Die Autoren bedanken sich bei L. Belluscio für Chirurgie Filmtechnik, D. Kwon danke für die Dreharbeiten Unterstützung, Bearbeitung K. Liu für Video-Unterstützung und K. MacLeod für alle Hintergrundmusik. KW erkennt die großzügige Unterstützung der NIMH Division of Intramural Forschungsprogramme und die Gene, Cognition and Psychosis Program. Diese Arbeit wurde von der NIMH Intramural Research Program (VC, YY, SMKW) und der NIAAA Division of Intramural Klinische und Biologische Research Program (VC, RMC, DML) unterstützt.

Die experimentellen Verfahren beschrieben wurden vom National Institute of Mental Health Animal Care und Use Committee genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Ein. Präoperative Vorbereitung <ol><li> Reinigen Sie alle Werkzeuge in einem heißen Perle Sterilisator vor aseptische Chirurgie, reinigen die Operation vor Ort mit 70% Ethanol, und legte sauber Packpapier und Klebeband. Trage sterile Handschuhe. Betäuben das Tier mit frisch zubereiteten 1,2% Avertin Lösung bei 0,02 ml / g, intraperitoneal gegeben. Alternativ mit Isofluran-Gas betäubt durch einen Nasenkonus, 5% für die Induktion, 1,5% für die Wartung, mit einem passiven scavenger Schaltung. Überprüfen Sie die Anästhesie Ebene mit Schwanz oder Zehen drückt in voller Sedierung zu gewährleisten. </li><li> Decken die Augen des Tieres mit steriler Augensalbe, und spritzen frisch zubereitet Dexamethason (0,2 mg / kg) und Carprofen (5 mg / kg) subcutaneously zu Gehirn Schwellung und Entzündung 11 zu verhindern. Rasieren die Haare über den Schädel zwischen den Ohren, und sterilisieren Sie die Haut mit betadine Peeling und drei alternierende Tupfer von 70% Ethanol. </li><li> Montieren Sie das Tier in einem stereotaktischen Chirurgie Bühne mit earbars mit einem Wasserkreislauf Heizkissen unter dem animal set bei 37 ° C. Überprüfen Sie regelmäßig das Tier Anästhesie Ebenen und Ergänzung des ursprünglichen Anästhesie Dosis nach Bedarf. </li><li> Inject 200 ul von 0,5% Carbostesin unter der Kopfhaut, um den Bereich zu betäuben. Inzision der Haut und entfernen Sie den Hautlappen über den Schädel. Entfernen Sie die Knochenhaut und trocknen Sie den Bereich mit einem sauberen Wattestäbchen. </li></ol> 2. Chronische Cranial Fenster Chirurgie <ol><li> Verwenden Sie ein High-Speed-Dentalbohrer mit einem 0,5 mm-Fräse vorsichtig skizzieren 3-5 mm Durchmesser-Kreis über das Gehirn region of interest. Periodisch benetzen Bohrstelle mit steriler 0,9% iger Kochsalzlösung und klar weg Knochenmehl mit sauberen Wattestäbchen. Wenn die Knochen blutet, verwenden gelfoam mit steriler Kochsalzlösung eingeweicht, um die Blutung auslöschen und warten, bis es zu stoppen. </li><li> Wenn der letzte Knochen Schicht erreicht ist, heben und entfernen Sie die Knochen Insel mit spitzen Pinzette. Dura Anhänge auf der untersten Platte des Knochens können auftreten, wenn das Fenster durchquert einen Knochen Nahtmaterial werden. Diese sollten vorsichtig entfernt werden, da der Knochendeckel abgehoben ist. </li><li> Befeuchtetem Gel-Schaum vorsichtig über den freiliegenden dura seiner Oberfläche zu reinigen und warten jeden Dural Blutung zu stoppen Critical Schritt:. Nicht fortfahren, bis alle dural Blutung aufgehört hat. Blut, das im Inneren des kranialen Fenster eingeklemmt wird meist führt zu einem undurchsichtigen Fenster. </li><li> Wenn die Region von Interesse unter einer Stelle, wo die Dura ist besonders dick, Entfernen der Dura oben kann es erforderlich sein. Wenn dies der Fall ist, sanft zu trennen die Dura von der Pia unten mit sehr feinen Pinzetten, einen kleinen Einschnitt in der angehobenen Dura mit einem anderen Paar von feinen Pinzette, dann erfassen die Schnittkanten und sanftspaltete die Dura. Die Dura ist dünn, aber stark, so vorsichtig sein, nicht das Gehirn mit den intakten Rändern der Dura schneiden. </li><li> Spülen Sie den Bereich mit einem sterilen ACSF oder sterile Kochsalzlösung. </li><li> Ziehen einer sterilen Deckgläschen (3-5 mm) über die Dura oder pia Critical Schritt:. Wenn die umgebenden Schädel Kurven deutlich, verwenden Kwiksil 12 Klebstoff in Räumen, wo die Dura oder pia keinen engen Kontakt mit dem Deckglas in Regionen füllen würde Das wird nicht abgebildet werden. </li><li> Verwenden Cyanoacrylat Gels, um das Elastomer und Kleber die Kanten des Deckglases bestimmt. Decken Sie die gesamte freiliegende Schädel mit Cyanacrylat Gel oder einer krazyglue und zahnmedizinischen Zement-Mischung Critical Schritt:. Lassen Sie keine Cyanacrylat-Gel, das Gehirn zu berühren. </li><li> Einbetten eine maßgeschneiderte Metall-Fixierung bar am gegenüberliegenden