Wir danken Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann und Walker Jackson für das sorgfältige Lesen des Manuskripts. Die Autoren erhalten, die Finanzierung durch das Ministerium für Forschung MIWF des Landes Nordrhein-Westfalen (SR), der BMBF-Projekträger DLR deutsch-amerikanischen Zusammenarbeit in Computational Neuroscience (CRCNS; SR) zur Verfügung gestellt wurde, Centers of Excellence in Neurodegenerative Erkrankungen (COEN; SR) und der Universität Bonn intramural Förderprogramm (BONFOR; SR).

1. Systemanforderungen <ol><li> Mikroskop-System: Gut Visualisierung des Dendriten ist entscheidend. Falls vorhanden, verwenden Sie ein Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop-System. In unseren Experimenten verwendeten wir eine TRIM Scope II, LaVision Biotec, Bielefeld, Deutschland oder Ultima IV-System, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin mit einem Ti ausgestattet: Sapphire ultraschnelle-gepulste Laser (Chameleon Ultra II, Coherent) und eine hohe NA Ziel (60X, 0,9 NA, Olympus) zur Visualisierung der Dendriten, die wir mit einem Fluoreszenzfarbstoff über die Patch-Pipette gefüllt hatte. Obwohl photo-Schäden als weniger stark mit der 2-Photonen-Scanning, reduzieren die Laserleistung (unter 8 mW im Gewebe) und Verweilzeiten (unter 1 us) oder so viel wie möglich. </li><li> Eine zweite Möglichkeit besteht darin, eine Weitfeld-Lichtquelle (LED oder eine Leuchtstofflampe) synchron auslösen mit der Akquisition bis Belichtungszeit so weit wie möglich zu reduzieren. Wir haben einen Monochromator mit einer integrierten Lichtquelle (TILLPho verwendetTonika, Gräfelfing, Deutschland) auf einem Zeiss Axioskop 2 FS aufrechten Mikroskop, das mit Dodt kontrastreiche Infrarot-Beleuchtung (TILLPhotonics, Gräfelfing, Deutschland) ausgerüstet war. In unseren Experimenten Belichtungszeiten reichten von üblicherweise 10 ms bis max. 30 msec. </li><li> Nutzen Sie eine schnelle Mikro-Iontophorese Verstärker, zB eine Zwei-Kanal-Mikro-Iontophorese-System MVCS-C-02 (NPI electronic, Tamm, Deutschland) mit schnellen Kapazität Entschädigung. Die spitzen Iontophorese Mikroelektroden haben Widerstände von 25 - 100 MOhm (entscheidend abhängig von der Größe der Spitze der Pipette und Form), und schnelle Anstiegszeiten kann nur erreicht werden, wenn die Kapazität Kompensation der iontophoretisches Verstärker optimal abgestimmt wird. Dieser schnelle Ausgleich ist notwendig, um Stromimpulse mit einer kurzen und schnellen Wirkungseintritt im Sub-Millisekundenbereich zur iontophoretisches Pipette anwenden und dadurch die Sender mit hoher räumlicher Auflösung in Messfelder unter 1 um 13 auszuwerfen. Iontophorese-Verstärker sind also ab mehrere andere Unternehmen, die wir nicht in unserem Labor getestet. Diese Geräte sind nach unserem Wissen nicht mit der Kapazität Kompensationsschaltungsanordnung ausgestattet. </li></ol> 2. Bereiten Lösungen <ol><li> Bereiten künstlichen Liquor (ACSF) und interne Lösung, da es für die experimentelle Design erforderlich ist. Die einzige zusätzlich zum inneren Lösung, die erforderlich ist, ist eine rote oder grüne Fluoreszenz-Farbstoff (zB 50 bis 200 um Alexa Fluor 488 oder 594 Hydrazid, Invitrogen), abhängig von der optischen Vorrichtung. Hier ein Beispiel für ACSF Saccharose, die für die Präparation verwendet werden kann, in mM: NaCl 60, ​​100 Saccharose, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 1 CaCl 2, 5 MgCl 2, 20 Glukose, und für normale ACSF Lösung für Patch-Clamp-Experimente in mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 2,6 CaCl 2, 1,3 MgCl 2, 15 Glukose. </li><li>Carbogenize (95% O 2, 5% CO 2) Alle extrazellulären Lösungen ständig. </li><li> Bereiten interne Lösung, beispielsweise in mm: 140 K-Gluconat, 7 KCl, 5 HEPES-Säure, 0,5 MgCl 2, 5 Phosphocreatine, 0,16 EGTA; mit 50-200 pM Alexa 488. </li><li> Für Glutamat Mikro-Iontophorese Herstellung einer Lösung mit 150 mM Glutaminsäure und der pH-Wert mit NaOH auf 7,0. In 50 -200 uM Alexa Fluor 488 oder 594 Hydrazid (Invitrogen) für die Visualisierung. </li><li> Für Iontophorese von GABA bereiten eine 1 M GABA-Lösung und der pH-Wert bis 5 mit HCl 15. Bei diesem pH GABA aufgeladen ist, nur