This work is supported in part by NIH-P41 P41-RRO3155 and NIH P50-GM076516 (grant to EG), and Fondazione Monte dei Paschi di Siena (grant to FB).

1. Systemkalibrierung <ol><li> Point Spread Function (PSF) Kalibrierung <ol><li> Verdünne 10 ul 30 nm Fluoreszenz Wulst Lösung (etwa 5 um) in 90 ul destilliertem Wasser und dann beschallt die Lösung für 20 min. Schneiden Sie ein Quadrat (1 cm x 1 cm) Stück Agarose-Gel (3%) und beträgt 10 ul der Lösung auf die Oberseite des Gels. Drehen Sie das Stück Gel auf der unteren Glas einer 2 cm Petrischale und drücken Sie die Tropfen auf dem Glas. </li><li> Schalten Sie den Erwerb Setup, legen Sie die Probe in den Halter, stellen Sie die Kamera Belichtung und EMgain (100 ms und 1000 sind gute Parameter, sondern optimieren nach dem System) und warten Sie die Kamera abkühlen. </li><li> Stellen Sie die Kamera Belichtung bis 100 ms, Kamera EMgain bis 1000, Erfassungsmodus zu übertragen, Wiederholung und 100 Auto-Save-Einstellung Rahmen. </li><li> Mit Hilfe des Okulars und Durchlicht Fokus auf der Grenze des Gels und bewegen Sie dann das Ziel in der Mitte des Gels, stellen Sie den Fokus und start der Laserausrichtung Verfahren (LAS AF, wählen Sie &quot;TIRF-Setup&quot; und folgen Sie den Ausrichtungsvorgang auto). </li><li> Finden Sie ein Sichtfeld mit isolierten einzelnen Spots, genau konzentrieren sich auf die helleren Fleck (die in der Regel stellt Perlen Aggregat) als Referenz, zu erwerben 100 Bilder und wiederholen Sie den Schritt 5-6 mal um mehrere einzelne Spots zu erwerben. </li><li> Importieren Sie die erworbenen Serie mit einem Datenverarbeitungsprogramm und im Durchschnitt den Stapel in der Zeit (Abbildung 1A) und wählen Sie einen einzelnen isolierten Perle. Achten Sie darauf, um die Kleinsten zu wählen Partikelaggregate zu vermeiden. </li><li> Die gewählten Intensitätsverteilung (ein Beispiel für Einzelperlen Profil ist in 1B vorgelegt) mit einer Gauß-Funktion mit dem Befehl &quot;gaussfit&quot; (in den ICS-Matlab-Tools in den Materialien in Matlab). Überprüfen Sie, ob die Güte der Anpassung durch Einsicht in die erhaltenen Reste (ein Beispiel für Einbau Gauß-Profil mit den entsprechenden Residuen vorgestellt in Abbildung 1B). </li></ol></li><li> Kamerakalibrierung <ol><li> Schalten Sie die Kamera, und warten Sie die Kamera abkühlen. Stellen Sie die Kamera Erwerb Einstellung, (dh für die verwendete Kamera setzen wir die Exposition gegenüber 0,5 ms, Kamera EMgain bis 1000, Erfassungsmodus zu Gestellte Modus, der ROI Größe 32 x 128, 10.000 Wiederholungen) und starten Sie die Übernahme von der Kamera Hintergrund Signal. </li><li> Import erworben Rahmen Serie mit einem Datenverarbeitungsprogramm. Berechnen und überprüfen Sie die durchschnittliche Intensität in jedem Pixel, um zu überprüfen, dass die Kamera Hintergrund ist ungefähr Wohnung in der ausgewählten Region des Chips. In Freigestellte Modus, entfernen Sie den ersten und den letzten horizontalen Linien (3 bis 10, je nach der Größe der ROI) für jeden Rahmen, weil die Kamera Hintergrund wird in der Regel in den Grenzlinien vorgespannt ist. </li><li> Erstellen Sie ein Histogramm der Werte (auch definiert digitale Ebene, DL) in aufgenommenen Bildern Stack (mit dem Befehl &quot;hist&quot; in Matlab) und plotten den Logarithmusder resultierende Frequenz (unter Verwendung semilogy Befehl in Matlab). Ein Beispiel für DL Verteilung Kamera Hintergrund ist in Figur 2 dargestellt. HINWEIS: Wenn die Kamera gut funktioniert, wird das Grundstück eine etwa Gauß-Peak (ein Parabelprofil in Log-Skala), die die Verteilung der Werte auf Null Photon, gefolgt von einem exponentiellen Abfall (eine Linie mit negativer Steigung in Log-Skala zugeordnet zeigen ), die die Verteilung der Werte 1 Photon (Figur 2) zugeordnet sind, stellen. Insbesondere das Zentrum und die Varianz der Gaußschen Funktion zeigen die Kamera-Offset-Fehler und jeweils während der Zerfallskonstante des exponentiellen Teil stellt eine Schätzung des DL von der Kamera auf jedes einzelne Photon zugeordnet. In Matlab verwenden Sie den Abschnitt &quot;CalibrateCamera&quot; der Script in Hilfsmaterialien. