Diese Arbeit wurde von der Allianz NanoHealth Pre-Center Award (W81XWH-11-2-0168) und Texas Center for Cancer Nanomedizin (1U54CA151668-01) finanziert.

1. Chipfertigungstechnologie <ol><li> Erstellen der Beschichtungslösung für den Chip, indem man mit dem hydrolysierten Silikat Vorläuferlösung. Mischen 14 ml Tetraethylorthosilicat (TEOS) mit 17 ml Ethanol, 6,5 ml deionisiertes Wasser und 0,5 ml 6 M HCl unter starkem Rühren (1200 Umdrehungen pro Minute) unter Verwendung einer Heizplatte gerührt. Erhitzen dieser Lösung bei 80 ° C für 2 Stunden, Halten der Rühren konstant. </li><li> Planen Polymerlösungen mit indem die gewünschte Triblock-coploymer (Pluronic F127, L121 und P123) zu 10 ml Ethanol bei Raumtemperatur unter starkem Rühren. Führen der Mischung durch Zugabe von 7,5 ml der Silikatlösung (aus Schritt 1.1) in den Tri-Block-Copolymer-Lösung für 2 Stunden starkem Rühren bei Raumtemperatur. Dies ist der letzte Beschichtungslösung. </li><li> Es wird 1 ml der Beschichtungslösung auf ein 4 Zoll-Siliciumwafer durch Schleuderbeschichten bei einer Geschwindigkeit von 1500 UpM für 20 Sekunden. Dann wird Wärme bei 80 ° C für 12 Stunden. </li><li> Erhitzen Sie die Filme auf organische su entfernenrfactant durch Erhöhen der Temperatur 1 ° C pro Minute auf 425 ° C und dann 5 Stunden gebacken. </li><li> Vorbehandeln die mesoporösen Siliciumdioxid (MPS) Chip-Oberfläche mit Sauerstoff-Plasma-Veraschung (Plasma Asher - March Plasma Systems). (O 2 Durchfluss: 80 sccm, Leistung: 300 W, Zeit: 10 Minuten). </li><li> Optional Oberfläche chemische Modifikation: silanisiert Chips in 3% Organosilan in einer Methanol: DI-Wasser (19:1)-Lösung für 72 Stunden bei Raumtemperatur unter N 2-Handschuhfach. Spülen Sie nacheinander mit Methanol und DI-Wasser. Cure-Chips bei 110 ° C für 15 Minuten in einem Gebläse-betriebenen Ofen. </li></ol> 2. Probenvorbehandlung <ol><li> In TFA und ACN zu den Serumproben, so dass die Endkonzentration 0,01% TFA und 5% ACN sind. Vortex mischen. </li><li> Schütteln diese Proben auf einem Tisch Vortex-Schüttler bei Raumtemperatur für 30 Minuten. </li></ol> 3. Serum-Fraktionierung <ol><li> Pre-Bake-Chips über Nacht in einem Ofen bei 160 ° C Alternativ store die Chips in einem Exsikkator bis zur Verwendung um die Befeuchtung der Oberfläche durch das umgebende Wasser in der Luft zu verhindern. </li><li> Verwenden Sie Druckluft zu entstauben, dass Partikel, die auf der Oberfläche des Chips sein kann. </li><li> Schneiden Sie vorgefertigte, gekauft CultureWell chambered Deckglas, um die gewünschte Anzahl von Brunnen gehören. Sauberes Deckglas mit 100% Ethanol und dann am MPS Chipoberfläche. Drücken Sie nach unten Deckglas mit einer Pinzette, um eine vollständige Abdichtung mit Chip zu gewährleisten. </li><li> Je 10 ul Serum Probe in jedem gut 3 mm. Inkubieren für 30 Minuten in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur. </li><li> Pipette bis Serum aus Brunnen und entsorgen. Je 10 ul entionisiertem Wasser in jede Vertiefung weg zu waschen größeren Proteinen. 4 Mal wiederholen. </li><li> Je 5 ul Elutionspuffer (0,1% TFA + 50% ACN) zu jeder Probe gut. Und Abpipettieren 30-mal, während Sie die Pipettenspitze herum in den Brunnen, um den Elutionspuffer zu mischen. (Nur Anwendung Elutionspuffer auf 1-2 Proben zu einem Zeitpunkt zu verhindern Elutionspufferverdunstet so schnell). </li><li> Nach dem Mischen pipettieren alle Elutionspuffer und Ort in einem Mikrozentrifugenröhrchen erst unmittelbar vor der MALDI-TOF-Analyse durchzuführen. </li><li> Um die Komplexität einer biologischen Probe zu emulieren und um die Bereicherung Effekt bei der Ernte niedermolekulare Spezies mit unserem On-Chip-Fraktionierung System evaluieren, haben wir uns zusammengesetzt und eine Standard-Mischung von Proteinen und Peptiden zählen 26 verschiedene Arten mit