dann kann es unter Verwendung Iontophorese werden. Bitte beachten Sie, dass der niedrige pH-Wert in der Lösung auf den extrazellulären Raum ausgestoßen könnte bewirken GABA Getriebe selbst 16,17. Schützen Sie das GABA-Lösung vor Licht und häufig frisch zubereiten GABA Stammlösung, da ältere Lösung seine Wirksamkeit verlieren kann. </li><li> Wenn es schwierig ist, GABAergic Veranstaltungen, ein hallo sehengh Cl - treibende Kraft interne Lösung, beispielsweise durch Weglassen KCl, könnte dazu beitragen, die GABAerge Ereignisse visualisieren, um zu sehen, wenn die GABA Iontophorese arbeitet, jedoch zu synaptischen Integration untersuchen eine physiologische Antriebskraft empfohlen werden könnte. Für allgemeine Erfassung von kleinen GABAergic Veranstaltungen kann ein Protokoll in 8C gezeigt helfen. </li></ol> 3. Ziehen Sie und testen Sie die Iontophorese Pipetten <ol><li> In der Regel ziehen die richtigen Pipetten ist vielleicht der wichtigste Schritt, um eine kontrollierte Neurotransmitter Iontophorese erreichen. Bei der Verwendung von Iontophorese in der Zellkultur, ist es möglich, sehr feine Elektroden ähnlich scharfen Mikroelektroden 10 ziehen. In patch-clamp Experimente in akuten Scheiben jedoch äußerst dünnen Pipetten auf der Scheibenoberfläche biegen, wenn sie in das Gewebe mit einem Winkel abgesenkt werden, wodurch es unmöglich tiefer Dendriten zu erreichen. </li><li> Daher ziehen eine Pipette mit einem sehr kleinen Spitze, so dass kein neurotransmitter austreten kann, aber die Spitze hat noch steif genug sein, um in das Gewebe (Abbildung 2) zu durchdringen. Verwenden Sie zum Beispiel 150 GB F 8P Klasse Pipetten (Science Products, Hofheim, Deutschland) und einen horizontalen Puller (zum Beispiel ein DMZ-Universal-Puller, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Deutschland, oder ein P-97 Abzieher, Sutter Instrument Company , Novato, CA) mit mehreren Ziehen Schritte, um eine kleine Öffnung, aber auch eine kurze Tapper mit einem steilen Winkel (Abbildung 2 und Tabelle 2) zu erreichen. </li><li> Es ist auch möglich, Quarzglas Pipetten verwenden zu ziehen iontophoretischen Pipetten 10. Diese sollen eine bessere mechanische Eigenschaften aufweisen und zuverlässiger zu sein, aber spezielle Laser-Abzieher sind erforderlich. Es ist aber auch möglich, gute Ergebnisse beim Glaspipette, die in der Regel zum Ziehen Patch-Pipetten verwendet erzielen. </li><li> Testen Sie die Pipette Leistung und Widerstand in einer Kammer ohne Gewebe, bevor Sie sie zum erstenZeit konnte seit Auslaufen von Glutamat schadet dem Gewebe. </li><li> Richten Sie die Iontophorese Verstärker richtig. Dann füllen Sie die Pipette mit dem Neurotransmitter und Farbstoff enthaltenden Lösung und legen Sie sie in das Bad (ACSF). </li><li> Kompensieren Sie die Kapazität (Abbildung 3). In der Regel sehr scharf Pipetten haben eine höhere Kapazität als diejenigen stumpf. </li><li> Überprüfen Sie den Widerstand der Pipette: Der Mikro-Iontophorese Verstärker verwendet hier eine build-in Funktion für die Messung der Pipette Widerstand. Es erinnert an kurzen rechteckigen Testpulse, die mit einem Standard-Oszilloskop oder einem A / D-Karte mit einem Computer verbunden mit dem Erwerb Software überwacht werden kann. Abhängig von der Form und Größe der Spitze, sollte die Spitze einen Widerstand zwischen 25 bis 90 MOhm. </li><li> Fokus auf die Spitze mit einem 60X oder 40X Wasserimmersionsobjektiv und Schalter auf Fluoreszenz-Bildgebung und, wenn möglich, zu vergrößern in. Wenn Fluoreszenzfarbstoff Lecks aus der Pipettenspitze, eine kleine positive (im Falle von gluTamate) oder negativ (im Falle von GABA, Abbildung 4) behalten Strom (&lt;0,02 uA). Wenn das nicht hilft, um die Leckage stornieren, ändern Sie die Pipette. </li><li> Tragen Sie einen starken Schritt aktuellen oder verwenden Sie die manuelle Auslösung und Überwachung der Spitze in der fluoreszierenden Bild zu sehen, ob die Lösung aus der Pipette ausgestoßen werden. Wie oben erwähnt, wird die Polarität des Stromimpulses von der Ladung des Moleküls, die angeblich ausgeworfen wird abhängig. Um Glutamat auszuwerfen ist es ein negativer Strom und für GABA ein positiver Strom (Abbildung 4). </li><li> Luftblasen in der Pipette, die Block Ausstoß von Farbstoff und Sender, durch Anlegen einer hohen Ausstoß aktuellen mehrmals gelöscht werden. </li><li> Zusammen genommen, wenn es keine sichtbare Leckage und Test Auswurf erfolgreich war, kompensieren die Kapazität und starten das Experiment. </li><li> Achtung: Seit Kapazität Entschädigung durch eine Feedback-Schaltung erreicht wird, kann diese Schaltung Überschreitung oder schwingen, wenn es overcomp istensated. Vorsichtig mit dem Rad zur Einstellung Kapazität Entschädigung. </li><li> Abhängig von der Abzieher Stabilität ist es manchmal notwendig, um die Einstellungen Abzieher von Zeit zu Zeit anpassen, da das Filament Eigenschaften verändert haben. Wenn jedoch einmal eine gute Pipette ausgebildet ist, kann es für einige Tage verwendet werden. Deshalb wird nach Fertigstellung das Experiment speichern die iontophoretisches Pipette in einem geschlossenen Behälter, ohne die Spitze. </li><li> Für das nächste Experiment füllen Sie die Pipette mit dem Neurotransmitter Lösung gelten mehrere starke Impulse Auswurftaste, um die Spitze zu löschen und dann prüfen, ob die Eigenschaften (z. B. Widerstand) wesentlich ändern. Dann kompensieren die Kapazität und mit der Pipette wieder. Verwenden Sie nicht eine einzelne Pipette mit unterschiedlichen Neurotransmitter-Lösungen. </li></ol> 4. Bereiten Sie die Rätsel Slices <ol><li> Wenn Mikro-Iontophorese zum ersten Mal verwendet wird, auf jeden Fall bereiten die Scheiben nach dem Aufbau einer zuverlässig arbeitenden Puller Programm. </li> &lt;li&gt; Perform Anästhesie und Enthauptung Verfahren in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierpflege Ihrer Institution oder Lokalbehörde. </li><li> Nach der Entfernung des Gehirns, dann in eiskalte ACSF Saccharose (siehe Protokoll 2.1). </li><li> Schneiden Sie die Region von Interesse in Scheiben entsprechender Dicke (z. B. 300 um). </li><li> Inkubieren der Scheiben in ACSF Saccharose bei 35 ° C für 30 min. Anschließend Übertragung auf einen untergetauchten Haltekammer mit normaler ACSF bei Raumtemperatur. </li><li> Während der Vorbereitung und Experiment carbogenize die ACSF rund um die Scheiben mit 95% O 2, 5% CO 2. </li></ol> 5. Stellen Sie eine Whole-cell Recording <ol><li> Positionieren Sie die Pipette Iontophorese (s) bereits in der Nähe der Scheibe Oberfläche vor dem Patchen einer Zelle, um dauerhafte Positionierung zu vermeiden, nach Gründung der whole-cell-Modus. </li><li> Ziehen Sie einen niedrigen Widerstand Patch-Pipette (3 - 5 mOhm), füllen Sie es mit der dye enthält interne Lösung und gelten positiven Druck auf die Pipette (30 - 60 mbar). </li><li> Geben Sie das Bad und den Ansatz der Zelle unter visuelle Führung (Infrarot Dodt Kontrast oder Zwei-Photonen-Gradienten kontrastreiches Bild). </li><li> Überwachen Sie die Pipette Widerstand mit einem Test-Impuls (zB -10 mV, 20 ms) in Voltage-Clamp-Modus. Beim Berühren des Gewebes korrigieren Sie die Offset-Spannung. </li><li> Nähern Sie die Zelle, und schieben Sie die Pipettenspitze in es, bis ein &quot;Grübchen&quot; ist deutlich zu erkennen. Sofort den Druck der Pipette, gelten 40 - 60 mbar Unterdruck und schalten Sie das Membranpotential auf -65 mV. </li><li> Wenn die Haltestromwert Werte unter 100 pA erreicht, lassen Sie die Unterdruck. </li><li> Nach dem Aufbau einer giga Dichtung (Widerstand&gt; 1 G), Bruch der Membran mit einem kurzen, starken Sog auf die Pipette oder kurze Überkompensation der Kapazität Entschädigung Schaltung. </li><li> Je nachdem, welcher Modus (Spannung oder Strom Klemme) ist erforderlichfür die experimentelle Design, angemessen zu kompensieren. </li><li> Start, um den iontophoretisches Pipette in seine endgültige Position zu bringen. Wenn eine genauere Beschreibung, wie man erfolgreich durchführen Patch-Clamp-Aufnahmen benötigt wird, gibt es mehrere ausgezeichnete Leitlinien verfügbar 18,19. </li></ol> 6. Legen Sie die Pipette und Iontophoretische generieren Postsynaptische Iontophoretische Potential <ol><li> Im Allgemeinen kann iontophoretischen Ereignissen an definierten Stellen in Abhängigkeit von der gewünschten Experiment zum Beispiel bei einer