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang für alle ausgewählten Kamera EMGain und Verstärkung. </li></ol></li></ol> 2. beschriftetZellpräparation <ol><li> Um die für die Lipid-Einbau 36 erforderlich Liposomen Man löst getrennt 1 mg DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin), 1 mg DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propan), und 1 mg PPE-ATTO488 in 1 ml Chloroform. Mischen Sie 0,5 ml DOPE-Lösung, 0,5 ml DOTAP-Lösung und 25 ul PPE-ATTO488 Lösung und trocken unter Vakuum für 24 Stunden. 0,5 ml HEPES-Puffer, 20 mM, Vortex für 15 min mit Ultraschall 15 Minuten bei 40 ° C aufweist. </li><li> Um die Zelle zu bereiten, waschen Sie 3-mal mit PBS eine p100 Gericht konfluenter CHO-K1 (Chinese Hamster Ovar), 1 ml Trypsin und speichern in Inkubator für 5 min. Aussetzen abgelösten Zellen die Zugabe von 9 ml DMEM / F12-Medium mit 10% FBS und Saatgut 150 ul Zell-Lösung in eine Petrischale mit 800 ul des gleichen Mediums. </li><li> Lager im Brutschrank 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2. Für die Lipid-Gründung, ersetzen Zellmedium mit 500ul serumfreiem Medium; nach 30 min, fügen 2 ul Liposomen-Lösung; nach 15 min mit Wasch PSB und neue DMEM / F12-Medium für die Bildgebung. </li><li> Für die Transfektion Transfektion Zellen nach Lipofectamin-Protokoll (Hersteller Anleitung) mit TfR-GFP-Plasmid und Speicher 24 h im Inkubator vor Bildgebung. </li></ol> 3. Datenerfassung <ol><li> Setup Vorbereitung <ol><li> Um das Mikroskop Thermostat 24 Stunden vor dem Experiment Einschalten des Inkubators. </li><li> Um die schnellsten erreichbaren Erfassungszeit gelten, die Arbeit in Freigestellte Sensor-Modus (siehe Einleitung) und verwenden Sie eine erste Kamera für die Bildgebung (Kamera 1) und zweiten Kamera, um die Zelle (Kamera 2) zu wählen. Ein Schema des Setup-Konfiguration ist in Abbildung S1 Ergänzende vorgestellt. Dann, um die zwei Kameras wiederum auf dem Mikroskop ausrichten und warten, bis die Kameras um sich abzukühlen. </li><li> Auf beiden Kameras die Parameter für Durchlicht-Bildgebung (dh </em&gt; 20 ms für Belichtungszeit, 1 für EM Gain) und legte das Mikroskop im Hellfeld-Modus. </li><li> Setzen Sie die Proben in der Halterung und konzentrieren sich mit Okular, senden Sie das Licht auf Kamera 1 und schieben Sie die Schlitze so dass das Licht nur auf der ROI für Cell Imaging (hier ein 32 x 32 Pixel ROI) verwendet. </li><li> Bewegen Sie eine Zelle in der ausgewählten Region und senden Sie das Licht an der Kamera 2 ist, dann ziehen Sie eine ROI in der Software, Kamera 2, um eine Referenz zu haben steuern. </li></ol></li><li> Abbildungs ​​(3A) <ol><li> Zunächst richten Sie den Laser TIRF nach dem Verfahren von Ihrem Setup. In unserem Setup, wählen Sie die &quot;TIRF-Setup&quot; und starten Sie die automatische Ausrichtungsverfahren. Wenn der Laser ausgerichtet Satz 70 nm Eindringtiefe (ca. 70 °). </li><li> Stellen Sie die Belichtungszeit auf 70 ms und 100 EMGain sowohl auf Kamera 1 und Kamera 2; Dann wählen Sie eine Zelle mit Kamera 1, dann schicken Sie das Licht auf Kamera 2 und genau fokussieren die Zellmembran. Stellen Sie die minimale Exposition auf camera 2, 1000 EMGain, Bolero Sensor-Modus, 10 5 Wiederholungen und stellen Autosave als FITS-Dateien (Flexible Image Transport System, ein Format, das leicht sein können verwaltet werden). </li><li> Starten Sie die Aufnahme, die Bildserien aufnehmen. Lassen Sie die Verstärkung und das zugeschnittene Mode auf Temperaturstabilisierung für den Erwerb eines neuen Zelle zu ermöglichen, dann wiederholen Sie die letzten beiden Schritte, um 8-10 Zellen zu erwerben. </li></ol></li></ol> 4. Berechnung der mittleren quadratischen Verlagerung von Imaging (i MSD) HINWEIS: Das folgende Protokoll kann direkt an Rohdaten angewendet werden. Zur gleichen Zeit ist die ganze Protokoll für Datenübernahmen simuliert sowohl in Matlab und in SimFCS. Der Link zu den entsprechenden Anleitungen finden Sie in der Rubrik &quot;Materialien&quot; gefunden werden. <ol><li> Berechnung von Matlab <ol><li> Importieren Sie die erworbenen Serie in Matlab mit ImportImageSeries Skript. Berechnen der durchschnittlichen Intensität