einem breiten Bereich der Molekulargewichte (900 bis 66 500 Da) und PiS (4,0-10,2) und Konzentrationen (0,5-8 pmol / ul) (siehe Liste Protein in Tabelle 1). </li></ol> 4. MALDI-TOF Analyse von Peptiden <ol><li> Spot 0,5 ul Probe auf MALDI-Target Platte und trocknen lassen. </li><li> Landschaftliches 0,5 ul Matrix (α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA), 5 g / L) oder gesättigten Lösung von trans-3 ,5-dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure (SA) in 50% Acetonitril, enthaltend 0,1% TFA und erlauben, Co-Kristallisation. &lt;/ Li&gt; <li> Spot 0,5 ul Kalibrierlösung jeder Kalibrierung vor Ort und trocknen lassen. </li><li> Legen Sie die Zielscheibe in MALDI-TOF-Massenspektrometer. Die Maschine sollte zu positiven Reflektor-Modus mit einer Laserintensität von 4200 und 3000 Aufnahmen pro Probe eingestellt werden. Die ausgewählten Massenbereich sollte 800 bis 5000 Da mit einer Ziel-Masse von 2000 Da sein. </li><li> Führen Sie dieselben MALDI-TOF-Analyse im linearen Modus ändern, aber die Masse Bereich auf 900 bis 10.000 Da oder 3000 auf 70.000 Da und einem Ziel-Masse von 5000 Da. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Die Roh-Spektren wurden mit dem ConvertPeakList Software verarbeitet und die Daten exportiert wurde, um Software für die Vorverarbeitung SpecAlign. Alle Spektren wurden ausgerichtet mit dem PAFFT Korrelation Verfahren und Intensitäten wurden auf insgesamt Ionenstrom (TIC) in jedem entsprechenden Spektrum normalisiert. Alle Spektren wurden geglättet und mit Faktor 4 und 0,5 entrauschte bzw. Die Peaks wurden mit einem Ausgangswert von 0,5, Massen-Fenster von 21 und Höhe erfasstVerhältnis 1,5, wurden negative Werte vor der Analyse entfernt. </li><li> Hierarchical Clustering wurde unter Verwendung von Cluster 3.0 und visualisiert mit Mapletree Software. MALDI-MS-Daten (m / z Peakintensitäten) war log-transformiert, normalisiert, und die mediane zentriert. Pearson-Korrelation wurde verwendet, um den Abstand zwischen den Proben zu berechnen, und vollständige Bindung Clustering durchgeführt. </li><li> Eine unabhängige Student t-Test wurde zum Vergleich zwischen den Gruppen (n = 2-Gruppen) für jeden erkannten MS-Peak vor unüberwachten hierarchischen Cluster-Analyse verwendet. Ein P-Wert von 0,02 oder niedriger wurde als signifikant differentiell geerntet Peptiden und Proteinen unter den verschiedenen mesoporösen Proteom-Chips (Große Poren verglichen mit kleinen Poren) zu wählen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Wie in 1 gezeigt, in dieser Studie haben wir eine Reihe von mesoporösen Siliciumdioxid-Dünnschichten mit einer Vielzahl von nanotextures hergestellt und umfassend untersucht dieir Verwendung bei der selektiven Aufnahme und Anreicherung LMW Peptide und Proteine ​​aus menschlichem Serum. 2a und b zeigen die MS-Spektren des unbearbeiteten Serumprobe für Peptide im Bereich von 900 bis 10.000 Da und für Proteine ​​im Bereich von 3.000 ~ 70.000 Da jeweils . Diese Spektren veranschaulichen die Signalunterdrückung in der LMW Bereich aufgrund der Gegenwart von gut ionisiert, zahlreicheren mit hohem Molekulargewicht (HMW) Proteine, wie Albumin. 2c und d zeigen die MS-Spektren der Serumprobe nach Fraktionierung durch das MPS-L121 (Porengröße, 6 nm). Die meisten der großen Moleküle aufgebraucht wurde, was zu einer signifikanten Anreicherung der LMW-Komponenten. Als Kontrolle wurde die gleiche Serumprobe auf einem unporösen reinem Siliciumdioxid aufgetragen um die Spezifität der MPS Dünnschichten für LMWP Verwertung zu bewerten. Wie in 2e und f ersichtlich ist, gab es keinen signifikanten Gewinnung von PeptidenGezeiten oder Proteinen aus der nicht porösen Siliziumdioxid. So kann der Schluss gezogen, dass es die mesoporösen Architektur und nicht die Silica-Oberfläche, die die Affinität