, die konstitutiv exprimiert ein grün fluoreszierendes Protein (GFP), als Modellorganismus für die Biofilmentwicklung. E. Zusätzlich verwendeten wir coli DH5a zu Mischarten Biofilmen mit P. bilden aeruginosa. P. aeruginosa und E. coli-Stämme wurden auf LB-Agar-Platten gezüchtet. <ol><li> Bereiten Sie die Durchflusszelle mit Polydimethylsiloxan (PDMS) gebunden an einDeckglas über Sauerstoffplasmabehandlung, wie in 14 beschrieben. Die Abmessungen der Strömungszellenkammer sind 23 mm × 13 mm × 0,24 mm (Länge x Breite x Tiefe). </li><li> Bereiten geändert FAB Wachstumsmedium 15. Um Biofilmwachstum unter einer Nahrungsgefälle innerhalb der Durchflusszelle zu beobachten, stellen modifizierte FAB Medium 15 mit 0,6 uM Glucose in einem Einlass und FAB Medium einzuführen ohne Kohlenstoffquelle durch die andere Einlass. Filter sterilisieren (Porengröße = 0,2 um) der Glucosestammlösung (60 mM), bevor Sie die Ware in den FAB Medium. Auch Autoklavieren den FAB-Medium mit dem Zyklus 1 (Flüssigkeit, 15 min, 121 ° C, 17 psi) vor dem Gebrauch. </li><li> Sterilisieren Sie die Durchflusssystem. Vor der Beimpfung autoklaviert den gesamten Strömungsweg (mittel Flaschen, Schläuche, Luftblasenfallen, Durchflusszellen) mit Zyklus 1, mit Ausnahme der Kunststoffdreiwegeventile (Einweg- und vorsterilisiert) stromaufwärts von der Strömungszelle angeordnet ist. (Drei-Wege Ventile zum Einspritzen Zelle c verwendet,ultur, fluoreszierender Tracer und Mikrokügelchen.) Um eine Kontamination während der Montage zu vermeiden, decken alle Schläuche und Anschlussöffnungen mit Aluminiumfolie oder Autoklav Beutel vor dem Autoklavieren. </li><li> Schließen Sie das Stromsystem. Montieren Sie die Komponenten des Durchflusszellensystem sorgfältig (siehe Video zum Flusssystem Montage) und liefern Wachstumsmedium, um die Durchflusszelle über eine peristaltische Pumpe, die exakt den Durchfluss steuert. </li><li> Vorbereitung der Zellkultur zur Beimpfung durch Übertragen einer Kolonie von P. aeruginosa oder E. coli von LB-Platten zu 3 ml LB-Brühe, und schütteln Sie die Kultur O / N bei 225 rpm und 37 ° C. Verdünne die O / N-Zellkulturen in 1 ml sterilisiertem Wasser auf eine endgültige OD 600 = 0,01 als Inokulum. (Kultur und verdünnen die Bakterien in einer Steril um Verunreinigungen zu vermeiden.) </li><li> Für die Versuche mit gemischten Spezies Biofilmen, verdünnt den zwei Bakterienkulturen mit einem Verhältnis von 1: 1 in 1 ml mit einer äquivalenten OD 600 = 0,01 für jedes Bakterium. </li><li> Impfen Sie die Durchflusszelle. Injizieren 1 ml des Inokulums zu der Strömungszelleneingang von dem Dreiwegeventil. Nach der Injektion unterbrechen den Fluss für 1 Stunde, damit der Bakterienzelle an das Deckglas zu befestigen. (Stellen Sie sicher, dass die Durchflusszelle mit der Deckseite nach unten, damit suspendierten Zellen, um auf dem Deckglas absetzen gestellt.) </li><li> Nach 1 Stunde wieder die Strömung und die Pumpe des Wachstumsmediums, um die Durchflusszelle mit einer konstanten Geschwindigkeit von 0,03 ml / min für jeden Einlaß für 3 Tage. </li></ol> 2. Charakterisierung von Biofilm-Entwicklung in Reaktion auf Nährstofffarbverläufe Mit konfokale Mikroskopie HINWEIS: P. aeruginosa mit konstitutiv exprimierten GFP abgebildet werden, aber E. coli in Mischarten Biofilme müssen durch Gegenfärbung abgebildet werden. <ol><li> Beachten Sie die 3-Tages-Biofilmen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Für die repräsentative Ergebnisse, beachten Biofilmen mit einem konfokalen Mikroskop mit 63X Ziel. Vor der Bildgebung, Markedas Doppel-Einlassströmungszelle mit einem Raster auf dem Deckglas Seite. (Der Zweck dieser Gitter ist es, dass der Experimentator die Abbildungsbereiche in dem Strömungszellenkammer zu lokalisieren.) </li><li> Zur Gegenfärbung, verdünnte 10 ul zelldurchdringenden rot fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff, wie grün fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff wie STYO 62 Stammlösung (1 mM) in 990 ul sterilisiertes Wasser und dann langsam zu injizieren die verdünnte Fleck mit einer Spritze in die Durchflusszelle Kammer von dem stromaufwärts Dreiwegeventil. Halten Sie die Durchflusszelle