spiny Dendriten Glutamat Mikro-Iontophorese, bei der dendritischen Welle Soma oder Axon Anfangsstück für GABA Mikro-Iontophorese hervorgerufen werden. </li><li> Nähern Sie die Zelle bis zu etwa 1 um Distanz, ohne es zu berühren. Nach Erreichen der Position von Interesse ist es entscheidend, dass keine Neurotransmitter ausläuft und daß die Pipette Kapazität vollständig kompensiert. </li><li> Wenn Annäherung der Zelle mit einem Glutamat gefüllt iontophoretischen pipette bewirkt nachweisbar Depolarisation des Membranpotentials, passen Sie die behalten, wenn möglich, Strom, oder ändern Sie die Pipette. </li><li> Bewerben kurzen negativen Stromimpulse, beginnend bei Null und erhöhen die aktuelle systematisch (z. B. von 0,1 bis 0,4 ms, 0,01 bis 1 uA Impulse). Dies hilft, um herauszufinden, in welchem ​​Bereich die aktuellen iontophoretisches die gewünschten Antworten evoziert in der spezifischen experimentellen Aufbaus. </li><li> Wenn es keine Reaktion nachweisbar, heben Sie die Pipette mehreren hundert Mikrometern und wenden Sie einen starken Auswurf Strom (&gt; 0,1 uA), um die Spitze zu reinigen. Stellen Sie die Kapazität Entschädigung, nähern sich die Zelle, und versuchen Sie es erneut. </li><li> Wenn es immer noch keine Antwort, reduzieren Sie die aktuelle behalten. Seien Sie sehr vorsichtig mit den DFÜ-Einstellungen da dieses Verfahren unkontrollierte Freisetzung von Neurotransmittern führen kann. Daher überwachen ständig die Aufnahme zu den jeweiligen Änderungen des Membranpotentials zu erkennen. </li><li> Wenn es schwierig, GABAergic Ereignisse zu erkennen ist, kann es hilfreich sein, eine Verwendungn interne Lösung Zusammensetzung was in einem hohen Cl - treibende Kraft. Um dies zu erreichen, reduzieren Sie die Cl - Konzentration in der Pipette Lösung (siehe Abschnitt 2.6-Protokoll.). Dies wird in größeren GABAergic Ereignissen an Ruhemembranpotenzial aufgrund einer höheren treibende Kraft führen. </li><li> Alternativ injizieren lange Stromstufen was Membranpotential von -100 mV Chancen auf -48 mV (8C). Mit diesem Protokoll die Cl - treibende Kraft bei hyperpolarisierte Potentiale verursacht einen depolarisierenden GABA Reaktion erhöht. </li><li> Es ist auch möglich, den Schritt Strominjektion Protokoll verwenden, um die Umkehrung des evozierten Potentials Ereignisse, die die GABA-erge Art der Ereignisse zu bestimmen hilft zu bestimmen. Austritt von GABA ist schwerer zu erkennen als Leckage von Glutamat. In diesem Fall kann eine ständige Überwachung der Eingangswiderstand helfen, wenn die GABA Pipettenspitze nähert. Wenn der Eingang Widerstand abnimmt, nimmt die aktuelle behalten kann be erhöht oder eine andere Pipette verwendet werden. </li><li> Als Kontrolle Experimente für Glutamat Iontophorese, empfehlen wir einen Ca 2 +-Imaging Experiment mit 200 uM OGB-1 und keine EGTA in der Pipette Lösung für lokale Calciumeinstrom visualisieren, die möglicherweise durch auslaufende Glutamat verursacht werden. </li><li> In der Regel, um eine stabile Reaktion zu erzielen, ist es sehr wichtig, eine mechanisch stabile Pipette Drift mit der Zeit zu vermeiden. Drift kann durch Temperaturschwankungen verursacht werden, daher empfiehlt es sich, auf dem Gerät mindestens eine halbe Stunde wechseln, bevor die Messungen thermische Drift zu vermeiden. Achten Sie darauf, gute Dichtungen der Kartusche in die Pipette Halter verwenden und die Spitze ist wirklich fixiert. Der Halter selbst kann zusätzlich mit Teflon-Band befestigt werden, außerdem sicher sein, dass es keine Spannungen an den Kabeln aus dem headstage oder Manipulator, der auch eine potenzielle Quelle der Drift. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Hier erklären wir, wie man schnell Mikro-Iontophorese von Neurotransmittern gelten synaptischen Integration auf Dendriten zu untersuchen. Diese Technik wurde erfolgreich eingesetzt, um glutamatergen und GABAergen synaptischen Übertragung in verschiedenen Hirnregionen in vitro und in vivo zu untersuchen 9,20-22. Micro-Iontophorese ist seit mehr als 60 Jahren verwendet worden, aber in den frühen Jahren war es meist verwendet, um entweder lokal gelten Neurotransmittern und Drogen bei langsam...