überwiegen Faktor stellt in der Anreicherung von LMWP war. Genau kontrollierte Variationen in der Porengröße kann durch die Verwendung von Copolymeren mit unterschiedlichen hydrophoben Block gewährleistet werden konnte. Durch die Verwendung der Proteine ​​und Peptide ausgebildet Mischung wurde die Wirkung der Porengröße auf der LMW-Peptid und Proteingewinnung Wirksamkeit untersucht unter Verwendung MPS dünnen Filmen aus vier Pluronic-Tenside (F127, P123, L121, L121 und zzgl. Quellmittel) mit unterschiedlichen Volumenverhältnissen hergestellt der hydrophilen und hydrophoben Komponenten Porengrößen von 3,7 nm, 5,2 nm, 7,4 nm und 9,0 nm bzw. bilden. Dieser Bereich von Porengrößen führte zur Gewinnung von einer anderen Repertoire von Peptiden und Proteinen aus der gleichen Serumprobe über Größe und Form Ausschluss (Abbildung 3). Das Protein-Spektren bei hohem Molekulargewicht demonstrate die molekularen Cut-off von jeder Art von Chip. Zusätzlich zu den größenabhängigen Erschöpfung der HMW-Proteine, zeigt der On-Chip-Fraktionierung des Standards Lösung eine Differenzial und selektiven Anreicherung von LMW Spezies mit den Porengrößen zugeordnet. Die Zwei-Wege-hierarchisches Clustering in Abbildung 3b, zeigt die LMW-Standards Bereicherung Muster mit den verschiedenen MSC erhalten. Selbst wenn alle Peptide unterhalb der molekularen Cut-off der Chips sind, gibt es eine positive Korrelation zwischen der Porengrößen und das Molekulargewicht der eingefangenen Spezies. Die MSC mit großen Poren, bis zu 9 nm, vorzugsweise ernten größere Peptide, während kleinere Peptide effizienter von den Chips mit kleineren Poren gewonnen werden. Die strukturelle Umwandlung des mesoporösen Anordnung wurde durch das Einstellen der Konzentration des Matrix-Polymer durchgeführt. Eine Erhöhung der Konzentration des Matrix-Polymer zu einer verringerten Grenzflächenkrümmung zwischen den Phasendes Wassers, des Copolymers und des Silicats, damit die Einleitung des miteinander Übergang von einer sphärischen, um eine zylindrische Struktur. Pluronic F127, mit hohem Molekulargewicht, besitzt diese hohe strukturelle Periodizität. Durch Erhöhung der Konzentration von F127 in Ausgangslösung, können verschiedene MPS Dünnfilm periodischen Nanostrukturen aus 3D Nanostruktur 2D Nanostruktur erhalten werden. Die 3D-kubischen und hexagonalen Waben-Nanostrukturen, die über mehr wünschenswert Nanopore Interkonnektivität und leichter zugänglich Nanopore Morphologie, weisen eine überlegene Leistung in selektiven Anreicherung von LMW-Peptide als die 2D-hexagonalen Struktur, auch wenn sie ähnlich Porengrößenverteilungen und den gleichen molekularen Cut-off für Serum teilen Fraktionierung (Abbildung 4). Wir hat außerdem die Konjugation von Organo-Silan auf MPS-Chips durch Einleiten von Sauerstoff Plasmaveraschen, um den Chip Oberfläche vorzubehandeln. Um qualitativ studieren die elektrostatische Wirkung auf ausgewähltenIVE-on-Chip-Anreicherung, nutzen wir die Mischung von Proteinen und Peptiden. MS-Analyse des Proteom-Standards Lösung fraktioniert MPS-Chips mit L121 hergestellt und konjugiert mit der chemischen funktionellen Gruppen ist in 5 dargestellt. Die positiv geladenen und negativ geladenen die Peptide und LMW Proteine ​​wurden auf der anionischen und kationischen Chips erfasst sind. Der quantitative Vergleich von mehreren MPS-Chips bei der Wiederherstellung der Peptide mit positiver Nettoladung ist in Abbildung 5a dargestellt. Die Chips mit negativer Ladung und die Chips ohne Modifikation (mit einer leichten negativen Ladung ursprünglich) eine deutlich höhere Anreicherung für diese Peptide als die Chips mit APTES (-NH 2) modifiziert. Umgekehrt besitzen die positiv geladenen MPS-Chips außergewöhnliche Fähigkeit, diese Peptide mit negativer Nettoladung zu erholen, wie in 5b gezeigt. Während α-Endorphin zeigt keine signifikante Änderung due ihre PI etwa 6. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig1.jpg" /> Abbildung 1. Prinzip der MPS-Chips Fraktionierung und LMW Bereicherung. Nach Probenauftragsspitze auf der Oberfläche, sind LMW Proteinen und Peptiden in die Poren eingeschlossen, während die größeren Arten blieben außerhalb der Poren und werden während der Waschschritte entfernt. Die angereicherten Fraktionen werden dann eluiert und durch MALDI. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig2.jpg" /> Abbildung 2. Peptid-Anreicherung mit Hilfe der mesoporösen Siliciumdioxid-Dünnfilm-Chips. MALDI-MS-Profile sowohl die geringe Masse (900 bis 10 000 Da) und der hohen Masse Bereich (3000 bis 70 000 Da) vor (a, b) und nach (c, d) Serum-Verarbeitung auf der mesoporösen Siliciumdioxid-Schichten ( L121, 6 nm). Die molekulare Erholung wird deutlich reduziert, wenn Sie leere porösen Silica-Oberflächen (e, f). <img alt="Abbildung 3" src=&quot;/ Files/ftp_upload/3876/3876fig3.jpg&quot; /&gt; Abbildung 3. Molekulare Cut-off-und größenabhängige Bereicherung des MPS-Chips. (A) Vergrößerte Ansicht des MALDI-Spektren zeigen die charakteristischen molekularen Cut-off von je MPS-Chips in Korrelation zu der Porengröße. (B) Zwei-Wege-hierarchisches Clustern der Peptidgemisch Funktionen zwischen den verschiedenen Chips. Die Intensität der roten oder gelben Farbe zeigt die relative Peptidkonzentration. Größere Poren erhöht die Ernte von größeren Peptiden (3600 bis 8500 Da), während die kleinen Peptiden (900 bis 3500 Da) wurden vorzugsweise von den Chips mit kleineren Poren gewonnen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig4.jpg" /> Abbildung 4. Physikalische Charakterisierung von dünnen Filmen und MPS selektive Gewinnung mit verschiedenen Nanostrukturen. XRD-Muster (a, b, c), TEM (Einschub a, b, c), Pluronic F127 bei verschiedenen Konzentrationen in der Vorläuferlösung: 4,0 ×10 -3 M (a), 6,0 × 10 -3 M (b) und 8,0 × 10 -2 M (c). (D) Balkenanzeige für die Intensität der Erkennung, welche die selektive Peptide Erholung auf 3D kubischen und hexagonalen 3D-F127 Proteom-Chips (Cub und Hex, jeweils). Die unterschiedlichen strukturellen Modifikationen stellen eine selektive Anreicherung. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig5_lg.jpg"><img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig5.jpg" /></a> Abbildung 5. Charge-spezifische Erholung für die Chips mit unterschiedlichen Oberflächen-Funktionen. Balkendiagramm der MS Intensität Nachweis von selektiv erfasst Peptide auf den funktionalisierten Chips. Nach ihren isoelektrischen Punkt sind die Peptide positiv oder negativ bei pH 7,0 berechnet. (A) Positive Peptide ((1) des-Arg1-Bradykinin, (2) Bradykinin, (3) Substanz P-amid, (4) Neurotensin, (5) ACTH (1-17), (6) ACTH (7 - 38)) sind speziell auf dem negativ geladenen sur angereichertGesichter. (B) Negativ Peptide ((7) Glu1-Fibrinopeptid B, (8) α-Endorphin, (9) ACTH (18-39), (10) Insulin, (11) EGF (12) Insulin-like FGII) sind speziell auf den positiv geladenen Oberflächen angereichert. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig6_lg.jpg"><img alt="6" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig6.jpg" /></a> Abbildung 6. On-Chip Stabilisierung der fraktionierten Serum. (A) Repräsentative MALDI Profile von LMW-Peptide und Proteine ​​eluiert unmittelbar nach der Serum-Fraktionierung (oben) oder nach 3 wk von On-Chip-Lagerung bei Raumtemperatur (unten). (B) Von oben nach unten: lineare Regressionsanalyse der mittleren Intensitäten der detektierten MS-Peaks in jeder Wiederholung im Vergleich zu 1 für frisch fraktionierten Serum und fraktionierte Serum nach 3WK MPS-Chips Lagerung bei Raumtemperatur zu replizieren. Die Gleichung, Lebenslauf und Bestimmtheitsmaß (R 2) sind angegeben.