stagniert und im Dunkeln für 30 Minuten, dann wieder den Fluss für 15 Minuten Auswaschen der ungebundenen Fleck. </li><li> Führen konfokale Bildgebung. Aktivieren Sie die 488-nm-Argon-Laser für die Anregung und die Emission Sammelkanäle für GFP (500-535 nm) und Nukleinsäurefarbstoff (für grün fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff, 650 bis 750 nm). Passen Gewinne und Offsets für beide Kanäle zu hell und sauber Bilder haben. Wählen xyz und gleichzeitige Bildgebungsmodus. Verwenden Sie die z-Drehknopf auf idenfizieren die Unterseite und die Oberseite der Biofilm auf dem Feld. Stellen Sie die z-Schritt von 0,5 &amp; mgr; m zur Erfassung eines 3-D-Bildstapel. (Um eine hohe Bildqualität zu gewährleisten, verwenden Sie eine Linie durchschnittlich vier für die Bildaufnahme.) </li><li> Um die räumlichen Muster der Biofilmentwicklung innerhalb der Flusszelle, Bild Biofilmen an drei oder mehr Längs Karte (x) Abständen entlang der Strömungszelleneingang und an drei Querrichtung (y) positioniert relativ zu dem auferlegten Nahrungs Gradienten, wie in Figur 1 gezeigt, . </li></ol> 3. Charakterisierung Interne Stofftransport durch Injektionen von Conservative Fluoreszierende Tracer HINWEIS: Eine konservative fluoreszierender Tracer, wie Cy5, kann verwendet werden, um Stofftransportmuster innerhalb des Biofilms zu charakterisieren. <ol><li> Löse Cy5 (Mono-Reactive NHS Ester) in Wasser auf eine Endkonzentration von 10 mg / ml als Stammlösung. Bewahren Sie die Cy5-Stammlösung in einem -20 ° C Tiefkühltruhe. HINWEIS: Wie Cy5 ist licht sensitive, speichern, zu verdünnen und injizieren Cy5-Lösungen in der Dunkelheit. </li><li> Vor der Injektion des fluoreszierenden Tracers, nehmen Sie ein 3-D-Bildstapel der 3-Tages-Biofilm mit der konfokalen Mikroskopie (mit einem 63X Objektiv). (Wide Regionen Biofilm Kolonien sind ideal für Zeitreihen Beobachtungen der Farbstofftransport.) Wählen, auch die Z-Ebene mit gut getrennte Kolonien zur Bildgebung (wie in 5A gezeigt). </li><li> Für jede Injektion Cy5 Experiment verdünnen 2 ul des Cy5-Stammlösung in 998 &amp; mgr; l sterilisiertem Wasser, um eine Injektionslösung mit einem Cy5-Konzentration von 20 ug / ml zu ergeben. </li><li> Stoppen der Pumpe, um den Fluß anzuhalten, und spritzen die Cy5-Lösung in die stromaufwärts von der Durchflusszelle mit einer Spritze über das 3-Wege-Ventil. (Es ist wichtig, Luftblasen in die Strömungsbahn während der Injektion zu verhindern. Blasenfallen sollten während des Hinterspritz offen gehalten werden.) </li><li> Nach dem Einspritzen des Cy5-Lösung, schließen Sie die Blasenfallen, stellen Sie die 3-Wege-Ventil, und starten Sie diezu pumpen, um den eingespritzten Cy5-Lösung in die Durchflusszelle zu liefern. </li><li> Schalten konfokalen Abbildungsmodus zu XYT. Aktivieren Cy5 und GFP-Kanälen unter gleichzeitiger Bildmodus. Passen konfokalen Einstellungen auf Cy5 Intensität (Laserintensität, Gain und Offset), um zu vermeiden Sättigung Signale, die von entscheidender Bedeutung für die Quantifizierung. (Hohe zeitliche Auflösung zur Visualisierung Farbeindringprüfung bevorzugt. Allerdings nimmt schnelle Scan-Bildqualität.) Wählen Sie die richtige Scan-Geschwindigkeit und Rauh um die Zeitauflösung der Bildverarbeitung und der Bildqualität auszugleichen. Aus diesem Protokoll eine Linie durchschnittlich vier und eine Bildrate von 0,15 Hz. </li><li> Fortsetzen der Strömung zu Cy5 in die Durchflußzelle (noch bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,03 ml / min) zu liefern. Gleichzeitig beginnen Zeitreihen konfokale Bildgebung. </li><li> Quantifizieren Cy5 Eindringen von radial durchschnittlich Cy5 Intensität innerhalb eines 2-D-Kreisbiofilmkolonie. Zu mitteln, zuerst den Rand eines Biofilms Cluster zu identifizieren, dann ein Abstandskarte für ein 2-D-Teil des ClustersUnd schließlich durchschnittlichen radialen Muster von Cy5 Intensitäten einen Durchdringungskurve (siehe Figur 6) zu erzeugen. <ol><li> Um rechen realisieren Schritt 3.8, verwenden BioSPA (Biofilm Spatial Pattern Analysis) Software-Paket (unveröffentlicht, Softwarepaket und Hand auf Anfrage erhältlich) oder andere Bildanalyseprogramme. </li><li> Um