Neuronen im zentralen Nervensystem erhalten eine Vielzahl von synaptischen Eingänge auf ihren dünnen und verzweigten dendritischen Prozesse 1. Es sind die meisten der exzitatorischen dendritischen Eingänge glutamatergen Synapsen vermittelt. Diese Synapsen in einem räumlich verteilten Weise aktiviert werden, was zu postsynaptischen lineare Integration von exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (EPSP). Wenn die Synapsen gleichzeitig und in räumlicher Nähe auf der Dendriten aktiviert sind, können diese exzitatorischen Eingänge supra-linear integriert werden und erzeugen dendritische Dornen 2-5. Darüber hinaus hängt die Integration von exzitatorischen Eingänge von der Lage des Eingangs auf die dendritische Struktur. Signale, die am distalen Büschel Region ankommen sind viel stärker gedämpft als proximalen Eingänge aufgrund Kabel Filterung 6. Im Hippocampus, werden entfernte Eingänge zu den apikalen Dendriten Büschel durch eine andere Hirnregion als die auf proximalen dendri erzeugttes 7. Eine spannende Frage ist daher, wie synaptische Input von verschiedenen dendritischen Fächer verarbeitet und wenn dendritischen Integration regelt den Einfluss dieser geschichteten Eingänge auf neuronale Aktivität in unterschiedlicher Weise. Nicht nur die funktionellen Eigenschaften, morphologische Merkmale des Dendriten, sind der Ort und die Clusterbildung der Eingänge, die die dendritische Integration von exzitatorischen Eingänge, die auch die zusätzliche hemmende Eingänge von GABAergen Terminals bestimmen maßgeblich die Wirksamkeit der glutamatergen Synapsen 8,9. Diese verschiedenen Aspekte der synaptischen Integration lässt sich ideal mit untersucht werden Neurotransmitter Mikro-Iontophorese, die räumlich definierte Anwendung verschiedener Neurotransmitter ermöglicht dendritischen Domänen. Wir zeigen hier, wie man erfolgreich etablieren Mikro-Iontophorese von Glutamat und GABA um das Signal Integration in Neuronen zu untersuchen. Für diese Anwendung, spitzenhohe Beständigkeit Pipetten mit konzentrierter Neurotransmitter Lösungen gefüllt werden. Diese Pipetten sind in der Nähe der äußeren Membran der Zelle, wobei die Neurotransmitter-Rezeptoren befinden positioniert. Eine gute Visualisierung der dendritischen Äste erforderlich. Dies wird am besten durch Fluoreszenzfarbstoffe, die über der Patch-Pipette eingeführt werden. Dann wird eine sehr kurze (&lt;1 ms) Stromimpuls (im Bereich 10 - 100 nA) verwendet wird, um die geladenen Neurotransmittermolekülen auszuwerfen. Mit diesen kurzen Pulsen und effektive Kapazität Kompensation kann postsynaptischen Potentiale oder Ströme mit hoher zeitlicher und räumlicher Präzision, die die Lage des exzitatorischen Eingang genau bekannt ist bedeutet hervorgerufen werden. Glutamate Mikro-Iontophorese kann Synapsen in einem definierten Radius, der kleiner als 6 um, wie hier (1 9) gezeigt wird, zu aktivieren, sondern es ist auch möglich, einzelne Synapse Auflösung 10-12 zu erreichen. Heine, M., et al </em&gt; zeigte, dass die räumliche Auflösung des schnellen Mikro-Iontophorese auch eingestellt werden, um Größen unterhalb 0,5 um, die kleiner als Messfelder regelmäßig mit zwei Photonen Uncaging von Glutamat 13 erreicht, zu beschmutzen. Mit schnellen Mikro-Iontophorese ist es leicht möglich, zwei oder mehr iontophoretisches Pipetten verwenden und legen Sie sie in verschiedenen, auch weit entfernte Punkte auf der dendritischen Baum. Auf diese Weise läßt sich der Einbau von exzitatorischen Ereignisse, einschließlich der aus den verschiedenen Wegen, untersucht werden. Es ist auch möglich, eine Glutamat und GABA gefüllten Pipette iontophoretischen gleichzeitig verwenden. Auf diese Weise wird die Wirkung von GABA-erge Hemmung an verschiedenen Orten relativ zu der exzitatorischen Eingang (on-Pfad, außerhalb des Weges Hemmung) untersucht werden können. Auch die Auswirkungen der Hemmung durch Interneurone auf bestimmte neuronale Domains, wie distalen Dendriten, Soma oder Axonen 14, untersucht mit GABA Iontophorese werden. In kultivierten Neuronen, bietet schnellen Mikro-Iontophorese die Möglichkeit, Investigate einzelne Synapse Verteilung und die elementaren Aspekte der Kommunikation von Synapsen in Neuronen in viel mehr Details 10,11. In diesem Artikel zeigen wir im Detail, wie Glutamat und GABA Iontophorese für den Einsatz in akuten Hirnschnitten, die Untersuchung synaptischer Integration von erregenden und hemmenden Eingänge ermöglicht in Abhängigkeit der Eingabe Lage, Eingang Stärken und Timing, allein oder im Zusammenspiel zu etablieren. Wir weisen darauf hin, die Vorteile und Grenzen dieser Technik und wie man erfolgreich beheben.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin)</td>
			<td>LaVision Biotec, Bielefeld, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon laser scanning microscope Ultima IV</td>
			<td>Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser</td>
			<td>Chameleon Ultra II, Coherent</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X Objective, NA 0.9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope</td>
			<td>TILLPhotonics, Gr&auml;felfing, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator</td>
			<td>TILLPhotonics, Gr&auml;felfing, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-iontophoresis system MVCS-02</td>
			<td>NPI Electronics, Tamm, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter puller P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Company, Novato, CA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments (150 GB F 8P)</td>
			<td>Science Products, Hofheim, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 hydrazide</td>
			<td>Molecular Probes life technologies</td>
			<td>A-10436</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Molecular Probes life technologies</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8415</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5835</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09137.1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09108.1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast micro-iontophoresis of glutamate and gaba: a useful tool to investigate synaptic integration