von jedem Bild mit der Zeit zusammenmmand auf den ersten 2 Dimensionen bedeuten und benutzen Grundstück, um den resultierenden Vektor zu sehen. </li><li> Wenn mehr als 10% der Photobleaching vorhanden ist, entsorgen Sie die Serie oder entfernen Sie den ersten Teil von ihnen. Wenn sie niedriger ist, versuchen, die Auswirkungen auf die Korrelationsfunktion durch Subtraktion für jedes Bild seine mittlere Intensität zu korrigieren, wie früher 37 gezeigt. </li><li> Berechnen der durchschnittlichen Intensität von jedem Pixel unter Verwendung Schnitts auf die dritte Dimension und sehen sich ergebende Bild. HINWEIS: Besondere Aufmerksamkeit ist erforderlich, um Artefakt Korrelationen zu vermeiden. In der Tat, wie zuvor für ähnliche Techniken 38, Zellgrenzen sowie unscharf Vesikel konnte gezeigt werden, eine starke Korrelation vor. Wenn die Kontrolle des Durchschnitts Bild deckt Zellgrenzen oder unscharf Vesikel, versuchen, die Region beteiligt ansonsten verwerfen die Übernahme auszuschließen. Um die Wirkung dieser unbeweglichen Strukturen korrigieren subtrahieren den durchschnittlichen zeitlichen Intensität von jedem Pixel 39. </li><li> Berechnen Sie ter räumlich-zeitliche Korrelation (G (ξ, χ, τ)) mit der Funktion CalculateSTICScorrfunc. Entfernen G (ξ, χ, 0), da die Korrelation aufgrund der Schrotrauschen bei schlechten Licht Regime dominiert G (0,0,0); die Korrelation durch den Detektor dominiert G (± 1,0,0) und Partikelbewegung während der Belichtungszeit kann G (ξ, χ, τ) für τ = 0 zu verformen, indem die gemessenen Taillen (dieser Effekt verschwindet τ &gt; 0) 34. </li><li> Durchschnittliche G (ξ, χ, τ&gt; 0) unter Verwendung einer logarithmischen Zeit-Bin, um das Rauschen mittels der Funktion &quot;LogBinStack&quot; in Hintergrundmaterial zu reduzieren und dann passen die resultierende G (ξ, χ, τ) mit der Funktion &quot;gaussfit&quot; von die ICS-Matlab-Tools in den Materialien, die ich MSD (in der zweiten Spalte der resultierenden Array) erholen. </li><li> Plotten der erhaltenen Taille σ (τ) 2 (i MSD) als Funktion der Zeit. Wenn die Daten zu laut, zu versuchen, die Anzahl der acqu erhöhenired Rahmen, erhöhen die Laserleistung, durchschnittlich mehr G (ξ, χ, τ) zusammen. </li></ol></li><li> Berechnung durch SimFCS <ol><li> Öffnen Sie die erworbenen Dateien mit ImageJ mit BioFormat Importeur Plugin und sparen erworben Serie als Tiff-Sequenz. </li><li> Öffnen SimFCS und wählen RICS-Tool und wählen Sie Datei&gt; Importieren mehrerer Bilder (Ergänzende Abbildung S2). </li><li> Wählen Fit, legen Sie die richtigen Aufnahmeparameter und schließen Sie das Fenster passen (Ergänzende Abbildung S3). </li><li> Wählen Sie Anzeige&gt; durchschnittliche Intensität&gt; CH1 und überprüfen Sie die Anwesenheit von Photobleaching (Ergänzende Abbildung S4). </li><li> Wenn mehr als 10% der Photobleaching vorhanden Entsorgen Sie die Serie oder wenn es möglich ist, Last wieder die Bildfolge Entfernen des ersten Teils der Serie. </li><li> Wenn Bleichen ist es weniger als 10% wählen Sie Extras&gt; i MSD&gt; Parameter einstellen, überprüfen &#39;Use gleitenden Durchschnitt&#39;, in der ROI-Panel auf der linken Seite ein gesetztumber des Rahmens für den gleitenden Durchschnitt zu achten, dass der Korrespondent Zeit höher ist als die charakteristische Diffusionszeit (für Teilchen, das sich in 1 um 2 s -1 eine Zeit von 10 s eine gute Bewegungsdurchschnitt) </li><li> Wählen Sie Extras&gt; IMSD&gt; Berechnen i MSD (Ergänzende Abbildung S5) und Passform und exportieren Sie die i MSD aus dem Notizblock (Ergänzende Abbildung S6). </li></ol></li></ol> 5. Berechnung des Diffusionsgesetz aus dem i MSD <ol><li> Setzen Sie die ersten paar Punkte, um den Achsenabschnitt (σ 0 2) extrapolieren (5 Punkte sind in der Regel genug, aber mehr Punkte eingepasst werden kann, wenn sie ein lineares Verhalten zeigen) und vergleichen Sie diesen Wert mit der zuvor gemessenen PSF 2. Wenn sie vergleichbar sind, wird die Dynamik des isolierten Fluorophore verfolgt. Im Gegensatz dazu, wenn σ 0 2 2 &gt;&gt; PSF versuchen schneller zu erwerben, um zu gewährleisten, dasskeine versteckten Dynamik vorhanden sind 34. </li><li> Berechnen Sie den scheinbaren Diffusionskoeffizienten (D app) und die durchschnittliche Verschiebung (R) unter Verwendung der Gleichungen 3 und 4 (siehe Einleitung). </li><li> Grundstück D App als Funktion der R, eine Diffusionsgesetz vergleichbar mit dem, was mit Spot-Variation auf der Basis FCS 12 (3D) gemessen zu erhalten. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Einzelpartikelverfolgung (SPT) ist eine der häufigsten Strategien zur Molekulardynamik zu studieren, und es hat den großen Vorteil der Messung Partikelbahnen. Dies wiederum ermöglicht Sondieren das Verhalten noch wenige markierten Partikel in einem komplexen System. Um jedoch diesen Vorteil SPT muss in der Regel eine geringe Dichte der Sonde und sehr hell Etiketten zu erreichen. In diesem Fall ein komplexes Verfahren der Produktion, die Kennzeichnung und das Einsetzen in das System notwendig ist: insbesondere auf hoh...

Ausgehend von der ursprünglichen &quot;fluid mosaic&quot;-Modell von Singer und Nicolson, das Bild der zellulären Plasmamembran kontinuierlich in den letzten Jahrzehnten um die Rolle der Schwellen Zytoskelett-und Lipid-Domänen enthalten 1,2 aktualisiert. Die ersten Beobachtungen wurden durch Fluoreszenzerholung nach Photobleichen (FRAP) enthüllt, dass ein signifikanter Anteil von Membranproteinen unbeweglich 3-5 erhalten. Diese bahnbrechenden Studien, wenn auch sehr informativ, von der relativ schlechte Auflösung im Raum (Mikrometer) und die Zeit (in Sekunden) von FRAP-Setups gelitten. Auch als ein Ensemble Mittelung Messung, fehlt in FRAP mit Informationen über Einzelmolekülverhalten. In diesem Zusammenhang ist die Möglichkeit, spezifisch zu markieren ein einzelnes Molekül mit sehr hellen Tags (die die Untersuchung des Diffusionsprozesses ein Molekül zu einem Zeitpunkt) ist sehr erfolgreich gewesen. Besonders, indem Sie dieZeitauflösung der Single Particle Tracking (SPT) Ansatz für die Mikrosekunden-Zeitskala, Kusumi et erhielten Zugang zu unbekannten Funktionen von Lipid-und Proteindynamik, die sich stark auf die Anerkennung der Rolle der Aktin-basierten Membranskelett in Membranphysiologie 6 beigetragen al. , 7. Diese Ergebnisse erzeugt die so genannte die &quot;Lattenzaun und&quot; Modell, in dem Lipid-und Proteindiffusion durch Aktin-Skelett-basierte geregelt. , Um den Zugriff auf die riesige Menge von Informationen, die von SPT viele experimentelle Fragen gestellt haben müssen jedoch angesprochen werden. Insbesondere wird das Markierungsverfahren typischerweise durch viele Schritte wie Herstellung, Reinigung und die Einführung der markierten Spezies in das System besteht. Weiterhin großen Labels, wie Quantenpunkte oder Metall-Nanopartikel, sind oft erforderlich, um die Sub-Millisekunden-Zeitskala und die Vernetzung der Zielmoleküle durch das Label nicht in vielen Fällen vermieden werden, zu erreichen. Schließlich sind viele Bahnenhaben aufzuzeichnenden statistischen Kriterien passen und damit eine niedrige Dichte des Etiketts erforderlich ist, um Tracking zu ermöglichen. Im Vergleich zu SPT, Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), die Überwindung viele dieser Nachteile stellt einen vielversprechenden Ansatz, um Molekulardynamik zu studieren. Tatsächlich funktioniert FCS gut auch mit dim und dichte Etiketten, so dass die Dynamik des fluoreszierenden Protein-markierte Moleküle in transient transfizierten Zellen zu studieren. Außerdem ermöglicht es erreichte hohe Statistiken in einem begrenzten Zeitraum. Schließlich trotz der &quot;hohen&quot; Dichte von Etiketten FCS bietet einzelne Moleküle Informationen. Dank all dieser Eigenschaften stellt FCS einen sehr einfachen Ansatz und wurde ausgiebig angewendet, um Lipid und Proteindynamik sowohl in Modellmembranen und im Live-Zellen 8-10 studieren. Viele verschiedene Ansätze vorgeschlagen worden, um die Fähigkeit von FCS auf die Details der molekularen Diffusion zeigen erhöhen. Zum Beispiel war es sheigenen, die durch Ausführen FCS auf unterschiedlich großen Beobachtungsgebiete kann man ein &quot;FCS Diffusionsgesetz&quot; aufschlussreich versteckt Merkmale des Molekularbewegung 11,12 definieren. Neben der