BioSPA verwenden, zuerst ein Bild in BioSPA gesetzt importieren. Wählen Sie dann die richtige Schwelle für GFP und Cy5 Kanäle binäre Bilder zu machen. Bei der Analyse / Berechnung Menü wählen Sie Advanced Analysis und Diffusion Analyse. Verwenden Sie das GFP-Kanal an den Rand eines Clusters definieren und das Polygon-Werkzeug, um einen Cluster als Region of Interest (ROI) zu wählen. </li><li> Doppelklicken Sie auf das ausgewählte Biofilm-Cluster, um eine Diffusion Analyse durchzuführen. Speichern Sie die Diffusionsanalyseergebnisse und kalibrieren Cy5 Intensität Cy5 Konzentration anhand einer Eichkurve. <ol><li> Um Cy5 Konzentration Eichkurve zu erzeugen, messen Cy5 Intensitäten über einen Cy5 concentration Gradienten unter der konfokalen Mikroskopie. (Cy5 Intensität und Konzentration haben eine lineare Beziehung.) </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Charakterisierung der Umgebung Fluss Feld von Tracking-Fluorescent Particles HINWEIS: Fluoreszierende Teilchen, wie fluoreszierende Mikroperlen verwendet werden, um das Strömungsfeld herum Biofilmen zu charakterisieren. Strömungsfeld um Biofilme aus den Zeitreihenbeobachtungen Partikelpositionen mit Particle Tracking Velocimetry Software berechnet werden. Die hier gezeigten Ergebnisse wurden mit dem Streams 2.02 Softwarepaket 16 (Software-Download und Benutzerhandbuch finden Sie unter erhalten <a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml</a> ). <ol><li> Verdünne die fluoreszierenden Mikrokügelchen (Durchmesser ca. 1 &amp; mgr; m) in sterilisiertem Wasser auf ein Feststoffkonzentration von 0,2% und einem Endvolumen von 0,5 ml. Vortex, um sicherzustellen, dass die Mikroperlensind gut verteilt. </li><li> Einzuspritzen und den gewünschten verdünnt fluoreszierenden Mikroperlen in die Durchflußzelle folgenden Verfahren aus den Schritten 3.3 bis 3.5. Damit eine genaue Überwachung der Partikelbahn, mit einem relativ niedrigen Flussrate (0,01 ml / h für die Partikelverfolgung Ergebnisse in diesem Dokument). </li><li> Schalten konfokalen Einstellungen XYT Modus, um Partikelbewegung an einem z-Scheibe zu verfolgen und nehmen Sie Zeitreihen-Bildern. Wiederholen Partikelinjektion und Bild an verschiedenen Stellen Z (A Frame-Rate von 1 Hz wurde für die in dieser Veröffentlichung gezeigten repräsentativen Ergebnissen verwendet.), Um 3-D-Strömungsfeld zu erzeugen. </li><li> Pre-Prozess die Zeitreihen konfokale Bilder durch Subtraktion der Hintergrundfluoreszenz Signal (das Signal in der ersten aufgenommenen Bildes der Bildsatz) mit ImageJ (Software-Download und Anleitung auf <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) oder andere Programme. </li><li> In ImageJ, öffnen Sie das erste Bild einer Bildsatz und importieren Sie die Bildmenge. Unter Prozess / Bild Calculator subtrahieren Sie das erste Bild aus dem Bild Set. Speichern Sie die vorverarbeiteten Bildmenge. </li><li> Zur Berechnung der Strömungsvektoren, Import Zeitreihen konfokalen Bildern in Streams 2,02. Unter &quot;Open Prozesssicht&quot;, wählen Sie und führen Sie &quot;Identifizieren Partikel&quot;. Verwenden Sie die richtige Schwelle, um Partikel zu identifizieren. Verwenden Sie 0,5 und 5 &amp; mgr; m als Mindest- und Höchstdurchmesser Schwellenwerte für 1 &amp; mgr; m-Partikel. </li><li> Dann unter &quot;Open Prozesssicht&quot;, wählen Sie und führen Sie &quot;PTV Analyse-Pipeline&quot;, um Partikelbahnen zu generieren. Überprüfen Sie die Partikelbahnen zu sehen, ob sie Partikelbewegung darstellen. Schließlich wählen Sie und führen Sie &quot;Neues Geschwindigkeitsfeld&quot;, um einen Fluss Vektorkarte zu generieren. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Wir haben gezeigt, eine Reihe von Methoden, um drei wichtige Biofilm-Umwelt-Interaktionen zu charakterisieren: Biofilm Reaktion auf chemische Gradienten, Auswirkungen von Biofilmwachstum auf die umliegende Flussmikroumgebung und Biofilm Heterogenität von internen Transportbeschränkungen resultieren. Wir haben gezeigt, zuerst die Verwendung eines neuartigen Mikrofluid-Durchflusszelle, um eine gut definierte chemische Gradient für Biofilmentwicklung verhängen. Um eine gut definierte chemis...

