A PHS Grant (MH51393) unterstützt diese Arbeit. Einige der Aplysia wir werden von den nationalen Ressource für Aplysia der University of Miami unter Grant RR10294 vom National Center for Research Resources, NIH zur Verfügung gestellt.

Ein. Vorbereitung <ol><li> Das Tier zu betäuben durch Einspritzen 75-100 ml isotonischer Magnesiumchloridlösung. Die Aplysia verwenden wir für die Bildgebung sind in der Regel 150-200 Gramm und werden von Marinus Scientific erhalten. </li><li> Merken die narkotisierten Tier zu einem Wachs bedeckt Gericht. Spritzennadeln funktionieren gut für diesen Zweck, sterile Techniken sind nicht erforderlich. Mit grober Pinzette und Standard-Schere einen Einschnitt in das Tier den Fuß und setzen die bukkalen Masse. Suchen Sie die bukkale Ganglion. Mit Feder Schere und feinen Pinzette vorsichtig kostenlos das Ganglion, indem alle bukkalen Nerven. </li><li> Entfernen Sie das Ganglion und legen Sie sie in einem Sylgard beschichtete Schale mit künstlichem Meerwasser. Legen Sie ein paar Insekten Stifte durch die bukkalen Nerven das Ganglion stabilisieren. Desheath die bukkale Ganglion mit ultrafeinen Pinzette und Schere Feder, um so die Neuronen für intrazelluläre Aufnahme freizulegen. Dann wieder Pin das Ganglion mit etwa 15 fein Insekt (minutien) Pins. Das Ganglion müssen fest an ihrem Platz gehalten werden, da jede Bewegung wird während der Bildgebung problematisch. </li></ol> 2. Bereiten Elektroden <ol><li> Ziehen Sie Elektroden mit Glas Kapillarrohr mit Filament (zB WPI TW100F-4) und einen Abzieher. Einstellungen sollte individuell festgelegt werden, um Elektroden der erforderlichen Widerstand zu erzeugen. Wenn mit 3 M KAc gefüllt (Kaliumacetat) unserer Elektrodenwiderstand beträgt im allgemeinen etwa 10 MOhm, wenn die Elektroden zu abgeschrägt werden, oder etwa 5 MOhm wenn die Abschrägung Schritt ausgelassen sind. </li><li> Füllen eines Satzes von Elektroden mit einer Lösung, die 3 M KAc/30 mM KCl mit einer Spritze und Nadel Mikrofilters. Diese Elektroden werden für die Elektrophysiologie verwendet werden. </li><li> Füllen eines zweiten Satzes von Elektroden mit dem Calcium-Indikator-Farbstoff durch Eintauchen des hinteren Endes der Elektrode in Farbstoff zuvor rekonstituiert mit ca. 40 ul destilliertes Wasser für 500 &amp;mgr; g Farbstoff. Wenn die Spitze der Elektrode gefüllt ist, zurück zu füllen etwa 1/4 Zolldes Endes der Elektrode mit 200 mM KCl um einen guten elektrischen Kontakt zu gewährleisten. </li><li> Es ist vorteilhaft, die Elektroden Fase, wie dies erleichtert Farbstoffinjektion und reduziert die Beschädigung durch mehrfache Durchdringungen Membran durchgeführt. Wir verwenden ein benutzerdefiniertes Beveler die einen Strom von eine Salzwasser / Aluminiumoxidpulver Suspension erzeugt. Die Elektrode wird in einer Halterung montiert ist und ihre Spitze tritt in den Strom an einer 45 °-Winkel. Elektrodenwiderstand wird kontinuierlich überwacht und die Abschrägung beendet, wenn der Widerstand erreicht etwa 5 MOhm für KAc gefüllten Elektroden. Die Farbstoff gefüllten Elektroden für eine gleiche Zeitdauer abgeschrägt und haben typischerweise Widerstände von 15-20 MOhm. </li></ol> 3. Laden des Calcium-Indikatorfarbstoff <ol><li> Legen Sie die auf der Grundlage einer Elektrophysiologie rig und visuell suchen Sie die präsynaptischen Neuron von Interesse. Viele unserer Experimente sind mit einem identifizierten sensorischen Neuronen während der Fütterung, B21 5, 6 genutzt getan. Die relativ fest position, Größe (~ 100 um) und längliche Form der B21 die soma machen es leicht zu finden. </li><li> Aufzuspießen das Neuron von Interesse mit