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	<li>Wulfkuhle, J. D., Liotta, L. A., Petricoin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+applications+for+the+early+detection+of+cancer.">Proteomic applications for the early detection of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 267-275 (2003).</li><li>Etzioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+case+for+early+detection.">The case for early detection.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 243-252 (2003).</li><li>Hanash, S. M., Pitteri, S. J., Faca, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plasma+proteome+for+cancer+biomarkers.">Mining the plasma proteome for cancer biomarkers.</a> Nature. 452, 571-579 (2008).</li><li>Liotta, L. A., Ferrari, M., Petricoin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+proteomics:+written+in+blood.">Clinical proteomics: written in blood.</a> Nature. 425, 905-905 (2003).</li><li>Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood+peptidome:+a+higher+dimension+of+information+content+for+cancer+biomarker+discovery.">The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 961-967 (2006).</li><li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+plasma+proteome:+history,+character,+and+diagnostic+prospects.">The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell Proteomics. 1, 845-867 (2002).</li><li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics.">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).</li><li>Liu, H., Sadygov, R. G., Yates, J. R., 3rd, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+random+sampling+and+estimation+of+relative+protein+abundance+in+shotgun+proteomics.">A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics.</a> Anal. Chem. 76, 4193-4201 (2004).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+gel+electrophoresis+in+proteomics:+old,+old+fashioned,+but+it+still+climbs+up+the+mountains.">Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains.</a> Proteomics. 2, 3-10 (2002).</li><li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+of+the+nanotexture+of+mesoporous+silica+films+and+their+functionalized+derivatives+for+selectively+harvesting+low+molecular+weight+protein.">Tailoring of the nanotexture of mesoporous silica films and their functionalized derivatives for selectively harvesting low molecular weight protein.</a> ACS Nano. 4, 439-451 (2010).</li><li>Bouamrani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoporous+silica+chips+for+selective+enrichment+and+stabilization+of+low+molecular+weight+proteome.">Mesoporous silica chips for selective enrichment and stabilization of low molecular weight proteome.</a> Proteomics. 10, 496-505 (2010).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Beweise mehren sich, dass die niedermolekularen Bereich des Kreislaufsystems Proteom eine reiche Quelle von diagnostischen Biomarkern für die Früherkennung von Krankheiten ist. Bei dieser Technologie stellten wir eine Reihe von mesoporösen Siliciumdioxid-Chips mit unterschiedlichen Porengrößen, Porenstrukturen und Modifikationen an Peptiden und selektiv zu bereichern Proteine ​​mit niedrigem Molekulargewicht. Um die Stabilität von Proteinen zu untersuchen, wurden die MPS-Chips mit humanem Serum, nach dem Waschen getrocknet inkubiert und gelagert 3WK bei Raumtemperatur. Die Protein / Peptid-Muster erhalten wurden, waren vergleichbar mit denen von frisch fraktioniert Serum (6a), wie durch die Ergebnisse der statistischen Analyse zeigte in 6b bestätigt. Die Variabilität der Peak-Signale durch die durchschnittliche CV gemessen wurde bei 12,7% für Rohserum und bei 14,2% für den fraktionierten Proben geschätzt. Die Rn Variationen könnten darauf zurückzuführen sein, interne Variabilität des MALDI Instrument und schlug vor, dass die on-Chip-Vorbehandlung und Lagerung induziert keine signifikante Veränderung der MS Proteinprofile. Das gleiche Experiment wurde auf nicht porösem Silizium durchgeführt. Das getrocknete Serum nach der Lagerung auf Silizium-Oberfläche wiederhergestellt wurde fraktioniert auf den MPS-Chips vor MALDI-Analyse. Der arme MS Profils erhalten die Stabilisierung Vorteil der mesoporösen Oberfläche demonstriert. In Analogie mit zuvor postulierten Mechanismen, stellen wir die Hypothese, dass die LMW-Spezies in den Nanoporen gefangen vor dem Abbau wurden durch den Ausschluss von Proteasen Größe erhalten, oder durch sterische Hemmung ihrer proteolytischen Aktivität in dem engen Raum der Nanoporen. Die MPS-Chip basierende Methode könnte ein mächtiges Werkzeug in der Peptid-und LMW-Protein-Profiling von komplexen biologischen Flüssigkeiten Studie sein. Die MPS-Chips sind kostengünstig herzustellen und skaliert die Produktion ermöglichen die gleichzeitige Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben zu erreichen, bietet vorteilhafte Merkmale für die Versuchsfischerei Screening und BioMarker Entdeckung.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Tetraethoxysilan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 131903 </td><td> 98% </td></tr><tr><td> Spin Coater </td><td> Brewer Science </td><td> Cee 200X </td><td></td></tr><tr><td> Plasma Asher </td><td> Nordson März </td><td> AP-600 </td><td></td></tr><tr><td> Spektralellipsometer </td><td> JA Woollam Co. </td><td> M-2000DI </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td> Applied Biosystems </td><td> Voyager-DE-STR </td><td></td></tr><tr><td> α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure </td><td> Sigma-Aldrich Co. </td><td> C8982 </td><td> Matrix für die MALDI-TOF </td></tr><tr><td> trans-3 ,5-dimethoxy-4-hydroxyZimtsäure </td><td> Sigma-Aldrich Co. </td><td> 85429 </td><td> Matrix für die MALDI-TOF </td></tr><tr><td> Rühren Sie heißen Platte </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11 bis 475-30Q </td><td></td></tr><tr><td> CultureWell chambered Deckglas </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> GBL103350 </td><td> 3 mm Durchmesser. × 1 mm Tiefe, 3-10 ul, steril </td></tr><tr><td> Pluronic F 127 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO-PPO-106-70-PEO 106 </td></tr><tr><td> Pluronic L121 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 5-PPO-PEO-70 5 </td></tr><tr><td> Pluronic P123 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 20 PPO 20 PEO 70 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Physikalisch-chemische Eigenschaften und konzipiert Konzentrationen (Molekulargewicht und Iso-Elektrischen Punkt) der ausgewählten Peptid und Protein-Standards.