Mikroorganismen auf Oberflächen befestigen und bilden Biofilme - Zellaggregate in einer extrazellulären-Polymermatrix 1 umschlossen. Biofilme ganz anders verhalten als einzelne mikrobielle Zellen, da Biofilme dramatische räumliche Heterogenität aus einer Kombination von internen Stofftransportbeschränkungen und räumlichen Veränderungen im Zellstoffwechsel 2,3 resultiert. Sauerstoff und Nährstoffkonzentration drastisch an der Grenzfläche zwischen den Biofilm und die umgebende Flüssigkeit und innerhalb der Biofilm-2 weiter abgereichert erhalten verringern. Räumliche Variationen Biofilm Atmung und Proteinsynthese kann auch als Reaktion auf die lokalisierten Sauerstoff und Nährstoffverfügbarkeit 2 auftreten. In Gewässern und Boden-Umgebungen, wohnen die meisten Bakterien in Biofilmen. Natürliche Biofilme die wichtigen biogeochemische Prozesse wie Radfahren Kohlenstoff und Stickstoff und reduzierende Metalle 4,5. Klinisch ist die Bildung von Biofilmen responsIVK längere Lungen- und Harnwegsinfektionen 6. Biofilm-assoziierten Infektionen sind sehr problematisch, weil Zellen in Biofilmen im Vergleich zu ihren Pendants Plankton 6 haben extrem hohe Resistenz gegen antimikrobielle Mittel. Da Biofilme sind in verschiedenen Einstellungen wichtig, ist ein wesentlicher Teil der Forschung auf das Verständnis der Umweltfaktoren, die Biofilm-Aktivitäten und die räumliche Heterogenität in Biofilmen und die umliegende Mikroumgebung steuern konzentriert. Frühere Studien haben festgestellt, dass Biofilmentwicklung wird stark durch eine Reihe von Umweltfaktoren reguliert: Biofilme entwickeln unterschiedliche Morphologien unter unterschiedlichen Strömungsbedingungen; Sauerstoff- und Nährstoffverfügbarkeit Einfluss Biofilm Morphologie; und hydrodynamische Schubspannung wirkt sich auf die Befestigung der planktonischen Zellen auf Oberflächen und die Ablösung von Zellen von Biofilmen 7-9. Darüber hinaus beeinflusst externen Strömungsbedingungen die Lieferung von Substraten into und in Biofilmen 10. Das Wachstum von Biofilmen verändert auch umgebenden physikalischen und chemischen Bedingungen. Beispielsweise führt das Biofilmwachstum zu lokalen Verarmung an Sauerstoff und Nährstoffen, 2; Biofilme akkumulieren anorganischen und organischen Verbindungen aus der Umgebung 11; und Biofilm Cluster umleiten Flusses und Erhöhung der Oberflächenreibung 12,13. Da Biofilme interagieren mit ihrer Umgebung auf sehr komplexe Weise, ist es entscheidend, um gleichzeitig Informationen über die Biofilmeigenschaften und Umgebungsbedingungen, und multidisziplinäre Ansätze müssen verwendet werden, um umfassend zu charakterisieren Biofilm-Umwelt-Interaktionen werden. Hier stellen wir eine Reihe von integrierten Methoden räumliche Muster in mikrobiellen Wachstums innerhalb mono-Arten und Zwei-Spezies Biofilmen unter einem auferlegten Nahrungs Gradienten zu charakterisieren, und die resultierende Änderung der lokalen chemischen und Flüssigkeitsmikroumgebung zu beobachten. Wir Tannest beschreiben die Verwendung eines kürzlich entwickelten Doppeleinlaß mikrofluidischen Flusszelle, um die Biofilmwachstum unter definierten chemischen Gradienten zu beobachten. Dann zeigen die Verwendung dieser Mikrofluid-Durchflusszelle, um das Wachstum von zwei Arten von Bakterien, Pseudomonas aeruginosa und Escherichia coli, in Biofilmen unter verschiedenen Ernährungsbedingungen beobachten. Wir zeigen, wie in situ Visualisierung von fluoreszierenden Tracers Ausbreitung in Biofilmkolonien verwendet werden, um quantitativ zu erfassen Muster der Stofftransport in Biofilmen werden. Schließlich zeigen wir, wie Mikropartikelverfolgung Geschwindigkeitsmessung unter der konfokalen Mikroskopie durchgeführt wird, kann zur lokalen Strömungsfeld um den wachsenden Biofilmen zu erhalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:89px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:89px;">Gilson</td>
			<td style="width:104px;">Miniplus 3</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow</td>
			<td style="width:89px;">Gilson</td>
			<td style="width:104px;">F117934</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock</td>
			<td style="width:89px;">Smiths Medical&#160;</td>
			<td style="width:104px;">MX9311L</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels</td>
			<td style="width:89px;">ML Solar LLC</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45</td>
			<td style="width:89px;">VWR</td>
			<td>16157-191</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">C-FLEX Tubing</td>
			<td style="width:89px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:104px;">06422-02</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">1 mL TB Syringe</td>
			<td style="width:89px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">309659</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Polymer Tubing</td>
			<td style="width:89px;">IDEX</td>
			<td style="width:104px;">1520G</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Sterile Intramedic Luer Stub Adapter</td>
			<td style="width:89px;">Clay Adams</td>
			<td style="width:104px;">427564</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:89px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">305195</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:89px;">HACH</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Syringe filters- sterile (0.2 &#956;m)</td>
			<td style="width:89px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:104px;">09-719A</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">MAXQ Shaker</td>
			<td style="width:89px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Ammonium sulfate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A4418</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">RES20908-A7</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Monobasic potassium phosphate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P5655</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">S7653</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Magnisium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">M8266</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C5670</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Calcium sulfate dihydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C3771</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">215422</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">M7634</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">451657</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">Z0251</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Cobalt(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C6768</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium molybdate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">243655</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Boric acid</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">B6768</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Dextrose</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">D9434</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Luria Bertani Broth</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">L3022</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">TCS SP2 Confocal Microscopy</td>
			<td style="width:89px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:227px;">SYTO 62</td>
			<td style="width:89px;">Life Technology</td>
			<td style="width:104px;">S11344</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:227px;">Cy5</td>
			<td style="width:89px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:104px;">PA15100</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Red Fluorescent (580/605) FluoSphere</td>
			<td style="width:89px;">Life Technology</td>
			<td style="width:104px;">F-8801</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">BioSPA</td>
			<td style="width:89px;">Packman Lab</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">ImageJ</td>
			<td style="width:89px;">NIH</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">Volocity</td>
			<td style="width:89px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Streams 2.02</td>
			<td style="width:89px;">University of Cantebury</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for characterizing the co-development of biofilm and habitat heterogeneity