Eines der grundlegenden Interessen in den Neurowissenschaften ist es, die Integration von erregenden und hemmenden Eingänge entlang der sehr komplexen Struktur der dendritischen Baumes, die schließlich führt zu neuronalen Ausgang der Aktionspotentiale am Axon verstehen. Der Einfluss verschiedener räumlicher und zeitlicher Parameter des spezifischen synaptischen Eingang neuronale Ausgang wird derzeit untersucht, z. B. den Abstand Dämpfung von dendritischen Eingänge, die ortsabhängige Wechselwirkung von räumlich getrennten Eingängen der Einfluss GABAergig Hemmung exzitatorischen Integration linearen und nichtlineare Integration Modi und vieles mehr. Mit schnellen Mikro-Iontophorese von Glutamat und GABA ist es möglich, genau zu untersuchen, die räumliche und zeitliche Integration der glutamatergen Anregung und GABAergen Hemmung. Critical technischen Anforderungen entweder eine ausgelöste Leuchtstofflampe, Leuchtdiode (LED) oder eine Zwei-Photonen-scanning Mikroskop zu dendritischen Zweigen, ohne dabei signifikante Foto-Schädigung des Gewebes sichtbar zu machen. Weiterhin ist es sehr wichtig, eine Mikro-Verstärker Iontophorese, das eine schnelle Kompensation der Kapazität hohe Pipetten ermöglicht haben. Ein weiterer entscheidender Punkt ist, dass kein Sender unfreiwillig durch die Pipette während des Experiments veröffentlicht. Einmal eingerichtet, wird diese Technik zuverlässige und reproduzierbare Signale mit einer hohen Spezifität Neurotransmitter und Lage geben. Im Vergleich zu Glutamat und GABA Uncaging, ermöglicht eine schnelle Iontophorese mit beiden Sendern gleichzeitig aber zu sehr weit entfernten Orten ohne Einschränkung des Sichtfeldes. Es gibt auch Vorteile gegenüber Schwerpunkt elektrische Stimulation von Axonen: mit Mikro-Iontophorese die Lage des Eingangs Website ist definitiv bekannt und es ist sicher, dass nur der Neurotransmitter von Interesse freigesetzt wird. Allerdings ist zu berücksichtigen, dass mit Mikro-Iontophorese werden nur diePostsynapse aktiviert und präsynaptischen Aspekte der Freisetzung von Neurotransmittern werden nicht aufgelöst. In diesem Artikel zeigen wir Ihnen, wie Sie Mikro-Iontophorese in Hirnschnitt Experimente.