low molecular weight protein enrichment on mesoporous silica thin films for biomarker discovery

Die Identifizierung von zirkulierenden Biomarkern ein großes Potenzial für die nicht invasive Ansätze bei der frühen Diagnose und Prognose sowie zur Überwachung der therapeutischen Wirksamkeit. 1-3 Das zirkulierende niedrigem Molekulargewicht Proteoms (LMWP) von kleinen Proteinen, die aus Geweben und Zellen abgestoßen oder zusammengesetzt Peptidfragmente aus dem proteolytischen Abbau von größeren Proteinen abgeleitet sind, mit den pathologischen Zustand bei Patienten in Verbindung gebracht worden und wahrscheinlich auf den Zustand der Krankheit. 4,5 Trotz dieser mögliche klinische Anwendungen, die Verwendung von Massenspektrometrie (MS) ein Profil des LMWP aus biologischen Flüssigkeiten hat sich als sehr schwierig aufgrund der großen dynamischen Bereich von Protein-und Peptid-Konzentrationen im Serum. 6 Ohne Probe vor der Behandlung, zu verschleiern einige der höchst vorkommenden Proteine ​​die Erkennung von Low-Fülle Spezies im Serum / Plasma. Übliche Proteom-Ansätze, wie zweidimensionale Polyacrylamid-Gel-electrophoresis (2D-PAGE) und Schrotflinte Proteomik Methoden sind arbeitsintensiv, geringer Durchsatz und bieten nur bedingt geeignet für klinische Anwendungen. 9.7 Daher ist eine wirksamere Strategie erforderlich, um LMWP aus Blut zu isolieren und ermöglichen die Hochdurchsatz-Screening von klinischen Proben . Hier präsentieren wir eine schnelle, effiziente und zuverlässige Multi-System-Fraktionierung auf mesoporösen Siliciumdioxid-Chips basieren, um gezielt und bereichern LMWP. 10,11 mesoporösen Silica (MPS) dünne Filme mit einstellbaren Eigenschaften im Nanobereich hergestellt wurden unter Verwendung des Triblockcopolymer Vorlage Weg . Mit Hilfe verschiedener Vorlagen Polymer-und Polymer-Konzentrationen in der Vorläufer-Lösung wurden verschiedene Porengrößenverteilungen, Porenstrukturen, Konnektivität und Oberflächeneigenschaften bestimmt und bewarb sich um selektive Gewinnung von Proteinen mit geringer Masse. Die selektive Analyse der angereicherten Peptide in verschiedenen Unterklassen nach ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften wird deverknüpft, wird die Wirksamkeit der Gewinnung und Nachweis von geringer Menge Arten. In Kombination mit der Massenspektrometrie und statistische Analyse haben wir gezeigt, die Korrelation zwischen den Nanophasen Eigenschaften der mesoporösen Siliciumdioxid-Dünnschichten und der Spezifität und Wirksamkeit von geringer Masse Proteom Ernte. Die hier vorgelegten Ergebnisse zeigen das Potenzial der Nanotechnologie-basierten Technologie, um eine leistungsstarke Alternative zu herkömmlichen Verfahren zur Ernte von LMWP komplexen biologischen Flüssigkeiten bieten. Aufgrund der Fähigkeit, um die Materialeigenschaften zu stimmen, die Fähigkeit zur Low-Cost-Produktion, die Einfachheit und Schnelligkeit der Probenentnahme sowie den stark reduzierten Anforderungen an die Stichprobe für die Analyse, wird dieses neuartige Nanotechnologie wesentlich Einfluss auf das Gebiet der Proteom-Forschung und klinische Biomarker proteomische Beurteilung.