Biofilme sind oberflächengebundenen mikrobiellen Gemeinschaften, die komplexe Strukturen aufweisen und signifikante räumliche Heterogenitäten. Biofilm Entwicklung wird stark von der umgebenden Strömung und Ernährungsumwelt geregelt. Biofilmwachstum steigt auch die Heterogenität der lokalen Mikroumgebung durch die Generierung komplexer Strömungsfelder und Stofftransport Mustern. Um die Entwicklung von Heterogenität in Biofilmen und Wechselwirkungen zwischen Biofilmen und ihre lokalen Mikrolebensraum zu untersuchen, wuchsen wir Mono-Arten Biofilme von Pseudomonas aeruginosa und Zwei-Spezies-Biofilmen von P. aeruginosa und Escherichia coli unter Ernährungs Gradienten in einer mikrofluidischen Flusszelle. Wir stellen ausführliche Protokolle für die Erstellung von Nährstoff Gradienten innerhalb der Flusszelle und zum Züchten und Visualisierung Biofilmentwicklung unter diesen Bedingungen. Wir weisen das Protokolle für eine Reihe von optischen Verfahren, um räumliche Muster in Biofilmstruktur Quantifizierung fließen distriträge über Biofilme und Massentransport um und in Biofilmkolonien. Diese Methoden unterstützen umfassende Untersuchungen der Co-Entwicklung von Biofilm und Habitatheterogenität.