Verwendung in der Größe variiert wurde die Schwerpunktbereich auch dupliziert 13, bewegt im Raum entlang der Linien 14-20 bzw. konjugiert mit schnellen Kameras 21,22. Mit Hilfe dieser &quot;Raum-Zeit-&#39;Korrelation Ansätze wurden relevante biologische Parameter von mehreren Membrankomponenten quantitativ auf beiden Modellmembranen und der tatsächlichen biologischen diejenigen, wodurch man einen Einblick in die räumliche Organisation Membran beschrieben. Jedoch in aller FRAP und FCS Anwendungen bisher beschriebenen die Größe der Fokusfläche eine Grenze der räumlichen Auflösung, die nicht überwunden werden können. Mehrere Super-Resolution-bildgebenden Verfahren wurden kürzlich entwickelt, um diese Grenze zu umgehen. Einige sind auf Lokalisierungsgenauigkeit basiert, wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (STORM) &lt;sup&gt; 23,24, Photoaktivierung Lokalisationsmikroskopie (PALM) 25, Fluoreszenz PALM (FPALM) 26 und single-particle tracking PALM (sptPALM) 27: Die relativ große Menge an Photonen bei jeder Momentaufnahme erforderlich ist, begrenzt jedoch die Zeitauflösung Diese Verfahren, um mindestens einige Millisekunden, wodurch ihre Anwendbarkeit in vivo hemmt. Im Gegensatz dazu haben eine vielversprechende Alternative zur Super-Resolution Imaging von räumlichen Modulation der Fluoreszenzemission mit Stimulated Emission Depletion-Methoden (STED oder reversible optische Sättigungsfluoreszenzübergänge (RESOLFT)) 28,29 geöffnet. Diese Ansätze kombinieren die Gestaltung der Beobachtungsvolumen deutlich unter der Beugungsgrenze mit der Möglichkeit, schnelle Scan-Mikroskope und Detektionssysteme zu verwenden. In Kombination mit Fluoreszenzfluktuationsanalyse, erlaubt der STED-Mikroskopie, um direkt Sonde die raumzeitliche Dynamik von nanoskaligen Lipide und proteins live Zellmembranen 30,31. Die gleichen physikalischen Größen STED-Mikroskopie anhand kann durch eine modifizierte raumzeitlichen Bildkorrelationsspektroskopie (Stics 32,33) Verfahren, die für die Untersuchung der Dynamik von fluoreszenzmarkierten Membranproteine ​​und / oder Lipiden in lebenden Zellen erhalten werden und von einem kommerziellen Mikroskop. Das experimentelle Protokoll hier präsentiert wird nur von wenigen Schritten zusammen. Die erste erfordert eine schnelle Abbildung des Bereichs von Interesse auf der Membran. Dann wird der resultierende Stapel von Bildern verwendet, um die durchschnittlichen räumlichen-zeitlichen Korrelationsfunktionen zu berechnen. Vs -Mittlere Verschiebung Grundstück - von der Montage der Serie von Korrelationsfunktionen, die molekulare &#39;Diffusionsgesetz &quot;kann direkt von der Bildgebung in Form einer scheinbaren Diffusionskoeffizienten (D app) erhalten werden. Dieses Grundstück kritisch hängt von der Umgebung durch die Moleküle erforscht und ermöglicht direkt die Anerkennung der tatsächlichen Diffusionsartender Lipid / Protein von Interesse. In mehr Details, wie zuvor gezeigt, 34, die räumlich-zeitliche Autokorrelationsfunktion des erworbenen Bild-Serie hängt entscheidend von der Dynamik der Moleküle sich in den gesammelten Bild-Serie (bitte beachten Sie, dass die gleiche Argumentation kann in einer Linie Erwerb angewendet werden wo nur eine Dimension im Raum wird berücksichtigt). Insbesondere definieren wir die Korrelationsfunktion als: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq1.jpg" width="230" /> (1) wo <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/xyt.jpg" width="50" /> die gemessene Fluoreszenzintensität an der Position x, y, und zum Zeitpunkt t, <img fo:content-width=".08in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="8" /> und <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" /> stellt den Abstand in der x-undy-Richtung jeweils <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" /> repräsentiert die Zeitverzögerung, und <img fo:content-width=".2in" src="/files/ftp_upload/51994/brackets.jpg" width="20" /> stellt den Mittelwert. Diese Funktion kann wie folgt ausgedrückt werden: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq2.jpg" width="230" /> (2) wobei &#39;n&#39; die durchschnittliche Anzahl der