Ende des Schädels. </li><li> Zurückzukehren das Tier in einen warmen Wiedergewinnungskammer, nach einer Injektion von intraperitonial Ketoprofen, 5 mg / kg, for Schmerzen. Fahren Sie mit der Analgetikum für zwei Tage nach der Operation. </li><li> Nach zwei Wochen post-operative Erholung, betäuben das Tier mit Isofluran (5% für Induktion, 1,5% für die Wartung), montieren Sie ihn in einem maßgeschneiderten Mikroskoptisch mit einem Kopf-Befestigungsrahmen, und überprüfen Sie die kranialen Fenster für optische Klarheit unter Beleuchtung mit blauem Licht. Hirnoberfläche Blutgefäß Klarheit ist höchst bezeichnend von kranialen Fensters Qualität. Wenn die Kanten scharf Blutgefäß definiert sind, ist das Fenster wahrscheinlich verwendbar. Die Zwei-Wochen post-operative Recovery-Zeit wird empfohlen, genügend Zeit für das Tier von der Operation erholen können. Cranial Fenstern in der Regel klar, und während dieser Zeit zu verbessern, und bleiben optisch transparent für weitere Wochen bis Monate, bis das Nachwachsen des Schädels oder Verdickung der Dura verschlechtert Fenster Qualität. </li></ol> 3. Behavioral-Protokolls und Laser Scanning Zwei-Photonen-Mikroskopie <ol><li> Tiere mit klaren cranial Fenstern wird es einer umgebenden Reiz ausgesetzt werden oder Gegenstand einer Verhaltenstraining Sitzung, und dann nachher zum Zeitpunkt der maximalen Arc-GFP-Expression abgebildet. Vor Beginn eines Verhaltensmodells Protokoll, sollte das Tier in einer konsistenten Heimkäfig Umwelt zu Tag zu Tag Variation Basislinie Arc-GFP Expressionsniveaus minimieren gehalten werden. </li><li> Beginnen Verhaltenstraining oder Umweltreize Paradigmen, abhängig von der Hirnregion des Interesses. Beispielsweise können Tiere auf unterschiedliche visuelle Umgebungen über aufeinanderfolgende Tage ausgesetzt werden und abgebildet jeden Tag nach visueller Stimulation zu Stimulus-spezifische Antworten in der Sehrinde 10 zu identifizieren. </li><li> Arc-GFP-Fluoreszenz in den Neuronen in der Regel ihren Höhepunkt erreicht Stufe zwei Stunden nach der Stimulation. Die experimentelle Zeitachse kann optimiert werden, um den Nachweis von Arc-GFP-Expression in Neuronen an ihrer Spitze Fluoreszenzwerte erleichtern. </li><li> Nach einer Verhaltenstherapie Training oder environmental Stimulation abgeschlossen ist, betäuben das Tier mit Isofluran (5% für Induktion, 1,5% für die Wartung) und montieren das Tier in der maßgeschneiderten Mikroskoptisch mit Kopf-Fixierung Rahmen unter der Zwei-Photonen-Mikroskop. </li><li> Der Kopf des Tieres Position mit dem Kopf-Fixierungsrahmenplatte, der direkt an der Bühne unter Verwendung des implantierten Metallstange am Schädel befestigt. Isofluran und Sauerstoff kontinuierlich an der Maus durch ein Nasenkonus zugeführt. Die Körpertemperatur wird beibehalten mit einem Heizkissen. </li><li> Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop Detektoren von Umgebungslicht werden durch die Durchführung der Zwei-Photonen-Laser-Scanning in einem dunklen Raum geschützt. Verwenden Sie ein 20x oder 25x (1,05 numerische Apertur) Wasser Immersionslinse für die Bildgebung. Zunächst unter Auflicht-Fluoreszenz Beleuchtung, zu erwerben ein Bild der Oberfläche Blutgefäß Muster über das Gehirn interessierenden Region mit einer CCD-Kamera für zukünftige Bildausrichtung. </li><li> Starten Zwei-Photonen-Laser-Scanning-, ein 3-D-Bild-Stapels erfassen. Ein Olympus FV1000MPE Multi-Photonen-Mikroskop wird in unserem Setup verwendet. Die Anregungswellenlänge des Zwei-Photonen-Laser bei 920 nm festgelegt, und die Leistung des Lasers aus dem Ziel emittiert wird bei ungefähr 50 mW eingestellt. Emittierten Fluoreszenz wird gleichzeitig in grünen und roten Kanälen (dichroitischen Spiegel bei 570 nm, bei Sperrfiltern 495-540 nm und 570-625 nm) unter Verwendung einer externen zweikanaligen photomutiplier Detektionssystem nahe der Probe platziert detektiert. Arc-GFP-Fluoreszenz erscheint nur in den grünen Kanal, während Gewebe Autofluoreszenz erscheint in beiden Kanälen 13, 14. </li><li> Typische Bildstapeln haben Abmessungen von ca. 320x320x100 um (Breite x Länge x Tiefe), eine horizontale Auflösung von 0,5 &amp;mgr; m / Pixel, und eine vertikale Auflösung von 3 pm / Pixel. </li><li> Nach dem Erwerb der Bildstapel, wieder das Tier in das Haus Käfig. Bitte nicht stören das Tier bis zur nächsten Verhaltens-und Imaging-Sitzung. Wiederholen Sie das Verhalten und die bildgebenden Verfahren über Tage als wünschenswerted.. Verwenden Sie die zuvor erworbenen Hirnoberfläche Blutgefäß Bild zu orientieren zurück zu der gleichen bildgebenden Lage. </li></ol>