einer Elektrode mit dem Calcium-Indikator-Farbstoff. B21 kann die Identität durch Aufspießen der postsynaptischen Neuron B8 überprüft werden. Depolarisation B21 mit ~ 8 nA Strom auslösen Spikes und Ergebnis bei der Erleichterung PSPs in B8 7. </li><li> Inject Farbstoff in der präsynaptischen Neuron von Interesse, indem hyperpolarisierenden Impulse (typischerweise -15 nA, 1 Hz, 75% ED) für etwa 30 Minuten. Wenn Farbstoffbeladung erfolgreich ist, wird des Neurons Soma Erwerb eine schwache rosa Farbe. Entfernen der farbstoffhaltigen Elektrode durch langsames Herausziehen aus dem Neuron. </li><li> Hinterlegen Zubereitungen für etwa 30 Minuten, damit der Farbstoff in die feinen Prozesse synaptischen Kontakt herzustellen mit Folger Neuronen diffundieren. </li></ol> 4. Calcium Imaging und elektrophysiologische Recording <ol><li> Legen Sie die Vorbereitung auf die Bildgebung MicroscOPE. Die Schale mit der Vorbereitung auf einem Kühltisch mit Stücken von Permagum Dichtschnur, die im Gegensatz Ton, bleibt klebrig, wenn feucht gehalten werden. Die feste Stage-Mikroskop konzentriert, indem das Ziel. Die Bühne bleibt stationär, welche ermöglicht Befestigung angebrachten Magneten Manipulatoren. Da die hohe Vergrößerung macht Vibrationen (insbesondere seitliche Bewegung) ein Problem, sollte die gesamte bildgebende Einrichtung auf einer Schwingungsisolierung Plattform platziert werden. </li><li> Aufspießen präsynaptischen und postsynaptischen Neuronen mit Elektroden, die normale Elektrolyt-Lösung. </li><li> Wählen Sie einen Filter Block geeignet Bild Calcium Orange (Anregung 549 nm, Emission 576 nm) 8 und stellen Sie die Kamera. Wissenschaftlichste CCD-Kameras kann der Untersucher eine Teilmenge der CCD-Zellen, die ausgelesen werden wählen. Darüber hinaus können die Zellen kombiniert (klassierten) werden. Auswählen einer kleineren Teilmenge erhöht die Geschwindigkeit, während Binning erhöht die Empfindlichkeit. Diese beiden Einstellungen, zusammen mit der Belichtungszeit, zu bestimmendie Frame-Rate, dh wie viele Bilder Sie pro Sekunde erfasst werden. Geeignete Einstellungen wird Bild eine Fläche von 580 x 350 um 2 mit 500 x 300 Pixel (mit einem 10x-Objektiv und einem 0,5-Kamera-Adapter). Fügen Neutralfilter zum Lichtweg, um die Beleuchtungsstärke auf die minimale Menge, die korrekte Belichtung mit einer Belichtungszeit &lt;25 ms bietet einzustellen. Diese Einstellungen sollten in einer Bildrate von ca. 30 Hz führen - was in Aplysia ist schnell genug, um Bild single spike evozierte Calcium Veränderungen. Schließlich schließen Feldblende so dass nur der abgebildeten Fläche beleuchtet wird. </li><li> In der Imaging-Software markieren des Neurons Regionen, die Sie messen möchten. Im Elements AR-Software wird dies in der &quot;Time Measurement&quot; Abschnitt, indem Regions of Interest (ROI) durchgeführt. B21 ein bipolarer Neuron und frühere Arbeiten haben gezeigt, dass ihre seitliche Prozess kontaktiert den postsynaptischen Neuron von Interesse 9. Wir in der Regel Bild primären, sekundären und tertiären branches des seitlichen Verfahrens, indem ein ROI über jeden Teil des Neurons. Eine zusätzliche ROI neben dem Farbstoff gefüllt Neuron wird gemessen, um einen Hintergrund-Wert, der von allen anderen später Datenpunkten subtrahiert wird bereitzustellen. </li><li> Weisen Sie den Elektrophysiologie Akquisition (in diesen Experimenten Spike II) für ein Trigger-Signal von der &quot;frame Auslese&quot;-Signal der Kamera vorgesehen warten. Starten Sie die Bildaufnahme (Elements AR); Spike II wird nun startet die Aufnahme automatisch, wenn die Kamera nimmt seinen ersten Frame. Sie können auch