Moleküle in dem Überwachungsbereich, <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/circlex.jpg" width="10" /> stellt die Faltungsoperation im Raum, und <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ex.jpg" width="50" /> stellt die Autokorrelation der Instrumental Taille. Diese letztere kann als Maß dafür, wie die Photonen eines einzelnen Emitter sind verstreut im Raum aufgrund der optischen / Recording Setup interpretiert werden (die so genannte Point Spread Function, PSF, Gen-Kundgebung gut durch eine Gauß-Funktion angenähert). Schließlich <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ext.jpg" width="50" /> die Wahrscheinlichkeit, ein Teilchen in einem Abstand zu finden <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="10" /> und <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" /> nach einer Zeitverzögerung <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" /> . Wenn wir ein Diffusionsdynamik, in denen Teilchen bewegen sich zufällig in alle Richtungen und Nettoflüsse vorhanden sind nicht der Ansicht, diese Funktion ist auch gut mit einer Gauß-Funktion, bei der die Varianz kann als der mittlere quadratische Verschiebung (MSD) des beweglichen Teilchen identifiziert werden angenähert . Somit ist die Taille der Korrelationsfunktion (auch bezeichnet als <img fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/51994/2t.jpg" width="30" /> ), Kann als die Summe der Partikel MSDS und Instrumental Taille festgelegt und kann durch eine Gaußsche Form gemessen werdenlung der Korrelationsfunktion für jede Zeitverzögerung. Die gemessene I MSD verwendet, um eine scheinbare Diffusivität der beweglichen Moleküle zu berechnen <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/dappt.jpg" width="40" /> und einen mittleren Verschiebungs <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/rt.jpg" width="40" /> Beispiel: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq3.jpg" width="170" /> (3) <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq4.jpg" width="170" /> (4) Paar Überlegungen über die verwendeten Versuchsaufbau können die Leser in den folgenden Abschnitten zu führen. Um die Fluorophore auf der Basalmembran von lebenden Zellen werden wir eine Totalreflexion (TIR) ​​Beleuchtung zu verwenden, mit einem handelsüblichen TIR Fluoreszenz selektiv anzuregen (TIRF)-Mikroskop (Details finden Sie in der Materialabschnitt zu finden). Darüber hinaus, um zu sammeln the Fluoreszenz wir eine hohe Vergrößerung Ziel verwenden und ein EMCCD Kamera (physikalische Größe der Pixel auf dem Chip 16 um) (100X NA 1,47, wird eine hohe numerische Apertur für TIRF-Beleuchtung erforderlich). Um eine Pixelgröße von 100 nm zu erreichen wenden wir eine zusätzliche Vergrößerungslinse von 1.6X. Wie nachstehend erörtert, würde eine Zeitauflösung von weniger als 1 msec benötigt, um richtig beschreiben die Dynamik schneller Membranlipide unter 100 nm ist. Um diese zeitliche Auflösung zu erreichen müssen wir eine Region of Interest (ROI) wählen kleiner als der ganze Chip der Kamera (512 x 512). Auf diese Weise wird die Kamera eine verringerte Anzahl von Leitungen die Erhöhung der zeitlichen Auflösung zu lesen. Jedoch wird in diesem Auslese Regime die Rahmenzeit würde durch die erforderliche Zeit, um die Ladungen von dem Kontakt mit dem Auslesechip der Kamera zu verschieben und in der Regel in der Größenordnung von Millisekunden für 512 x 512 Pixel EMCCD- begrenzt. Um diese Grenze zu schlagen, ermöglicht eine neue Technologie Verschieben der den gesamten Rahmen ROI-Linien nur statt, wit einem praktischen effektive Reduktion des freigelegten Chipgröße (genannt Gestellte Sensor-Modus in unserem EM-CCD). Für diese Konfiguration wirksam zu sein, muss der Chip außerhalb der ROI von einem Paar von Schlitzen in dem optischen Weg angeordnet abgedeckt werden. Dank dieser Einrichtung eine Zeitauflösung von bis zu 10 -4 Sekunden erreicht werden kann. Bitte beachten Sie jedoch, dass dieser Ansatz mit vielen verschiedenen Versuchsanordnungen gekoppelt werden, wie im Abschnitt &quot;Diskussion&quot;, erklärte. Demonstration des Verfahrens wird in lebenden Zellen