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+a+role+of+arc+in+enhancing+orientation+specificity+in+visual+cortex.">In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex.</a> Cell. 126 (2), 389-402 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).</li><li>Dombeck, D. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chamber+and+artificial+dura+method+for+long-term+optical+imaging+in+the+monkey.">A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey.</a> Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).</li><li>Kleinfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li><li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).</li><li>Stosiek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die in-vivo-Bildgebung hier beschriebene Methode ermöglicht die wiederholte Untersuchung des Arc Veränderungen der Genexpression in den gleichen Gruppen von Neuronen über mehrere Tage im lebenden Tier. Es ist eine effiziente und vielseitige Methode, um Informationen über neuronale Plastizität verwandte molekulare Dynamik in einzelnen Neuronen in Reaktion auf verschiedene Verhaltensweisen Erfahrungen zu erhalten. Standard histochemische Verfahren wie in situ Hybridisierung und Immunfärbung kann ei...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name der Einrichtung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> FV1000 Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> FV1000MPE </td><td> Imaging </td></tr><tr><td> Dissektionsmikroskop </td><td> Omano </td><td> 555V107 </td><td> Chirurgie </td></tr><tr><td> Stereotaxis Chirurgie Bühne für Mäuse </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 726335 </td><td> Chirurgie </td></tr><tr><td> 20X oder 25X Wasser Immersionsobjektiv </td><td> Olymp </td><td> XLPL25XWMP </td><td> Imaging </td></tr><tr><td> Mikroskoptisch mit Kopf-Befestigungsrahmen </td><td> Maßgeschneiderte </td><td> N / A </td><td> Imaging </td></tr><tr><td> Feinen Pinzette </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11251-20 </td><td> Chirurgie </td></tr><tr><td> Dentalbohrmaschinen Grat </td><td> Fine Science Tools </td><td> 19007-05 </td><td> Chirurgie </td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> QImaging </td><td> QICAM 12-Bit </td><td> Imaging </td></tr></tbody></table>

in vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons

Die Fähigkeit des Gehirns als Reaktion auf Erfahrungen zu ändern ist wichtig für gesunde Funktion des Gehirns, und Anomalien in diesem Prozess beitragen zu einer Vielzahl von Erkrankungen des Gehirns 1,2. Zum besseren Verständnis der Mechanismen, durch die Schaltkreise des Gehirns reagieren auf eines Tieres Erfahrung erfordert die Fähigkeit, die Erfahrung angewiesen molekulare Veränderungen in einer bestimmten Gruppe von Neuronen zu überwachen, die über einen längeren Zeitraum, in dem lebenden Tier. Während die Erfahrung und die damit verbundenen neuronalen Aktivität ist bekannt, dass Veränderungen der Genexpression in Nervenzellen 1,2 auslösen, die meisten der Methoden, um solche Veränderungen zu erkennen erlauben nicht wiederholte Beobachtung der gleichen Neuronen über mehrere Tage oder keine ausreichende Auflösung zu beobachten einzelnen Neuronen 3 , 4. Hier beschreiben wir eine Methode, die in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie mit einem genetisch kodierten fluoreszierenden Reporter Erfahrungen abhängigen Veränderungen der Genexpression in einzelnen kortikalen Neuronen über die Strecke<html> Laufe des Tages-to-day Erfahrung. Einer der gut etablierten Erfahrung abhängigen Genen ist Activity-regulierten Zytoskelett assoziierten Protein (Arc) 5,6. Die Transkription von Arc wird schnell und stark von verstärkten neuronalen Aktivität 3 induziert wird, und dessen Proteinprodukt reguliert die Endozytose von Glutamatrezeptoren und langfristige synaptischen Plastizität 7. Die Expression von Arc wurde weithin als molekularer Marker neuronaler Schaltkreise in spezifischen Verhaltensweisen 3 beteiligten Karte verwendet. In den meisten dieser Studien wurde Arc-Expression durch in situ-Hybridisierung oder Immunhistochemie in festen Gehirnschnitte detektiert. Obwohl diese Methoden ergab, dass die Expression von Arc auf eine Teilmenge von erregenden Neuronen nach Verhaltensstörungen Erfahrung, wie die zellulären Strukturen des Arc Ausdruck kann mit mehreren Episoden von wiederholten oder besondere Erfahrungen über Tage zu ändern wurde nicht untersucht wurde lokalisiert. ntent &quot;&gt; In vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie ein guter Weg, um Erfahrungen-abhängige zelluläre Veränderungen im lebenden Gehirn 8,9 untersuchen bietet. Um die Prüfung der Arc Ausdruck in Live-Neuronen durch Zwei-Photonen-Mikroskopie zu ermöglichen, haben wir vorher erzeugte einen Dominoeffekt in Maus, in der ein GFP-Reporter steht unter der Kontrolle des endogenen Promotor Arc 10 platziert. Dieses Protokoll beschreibt die chirurgischen Vorbereitungen und bildgebenden Verfahren zum Verfolgen erfahrungsabhängiger Arc-GFP-Expression in neuronalen Mustern Ensembles in dem lebenden Tier. Bei diesem Verfahren , chronische kranialen Fenster wurden zuerst in Arc-GFP-Mäuse in den kortikalen Regionen von Interesse implantiert. Die Tiere wurden dann wiederholt durch Zwei-Photonen-Mikroskopie nach gewünschten Verhaltensänderungen Paradigmen im Laufe von mehreren Tagen abgebildet. Diese Methode kann allgemein für Tiere, die anderen fluoreszierenden Reporter Erfahrung-abhängigen molekularen Veränderungen 4.

<html> Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Erfahrungen abhängigen molekularen Veränderungen in den einzelnen kortikalen Neuronen in lebenden Tieren zu verfolgen. Eine chronische kranialen Fenster als einem kortikalen Bereich von Interesse in einer Maus, die ein fluoreszierendes Reporterprotein der Genexpression erstellt. Zweiphotonenmikroskopie können dann mit verschiedenen Verhaltensparadigmen gekoppelt werden, um verhaltensrelevante induzierte molekulare Veränderungen einzelner Neuronen beobachten und zu v...

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In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in Nervenzellen sind essentiell für die Fähigkeit des Gehirns, in Reaktion auf Verhaltensstörungen Herausforderungen anzupassen. Ein<em&gt; In vivo</em&gt; Zwei-Photonen-Imaging-Verfahren wird hier das ermöglicht die Rückverfolgung von molekularen Veränderungen in den einzelnen kortikalen Neuronen durch genetisch kodierte Reporter beschrieben.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

in-vivo-two-photon-imaging-experience-dependent-molecular-changes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

21.5K Aufrufe.  National Institute of Mental Health. Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in Nervenzellen sind essentiell für die Fähigkeit des Gehirns, in Reaktion auf Verhaltensstörungen Herausforderungen anzupassen. Ein In vivo Zwei-Photonen-Imaging-Verfahren wird hier das ermöglicht die Rückverfolgung von molekularen Veränderungen in den einzelnen kortikalen Neuronen durch genetisch kodierte Reporter beschrieben.

Serie: In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

Ein Thin-Schädel Fenster-Technik für chronische Zwei-Photonen- In-vivo- Imaging von Murine Mikrogliazellen in Modelle der Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In-vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie einzelner Nervenenden in der Haut

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Quantifizierung von filamentösen Aktin (F-Aktin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...