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Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Wir haben eine Technologie auf mesoporösen Siliciumdioxid-Dünnschicht zur selektiven Rückgewinnung von niedermolekularen Proteinen und Peptiden aus Humanserum. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften unserer mesoporösen Chips wurden fein abgestimmt, um wesentliche Bereicherung in der Peptid-Kontrolle stellen und damit das Profil Serumproteom für diagnostische Zwecke.

Niedermolekulare Protein Enrichment auf mesoporösem Siliciumdioxid Dünnschichten für Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.4K Aufrufe.  The Methodist Hospital Research Institute. Wir haben eine Technologie auf mesoporösen Siliciumdioxid-Dünnschicht zur selektiven Rückgewinnung von niedermolekularen Proteinen und Peptiden aus Humanserum. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften unserer mesoporösen Chips wurden fein abgestimmt, um wesentliche Bereicherung in der Peptid-Kontrolle stellen und damit das Profil Serumproteom für diagnostische Zwecke.

Serie: Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

Entwickeln von benutzerdefinierten Chinesischen Hamsters-Wirtszellprotein Assays mit Akustikvlies Mikropartikeltechnologie

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Forschung

Biotechnik

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Bühne Fabrication für Correlated Light / Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Synthesis, Assembly und Charakterisierung von Monolayer Protected Gold-Nanopartikeln Films für die Protein-Monoschicht Elektrochemie

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optische Detektion von<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterien durch Mesoporous Silicon Biosensoren

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer several advantages over traditional microsphere fabrication techniques. Contrary to emulsion, suspension, and dispersion techniques, microgels formed by precipitation are of uniform shape and size, i.e.&#160;low polydispersity index, without the use of organic solvents or stabilizers. The mild conditions of the precipitation reaction, customizable properties of the microgels, and low viscosity for injections make them applicable for in vivo purposes. Unlike other fabrication techniques, microgel characteristics can be modified by changing the starting polymer molecular weight. Increasing the starting PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Further modifications are suggested such as encapsulating molecules during microgel crosslinking. Simple adaptations to the PEG microgel building blocks are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Increasing the PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Simple adaptations to the PEG microgel precipitation reaction are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

Merkmale der Niederschlag gebildet Polyethylene Glycol-Mikrogele durch Molekulargewicht der Reaktanden Controlled

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Hydrogel-Nanopartikel Ernte von Plasma oder Urin zum Nachweis geringer Menge Proteine

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine ​​aus<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Zum Haut Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Mikrofluidischen Genipin Abscheidetechnik für Extended Kultur von mikrostrukturierten Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...