Der Doppeleinlaß mikrofluidischen Flusszelle ermöglicht die Beobachtung von Biofilmwachstum unter einer gut definierten chemischen Gradienten durch Mischen von zwei Lösungen innerhalb der Durchflusskammer gebildet. Die sich ergebende chemische Gradienten wurde früher von Farbstoff Injektion beobachtet und detailliert charakterisiert von Song et al. 14. Glatten Konzentrationsgradienten wurden in der Querrichtung ausgebildet sind, wie in 1 gezeigt. Das Konzentrationsprofil war stei...

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Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

Methoden zur Charakterisierung des Co-Entwicklung von Biofilm und Habitat Heterogenität

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

methods-for-characterizing-co-development-biofilm-habitat

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.8K Aufrufe.  Northwestern University. Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies. 

Serie: Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To this end, our laboratory has applied the principles of nanomedicine to simplify ART regimens and as such reduce toxicities while improving compliance and drug pharmacokinetics. Simple and reliable methods for manufacturing nanoformulated ART (nanoART) are shown. Particles of pure drug are encapsulated by a thin layer of surfactant lipid coating and produced by fractionating larger drug crystals into smaller ones by either wet milling or high-pressure homogenization. In an alternative method free drug is suspended in a droplet of a polymer. Herein, drug is dissolved within a polymer then agitated by ultrasonication until individual nanosized droplets are formed. Dynamic light scattering and microscopic examination characterize the physical properties of the particles (particle size, charge and shape). Their biologic properties (cell uptake and retention, cytotoxicity and antiretroviral efficacy) are determined with human monocyte-derived macrophages (MDM). MDM are derived from human peripheral blood monocytes isolated from leukopacks using centrifugal elutriation for purification. Such blood-borne macrophages may be used as cellular transporters for nanoART distribution to human immunodeficiency virus (HIV) infected organs. We posit that the repackaging of clinically available antiretroviral medications into nanoparticles for HIV-1 treatments may improve compliance and positively affect disease outcomes.

Nanoparticles of indinavir, ritonavir, efavirenz and atazanavir were manufactured using wet milling, homogenization and ultrasonication. These nanoformulations, collectively termed nanoformulated antiretroviral therapy (nanoART), assessed macrophage-based drug delivery. Monocyte-derived macrophage nanoART uptake, retention and sustained release were determined. These preliminary studies suggest the potential of nanoART for clinical use.

Methodenentwicklung für Blood Borne Makrophagen Beförderung von Nanoformulated antiretroviralen Medikamenten

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

Forschung

Biotechnik

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) für das Hochdurchsatz-Screening-Antimykotikum

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protokoll für Biofilm Streamer Formation in einem Mikrofluidik-Gerät mit Micro-Säulen

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

Methoden zur Selbst Integration von Megamolecular Biopolymere auf der Trocknungsluft-LC-Schnittstelle

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Zellwanderung in dreidimensionales In Vitro Charakterisierung Wunde Umgebungen

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Zwei Methoden zur Decellularization von Pflanzengewebe für Tissue-Engineering-Anwendungen

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

Umfassende Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit von Plazenta-gezielte Medikamentenverabreichung mit drei komplementäre Methoden

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Elektrische und magnetische Feldgeräte zur Stimulation biologischer Gewebe

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

Formulierung und Charakterisierung von Lipid-Nanopartikeln für die Genabgabe mit einer mikrofluidischen Mischplattform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...