ein TTL-Ausgang des Power 1401, kurz auf eine LED in der Mikroskop-Kamera-Anschluss montiert einzuschalten. Dies wird ein Signal, um anschließend zu synchronisieren bildgebende und elektrophysiologische Daten. </li><li> Stimulieren das präsynaptische Neuron durch Injizieren einer Reihe von kurzen Stromimpulsen depolarisierende bei der gewünschten Frequenz. Es ist wichtig, jeden Impuls zu überwachen (z. B. mit einem Reiz ausgelöst Oszilloskop), um zu bestimmen, ob ein Aktionspotential successf istully erzeugt. Während Calcium Orange ist sehr photo-stabil im Vergleich zu anderen Farben, ist es eine gute Idee, eine kontrollierte Studie ohne Stimulation aufnehmen, um zu überprüfen, wie viel Farbbleichung auftritt. </li><li> In Experimenten, in denen intrazelluläre Kalziumkonzentration manipuliert wird ein Arzneimittel, wie EGTA in das präsynaptische Neuron eingeführt und die Stimulation und Datenerfassung oben beschriebenen Schritte werden wiederholt. </li></ol> 5. Analyse von repräsentativen Daten <ol><li> Exportieren Sie die Bilddaten (die Liste der gemessenen Intensitätswerte für jede ROI), indem Sie ihn in eine Textdatei. Ein benutzerdefiniertes Skript in Spike II kann dann importieren Sie die Textdatei. Dieses Skript normalisiert auch die Werte mit den einzelnen Sonde Bereich, und subtrahiert den Wert des Hintergrunds Sonde. Die Datenpunkte werden dann neben den elektrophysiologischen Daten als &quot;virtuelle RealWave&quot; Kanal aufgetragen. Der &quot;Kanal Prozess / Timeshift-Funktion&quot; in Spike II wird verwendet, um genau ausrichten Bilddaten points, ​​mit dem LED-Signal als Referenz. </li><li> Um Werte als prozentuale Veränderung zu erhalten, analysiert die Bilddaten durch Berechnung der relativen Änderung in der Fluoreszenz als dF / F o = (FF o) / F o. F o die Fluoreszenzpegel kurz vor der Stimulus und F die Fluoreszenz während der Stimulus. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Insgesamt Schema des Experiments. Die Experimente werden in einem Ganglion Vorbereitung der Aplysia durchgeführt. Veränderungen der intrazellulären Calcium werden mit einem fluoreszierenden Farbstoff, der iontophoretisch in das präsynaptische Neuron eingeführt wird abgebildet. Prä-und postsynaptischen Neuronen werden dann mit scharfen Elektroden aufgespießt, so dass die synaptische Übertragung kann induziert und überwacht werden. <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> <strong&gt; Abbildung 2. Calcium imaging und intrazelluläre Aufnahme von identifizierten Neuronen in der bukkalen Ganglion Aplysia. (A) Foto des abgebildeten Seitenarm des Neurons B21. Die Box gibt den gemessenen Bereich von Interesse. (B1) Intrazelluläre Stimulation der B21 erinnert Aktionspotentiale (untere Kurve) und die Erleichterung postsynaptischen Potentiale (PSPs) in der postsynaptischen Follower Neuron B8 (mittlere Spur), was es auch Feuer Aktionspotentiale. Erhöhungen der präsynaptischen Calcium Fluoreszenz sind in der oberen Kurve dargestellt. (B2) Effekt der präsynaptischen EGTA auf homosynaptische Erleichterung. EGTA wurde intrazellulär in B21 ~ 15 Minuten vor intrazelluläre Stimulation injiziert. Es wird vermutet, dass EGTA ein langsam wirkendes Calciumchelator, die bei niedrigen Konzentrationen ist nicht schnell genug auf die synaptische Transmission zu unterdrücken. Beachten Sie die Reduzierung der weit verbreiteten Kalzium-Signal und die entsprechende Abnahme der PSP Amplitude. (C) Die PSP Amplitude korreliert mit der präsynaptischen Calcium Signal. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3907/3907fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