bereitgestellt werden, indem sowohl ein ATTO488 Bezeichnung 1-Palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (ATTO488-PPE) und ein GFP-markierten Variante des Transferrinrezeptors (GFP TFR). Im Fall von ATTO488-PPE kann dieser Ansatz erfolgreich eine nahezu konstante D app als Funktion der durchschnittlichen Verschiebung angibt, dass sie eine freie Diffusion zu erholen, wie zuvor berichtet 30,35. Dagegen TfR-GFP zeigt eine abnehmende D <sub&gt; App als Funktion der durchschnittliche Hubraum, was darauf hindeutet, teilweise beschränkt Diffusions 6. Darüber hinaus wird in dem letzteren Fall ist es möglich, das lokale Diffusionskonstante und der mittleren Einschlussbereich über viele Mikrometer auf der Membranebene zu quantifizieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1142">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:480px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">iXon Ultra 897</td>
			<td style="width:183px;">Andor</td>
			<td>DU-897U-CS0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Solis</td>
			<td style="width:183px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">CHO-K1</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATTO 488 labeled PPE</td>
			<td style="width:183px;">ATTO-TEC GmbH</td>
			<td>AD 488-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DOPE</td>
			<td style="width:183px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DOTAP</td>
			<td style="width:183px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">890890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-106&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">PBS</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">SimFCS 3.0</td>
			<td style="width:183px;">Globals Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>the software can be downloaded here: http://www.lfd.uci.edu/globals/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMI6000 with TIRF modulus</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">LAS AF</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:183px;">Lipofectamine</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Matlab</td>
			<td style="width:183px;">MathWork</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Imagej</td>
			<td style="width:183px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C-terminal GFP tagged Tranferrin Receptor</td>
			<td style="width:183px;">OriGene</td>
			<td>RG200980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Agar</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A5306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Chloroform</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">528730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Latex beads, fluorescent yellow-green, 30 nm</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">SONICA Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>SOLTEC</td>
			<td style="width:119px;">ETH S3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:183px;">Willco</td>
			<td>GWSt-3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Bio-Format importer for Matlab</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">ICS-MatLab Tools</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip">https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Simulation by Matlab Tutorial</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Simulation by SimFCS Tutorial</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope

Es wurde zunehmend klar, daß die räumliche Verteilung und die Bewegung der Membran-Komponenten wie Lipide und Proteine ​​sind Schlüsselfaktoren bei der Regulation vieler zellulärer Funktionen. Aufgrund der schnellen Dynamik und die winzigen Strukturen beteiligt sind, wird eine sehr hohe Raum-Zeit-Auflösung erforderlich ist, um das reale Verhalten von Molekülen zu fangen. Hier präsentieren wir die Versuchsprotokoll für die Untersuchung der Dynamik von fluoreszenzmarkierten Plasma-Membran-Proteine ​​und Lipide in lebenden Zellen mit hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung. Bemerkenswerterweise ist dieser Ansatz nicht jedes Molekül zu verfolgen, aber