Ein einfacher Ansatz, um die räumliche Ausdehnung der Iontophorese zu bestimmen ist, um den iontophoretischen Pipette schrittweise von Dendriten zurückzuziehen, während die ausgeworfene Glutamat konstant. Wir fanden, dass die räumliche Ausdehnung eines Mikro-iontophoretischen Stimulation einen Durchmesser von etwa 12 um (Fig. 1, Radius) hat. Wie tief in das Gewebe der Iontophorese verwendet werden kann, hängt von der Steifigkeit der Pipette. Doch die iontophoretisches Pipetten für Experimente in S...

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Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

In diesem Artikel stellen wir schnell Mikro-Iontophorese von Neurotransmittern als eine Technik, um die Integration von postsynaptischen Signale mit hoher räumlicher und zeitlicher Präzision zu untersuchen.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

fast-micro-iontophoresis-glutamate-gaba-useful-tool-to-investigate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.4K Aufrufe.  University of Bonn. In diesem Artikel stellen wir schnell Mikro-Iontophorese von Neurotransmittern als eine Technik, um die Integration von postsynaptischen Signale mit hoher räumlicher und zeitlicher Präzision zu untersuchen.

Serie: Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

An easy and convenient method to determine the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons is described. This technique enables one to investigate the function of the electrical synapses between neurons in the intact retina under different illumination conditions and at different times of the day and night.

Cut-loading: ein nützliches Werkzeug für die Prüfung des Umfangs der Gap Junction Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Forschung

Neurowissenschaften

MPI CyberMotion Simulator: Implementation of a Novel Motion Simulator to Investigate Multisensory Path Integration in Three Dimensions

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. Humans can do path integration based exclusively on visual 2-3, auditory 4, or inertial cues 5. However, with multiple cues present, inertial cues - particularly kinaesthetic - seem to dominate 6-7. In the absence of vision, humans tend to overestimate short distances (&lt;5 m) and turning angles (&lt;30&deg;), but underestimate longer ones 5. Movement through physical space therefore does not seem to be accurately represented by the brain.
Extensive work has been done on evaluating path integration in the horizontal plane, but little is known about vertical movement (see 3 for virtual movement from vision alone). One reason for this is that traditional motion simulators have a small range of motion restricted mainly to the horizontal plane. Here we take advantage of a motion simulator 8-9 with a large range of motion to assess whether path integration is similar between horizontal and vertical planes. The relative contributions of inertial and visual cues for path navigation were also assessed.
16 observers sat upright in a seat mounted to the flange of a modified KUKA anthropomorphic robot arm. Sensory information was manipulated by providing visual (optic flow, limited lifetime star field), vestibular-kinaesthetic (passive self motion with eyes closed), or visual and vestibular-kinaesthetic motion cues. Movement trajectories in the horizontal, sagittal and frontal planes consisted of two segment lengths (1st: 0.4 m, 2nd: 1 m; &plusmn;0.24 m/s2 peak acceleration). The angle of the two segments was either 45&deg; or 90&deg;. Observers pointed back to their origin by moving an arrow that was superimposed on an avatar presented on the screen.
Observers were more likely to underestimate angle size for movement in the horizontal plane compared to the vertical planes. In the frontal plane observers were more likely to overestimate angle size while there was no such bias in the sagittal plane. Finally, observers responded slower when answering based on vestibular-kinaesthetic information alone. Human path integration based on vestibular-kinaesthetic information alone thus takes longer than when visual information is present. That pointing is consistent with underestimating and overestimating the angle one has moved through in the horizontal and vertical planes respectively, suggests that the neural representation of self-motion through space is non-symmetrical which may relate to the fact that humans experience movement mostly within the horizontal plane.

An efficient way to gain insight into how humans navigate themselves in three dimensions is described. The method takes advantage of a motion simulator capable of moving observers in ways unattainable by traditional simulators. Results confirm that movement in the horizontal plane is underestimated, while vertical movement is overestimated.