<ol>
	<li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li><li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators:+Calcium+green,+calcium+orange+and+calcium+crimson.">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li><li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators:+rapid+transient+response+to+flash+photolysis.">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li><li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2++in+leech+heart+interneurons.">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li><li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia.">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li><li>Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission.">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li><li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation.">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li><li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook. , (2005).</li><li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia.">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+38:+A+practical+guide:+Two-photon+calcium+imaging+of+spines+and+dendrites.">Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites.</a> Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Wir demonstrieren Techniken, die verwendet werden, um gleichzeitig zu überwachen die intrazelluläre Calciumkonzentration und Beurteilung der Wirksamkeit der synaptischen Übertragung kann. Diese Techniken sind nützlich, um zu bestimmen, wie verschiedene Formen von kurzfristigen Plastizität vermittelt werden. Das Abbildungssystem wird mit einem Fluoreszenzmikroskop und CCD-Kamera durchgeführt wird. Diese Anforderungen an die Ausrüstung sind relativ bescheiden, wenn die meisten der funkt...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagent Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> Calcium orange </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Calcium Kalibrierpuffer Kit </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> zum Testen der Empfindlichkeit und den Dynamikbereich des Signals </td></tr><tr><td> Magnesiumchloridhexahydrat </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> verwendet in 0,33 M Lösung Tier zu betäuben </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Reagenzien verwendet. <table border="1"><tbody><tr><td> Ausrüstung Name </td><td> Firma </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> FN-1 aufrecht Fluoreszenzmikroskop </td><td> Nikon Instruments </td><td> mit Narishige ITS-FN1 Bühne </td></tr><tr><td> NMN-21 Manipulatoren </td><td> Narishige </td><td> montiert auf der Bühne mit Magneten </td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ 2-CCD-Kamera </td><td> Photometrics </td><td></td></tr><tr><td> NIS Elementen AR (Version 3.22) </td><td> Nikon Instruments </td><td> Imaging-Software verwendet werden, um Fluoreszenz-Daten zu erfassen </td></tr><tr><td> 10X/0.3w Plan Fluor Ziel </td><td> Nikon Instruments </td><td> Dieses Wasser Immersionslinse hat einen sehr langen Arbeitstag Abstand von 3,5 mm </td></tr><tr><td> X-Cite 120 PC Metallhalogenidlampe </td><td> EXFO </td><td> verwendet für die Fluoreszenz-Bildgebung </td></tr><tr><td> LS-DWL Halogenlampe </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-CY3 Filter-Set </td><td> Chroma Technology </td><td>; </td></tr><tr><td> Macht 1401 A / D-Wandler </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> Probenahme wurde bei 3 kHz getan </td></tr><tr><td> Spike II (Version 7.07) </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> Software zur Elektrophysiologie Daten erfassen </td></tr><tr><td> SEC-10 LX-Verstärker </td><td> NPI-Elektronik </td><td> verwendet mit einem 10X Headstage </td></tr><tr><td> Modell 410 Verstärker </td><td> Brownlee Präzision </td><td> zum Verstärken und Filtern des Signals </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> minus k Technologie </td><td> Schwingungsisolierung für die Bildgebung </td></tr><tr><td> Kühltisch </td><td> Maßarbeit </td><td> Messingplatte durch welche Eiswasser mit einer variablen Rate gepumpt </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Ausrüstung verwendet.

monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia

Es wurde vorgeschlagen, dass Änderungen in intrazellulärem Calcium die Induktion einer Reihe von wichtigen Formen der synaptischen Plastizität (zB homosynaptische Erleichterung) 1 vermitteln. Diese Hypothesen lassen sich durch gleichzeitiges Überwachen von Änderungen der intrazellulären Calcium-und Umbauten in der synaptischen Wirksamkeit getestet werden. Wir zeigen, wie dies durch die Kombination von Calcium-Imaging mit intrazellulären Aufnahme Techniken erreicht werden kann. Unsere Experimente sind in einer bukkalen Ganglienzellen der Mollusken Aplysia californica durchgeführt. Dieses Präparat hat eine Reihe von vorteilhaften Merkmalen experimentell: Ganglia leicht aus Aplysia entfernt werden und Experimente verwendet adulten Neuronen, die normale synaptische Verbindungen herzustellen und haben eine normale Ionenkanal Verteilung. Aufgrund der niedrigen Stoffwechsel des Tieres und den relativ niedrigen Temperaturen (14-16 ° C), die natürlich für Aplysia sind, sind die Vorbereitungen für längere Zeit stabil. ent &quot;&gt; Um Änderungen in der intrazellulären freien Calcium wir die Zelle impermeante Version von Calcium Orange 2, die leicht &#39;geladen&#39; in einem Neuron über Iontophorese ist verwenden. erkennen Wenn diese langwellige Fluoreszenz-Farbstoff bindet an Kalzium, Fluoreszenzintensität steigt. Calcium Orange hat schnelle kinetische Eigenschaften 3 und im Gegensatz ratiometrische Farbstoffe (beispielsweise Fura 2), erfordert keine Filterrad zur Bildgebung. Es ist ziemlich stabil und weniger Foto phototoxische als andere Farbstoffe (zB Fluo-3) 2,4. Wie alle nicht-ratiometrische Farbstoffe, Calcium orange relativen Änderungen der Kalziumkonzentration anzeigt. Aber weil es nicht möglich ist, um Veränderungen in Farbstoffkonzentration durch Belastung und Diffusion, kann es nicht zur absoluten kalibrierten Calciumkonzentrationen bereitzustellen. Ein aufrechter, feste Phase, zusammengesetzten Mikroskop wurde Bildes Neuronen mit einer CCD-Kamera in der Lage ist die Aufnahme etwa 30 Bildern pro Sekunde verwendet. In Aplysia diese zeitliche Auflösungist mehr als ausreichend, um auch nur einen einzigen Dorn induzierte Veränderung der intrazellulären Calcium-Konzentration zu detektieren. Sharp Elektroden gleichzeitig verwendet zu induzieren und aufzuzeichnen synaptischen Übertragung in identifizierten prä-und postsynaptischen Neuronen. Am Ende eines jeden Prozesses vereint ein benutzerdefiniertes Skript Elektrophysiologie und Bildgebung Daten. Um eine korrekte Synchronisation zu gewährleisten verwenden wir einen Lichtimpuls aus einer LED in den Kamera-Anschluss des Mikroskops montiert. Manipulation von präsynaptischen Kalziumspiegel (zB über intrazelluläre EGTA Injektion) ermöglicht es uns, spezifische Hypothesen über die Rolle der intrazellulären Calcium bei der Vermittlung verschiedener Formen von Plastizität zu testen.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia at JoVE.com

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Wir zeigen, wie Veränderungen in der intrazellulären freien Calciumkonzentration und synaptische Wirksamkeit gleichzeitig in einem Ganglion Herstellung überwachenden<em&gt; Aplysia</em&gt;. Wir Bild intrazellulärem Calcium unter Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffs, Calcium Orange, und induzieren und zu überwachen synaptischen Übertragung mit scharfen (intrazellulären) Elektroden.

Überwachen von Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration und Synaptic Wirksamkeit in der Muschel<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

monitoring-changes-intracellular-calcium-concentration-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

10.9K Aufrufe.  Mt. Sinai School of Medicine. Wir zeigen, wie Veränderungen in der intrazellulären freien Calciumkonzentration und synaptische Wirksamkeit gleichzeitig in einem Ganglion Herstellung überwachenden Aplysia. Wir Bild intrazellulärem Calcium unter Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffs, Calcium Orange, und induzieren und zu überwachen synaptischen Übertragung mit scharfen (intrazellulären) Elektroden.

Serie: Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Forschung

Neurowissenschaften

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Elektroporation des Hinterhirn zu Axonal Trajectories und Synaptic Treffer in der Embryo-Küken Trace

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Die Ableitung der zeitliche Verlauf der Glutamate Ausverkauf mit Dekonvolutionsanalyse von Astrozytäre Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

Der neuromuskulären Synapse: Mess Synapse Größe, Fragmentierung und Veränderungen der synaptischen Protein Dichte Mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Aufzeichnung von Temperatur-induzierte neuronale Aktivität durch Calcium Überwachen von Änderungen in der Riechkolben von<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using calcium-sensitive fluorescent dyes that change their emission intensity or wavelength depending on the concentration of free calcium in the cell. There are several methods used to stain cells with calcium dyes. Most common are the processes of loading the dyes through a micropipette or pre-incubating with the acetoxymethyl ester forms of the dyes. However, these methods are not quite applicable to neuromuscular junctions (NMJs) due to methodological issues that arise. In this article, we present a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump of the frog nerve into the nerve endings. Since entry of external calcium into nerve terminals and the subsequent binding to the calcium dye occur within the millisecond time-scale, it is necessary to use a fast imaging system to record these interactions. Here, we describe a protocol for recording the calcium transient with a fast CCD camera.

Here, we describe a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump into the nerve endings. We also present a protocol for the recording and analysis of fast calcium transients in the peripheral nerve endings.

Laden eines Kalziumfarbstoffs in Froschnervenendungen durch den Nervenstumpf: Calciumübergangsregistrierung im Frosch Neuromuscular Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

In VivoKultivierung-wie Murine Astrozyten über das schnelle, einfache und kostengünstige AWESAM-Protokoll

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...