es Population Verhalten unter Verwendung aller Moleküle in einer bestimmten Region der Membran berechnet. Der Ausgangspunkt ist eine schnelle Bebilderung einer bestimmten Region auf der Membran. Danach wird eine komplette räumlich-zeitlichen Autokorrelationsfunktion korreliert erfassten Bilder mit zunehmender Zeitverzögerungen, beispielsweise alle 2, 3, n Wiederholungen berechnet. Es ist möglich zu zeigen, dass die Breiteder Peak der räumlichen Autokorrelationsfunktion nimmt bei zunehmender Zeitverzögerung in Abhängigkeit von der Partikelbewegung aufgrund von Diffusion. Daher, passend der Serie von Autokorrelationsfunktionen ermöglicht, extrahieren die tatsächliche Protein mittlere quadratische Verschiebung von Bildgebung (IMSD), hier in der Form des scheinbaren Diffusions vs mittlere Verschiebung vorgestellt. Dies ergibt eine quantitative Blick auf die durchschnittliche Dynamik einzelner Moleküle mit Nanometer-Genauigkeit. Durch die Verwendung eines GFP-markierten Variante des Transferrinrezeptors (TfR) und einer ATTO488 Bezeichnung 1-Palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (PPE) ist es möglich, die Raumzeit-Regulierung von Protein-und Lipid-Diffusion beobachten um große Membranregionen der Mikro zu-Milli zweiten Zeitbereich.

Um die Taille Instrumental kalibrieren kann das Bild eines einzelnen fluoreszierenden Nano Wulst Maßnahme im Sinne des Protokolls Schritt 1.1 beschrieben. Ein typisches Fluoreszenzbild dieser Perlen ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Montage Intensitätsverteilung durch eine 2D-Gauß-Funktion gibt zurück gute Residuen und ermöglicht die Messung der Taillen instrumental bei 270 nm auf. Dieser Wert ist in guter Übereinstimmung mit der von der Rayleigh-Gleichung geschätzt erwarteten Beugungsgrenze. D...

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From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K Aufrufe.  Scuola Normale Superiore. Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Serie: From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Fluorescence Lifetime Imaging für molekulare Rotoren in lebenden Zellen

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Forschung

Biotechnik

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Live-Cell-Imaging von wandernden Zellen mit dem Ausdruck Fluoreszenz-markierten Proteinen in einer dreidimensionalen Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Mit Mikrofluidik-Chips für Live-Imaging-und Studienverletzungs Antworten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Fluorescence Recovery nach der Zusammenführung ein Droplet, um die zweidimensionale Diffusion eines Phospholipidschicht Messen

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is deleterious for the cells as it reduces their ability to form a mature and functional layer. Here, we present a method for establishing and subculturing human and sheep corneal endothelial cell cultures that minimizes the loss of cell-to-cell contact. Explants of corneal endothelium/Descemet&#39;s membrane are taken from donor corneas and placed into tissue culture under conditions that allow the cells to collectively migrate onto the culture surface. Once a culture has been established, the explants are transferred to fresh plates to initiate new cultures. Dispase II is used to gently lift clumps of cells off tissue culture plates for subculturing. Corneal endothelial cell cultures that have been established using this protocol are suitable for transferring to biomaterial membranes to produce tissue-engineered cell layers for transplantation in animal trials. A custom-made device for supporting biomaterial membranes during tissue culture is described and an example of a tissue-engineered graft composed of a layer of corneal endothelial cells and a layer of corneal stromal cells on either side of a collagen type I membrane is presented.

This protocol describes the critical steps required to establish and grow corneal endothelial cell cultures from explants of human or sheep tissue. A method for subculturing corneal endothelial cells on membranous biomaterials is also presented.