MPI CyberMotion Simulator: Implementierung eines neuartigen Motion Simulator zu Multisensorische Pfadintegration in drei Dimensionen erforschen

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Automatisierte Quantifizierung der Fluoreszenz-in Synaptic<em&gt; C elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Die Ableitung der zeitliche Verlauf der Glutamate Ausverkauf mit Dekonvolutionsanalyse von Astrozytäre Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell surface mobility1-7. To study receptor cell surface localization and endocytosis, the technique described here combines the use of fluorescent &#945;-bungarotoxin with cells expressing constructs containing an &#945;-bungarotoxin (Bgt) binding site (BBS). The BBS (WRYYESSLEPYPD) is based on the &#945; subunit of the muscle nicotinic acetylcholine receptor, which binds Bgt with high affinity8,9. Incorporation of the BBS site allows surface localization and measurements of receptor insertion or removal with application of exogenous fluorescent Bgt, as previously described in the tracking of GABAA and metabotropic GABAB receptors2,10. In addition to the BBS site, we inserted a pH-sensitive GFP (pHGFP11) between amino acids 4 and 5 of the mature GABAAR subunit by standard molecular biology and PCR cloning strategies (see Figure 1)12. The BBS is 3&#39; of the pH-sensitive GFP reporter, separated by a 13-amino acid alanine/proline linker. For trafficking studies described in this publication that are based on fixed samples, the pHGFP serves as a reporter of total tagged GABAAR subunit protein levels, allowing normalization of the Bgt labeled receptor population to total receptor population. This minimizes cell to cell Bgt staining signal variability resulting from higher or lower baseline expression of the tagged GABAAR subunits. Furthermore the pHGFP tag enables easy identification of construct expressing cells for live or fixed imaging experiments.

Using an &amp;#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Here we demonstrate the use of fluorescent Alexa dye coupled to &#945;-bungarotoxin to measure GABA A receptor surface localization and endocytosis in hippocampal neurons. Through the use of constructs bearing a short extracellular tag that binds &#945;-bungarotoxin, analysis of plasma membrane protein endocytic trafficking can be achieved.

Mit Hilfe eines α-Bungarotoxin Binding Site Tag an GABA A-Rezeptor-Membranlokalisierung und Handel Studieren

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In particular, endogenously-generated network activity, which strongly varies as a function of the state of vigilance, significantly modulates neuronal computation. To investigate how different spontaneous cerebral dynamics impact single neurons&#39; integrative properties, we developed a new experimental strategy in the rat consisting in suppressing in vivo all cerebral activity by means of a systemic injection of a high dose of sodium pentobarbital. Cortical activities, continuously monitored by combined electrocorticogram (ECoG) and intracellular recordings are progressively slowed down, leading to a steady isoelectric profile. This extreme brain state, putting the rat into a deep comatose, was carefully monitored by measuring the physiological constants of the animal throughout the experiments. Intracellular recordings allowed us to characterize and compare the integrative properties of the same neuron embedded into physiologically relevant cortical dynamics, such as those encountered in the sleep-wake cycle, and when the brain was fully silent.

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

This procedure performs long-lasting in vivo intracellular recordings from single neurons during physiologically relevant cerebral states and after complete abolition of ongoing electrical activities, resulting in an isoelectric brain state. The physiological constants of the animal are carefully monitored during the transition to the artificial comatose condition.

Induktion einer Isoelektrischer Gehirn Staat die Auswirkungen der Endogene synaptische Aktivität auf neuronaler Erregbarkeit zur Untersuchung<em&gt; In Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, and anxiety. Traditionally, microdialysis has been the most common (lauded) technique to examine neurotransmitter changes that occur in these disorders. But because microdialysis has the ability to measure slow 1-20 minute changes across large areas of tissue, it has the disadvantage of invasiveness, potentially destroying intrinsic connections within the brain and a slow sampling capability. A relatively newer technique, the microelectrode array (MEA), has numerous advantages for measuring specific neurotransmitter changes within discrete brain regions as they occur, making for a spatially and temporally precise approach. In addition, using MEAs is minimally invasive, allowing for measurement of neurotransmitter alterations in vivo. In our laboratory, we have been specifically interested in changes in the neurotransmitter, glutamate, related to Alzheimer's disease pathology. As such, the method described here has been used to assess potential hippocampal disruptions in glutamate in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Briefly, the method used involves coating a multi-site microelectrode with an enzyme very selective for the neurotransmitter of interest and using self-referencing sites to subtract out background noise and interferents. After plating and calibration, the MEA can be constructed with a micropipette and lowered into the brain region of interest using a stereotaxic device. Here, the method described involves anesthetizing rTg(TauP301L)4510 mice and using a stereotaxic device to precisely target sub-regions (DG, CA1, and CA3) of the hippocampus.

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer&#039;s Mouse Models

Here, we describe the setup, software navigation, and data analysis for a spatially and temporally precise method of measuring tonic and phasic extracellular glutamate changes in vivo using enzyme-linked microelectrode arrays (MEA).

Enzym-basierte Biosensoren Mit Tonic und Phasic Glutamate in der Alzheimer-Maus-Modellen zu messen

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

In VivoKultivierung-wie Murine Astrozyten über das schnelle, einfache und kostengünstige AWESAM-Protokoll

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

Eine Hochdurchsatz-Kalzium-Flux-Assay, NMDA-Rezeptoren mit Sensibilität für Glycin/D-Serin und Glutamat zu studieren

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...