Autoren danken Frau Risa Otsuka für technische Unterstützung und helfen Experimente. Diese Arbeit wurde teilweise durch das Ministerium für Bildung, Wissenschaft, Sport und Kultur, Grant-in-Aid for Young Scientists (B), 2010, 22700476 und SUZUKEN Memorial Foundation 2010 für KT und diese Studie wurde vom Forschungs-und Entwicklungszentrum der unterstützten Die Next-Generation Integrierte Simulation lebender Materie, ein Teil der Entwicklung und Nutzung der Next-Generation-Supercomputer-Projekt von MEXT, und zum Teil durch JST ERATO Suematsu Gas Biologie-Projekt.

1. Beschriften Erythrozyten mit Fluoresceinisothiocyanat Isomer I (FITC) Alle experimentellen Protokolle verwendet, wir wurden von der Animal Care Committee der Keio University School of Medicine zugelassen. <ol><li> Anesthetize ein Donor-Mäusen, und nach Herstellung einer Celiotomie Einschnitt zurückzuziehen Vollblut aus der Vena cava inferior mit einer 1-ml-Spritze mit kleinen Menge von Heparin. Die Maus wurde sofort von Natriumpentobarbital Injektion (100 mg / kg ip) euthanasiert. </li><li> Waschen des Vollbluts zweimal mit PBS (pH 7,4) durch Zentrifugation für 5 min bei 400 g in einem geschwungen-Rotor. </li><li> Man löst 10 mg FITC in 5 ml 100 mM Na 2 HPO 4 und filtern mit einer Membran mit 0,22 um Poren. </li><li> In einem Reagenzglas zu mischen 1 ml der FITC-Lösung mit 0,15 ml 3 mM Glucose, 0,25 ml von 180 mM NaH 2 PO 4 und 1,5 ml 100 mM Na 2 HPO 4. 0,2 ml der RBC Pellet, und tippen Sie auf das Rohr zum Mischen. </li><li> Halten Sie das Rohr für 2 Stunden bei 4 ° C und dann waschen Sie die gefärbten Erythrozyten in PBS zweimal. </li><li> Eine kleine Menge des RBC-Suspension auf einem Objektträger Gras und sehen, ob die RBCs gesund aussehen (dh, dass ihre Form und Größe normal sind) und dass die Fluoreszenzintensität ist ausreichend. </li><li> Hängen Sie das 0,1 ml Erythrozyten in 0,9 ml PBS bei pH 7,4, und halten Sie die Suspension bei 4 ° C bis Injektion. </li></ol> 2. Herstellung von Sauerstoff-empfindlichen Farbstoff <ol><li> Man löst 500 mg BSA in 10 ml PBS bei pH 7,4. </li><li> Zugabe von 30 mg Pd (II)-meso-Tetra (4-carboxyphenyl) porphin (Pd-TCPP) an die BSA-Lösung und über Nacht gerührt. </li><li> (Optional) Auszug BSA-gebundenen Pd-TCPP durch Schwerkraft-Flow-Chromatographie oder eine Spin-Säule, um sie von freien Pd-TCPP zu trennen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Lösung zur Entfernung ungelöster Pd-TCPP, und filtern Sie den Überstand mit einem Membranfilter mit 0,22-um-Poren. &lt;/ Li&gt; <li> Shop 1-ml-Aliquots in Röhrchen bei -20 ° C Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. </li></ol> 3. Tierische Vorbereitung <ol><li> Für mikroskopische Beobachtung der Mikrozirkulation bereiten eine Kunststoffplatte mit einem Loch von 20 mm im Durchmesser, und Band ein 30-mm-Quadrat-Quadrat Deckglas über dem Loch. </li><li> Anesthetize eine Maus, entfernen Sie das Fell und die Haut prep. Setzen Sie ein Katheter in den Schwanz vergeblich auf Droge Injektion unter Verwendung einer 30 G Nadel verbunden mit einem 10-cm-Polyethylen (PE 10) Katheter mit heparinisierter PBS gefüllt. </li><li> Nach Medianschnitt, verlängern eine Haupt-Läppchen der Leber auf der Kunststoffplatte, und platzieren Sie den Mauszeiger in Brustlage. </li><li> Bereiten Sie kleine Zettel mit Küche Wrap (3 mm x 8 mm) und Kachel sie um den Rand des Leberlappens zu hemmen bewegt von der Leber mit der Atmung und halten sie vor dem Austrocknen. </li><li> Beachten Sie die hepatischen Mikrozirkulation unter einem Mikroskop (mit Durchlicht), und bestätigen, dass die blood Flow hat keinen Stillstand im Sichtfeld für mindestens 15 min. </li><li> Injizieren Sie langsam 0,2 ml fluoreszenzmarkierten Erythrozyten für den Blutfluss Beobachtung oder 0,2 ml Pd-TCPP Lösung für pO 2-Messung. Dieser Betrag von FITC-markierten Erythrozyten wird für 1/50 von allen RBCs in Umlauf in der visualisierten Bereich ausmachen. </li></ol> 4. Blood Flow Visualization <ol><li> Erregen die FITC durch Bestrahlung mit Quecksilberlampe Licht, das durch ein Bandpassfilter (450-490 nm) 1 bestanden hat. </li><li> Datensatz das Fluoreszenzbild mit einer CCD-Kamera. </li></ol> 5. pO 2-Messung Pd-TCPP Phosphoreszenz ist relativ schwach und sollte mit einem hochempfindlichen Detektor nachgewiesen werden. Alle Experimente müssen in einem dunklen Raum durchgeführt werden. <ol><li> Die Absorptionspeaks von Pd-TCPP sind bei 410 nm und 532 nm, so dass die zweiten harmonischen Wellenlänge 532 nm für die Anregung empfohlen. YAG-Pulslaser 2: Diese Wellenlänge kann durch einen Nd erzeugt werden. </li><li> Führen Sie den Strahl des Nd: YAG Laser in den entsprechenden Anschluss auf dem inversen Mikroskop, und stellen Sie den Lichtpunkt in eine zentrale Position in der Brennebene. Die räumliche Auflösung hängt von der Laserfleckgröße, die durch das Passieren des Strahls durch eine Lochblende geändert wird. </li><li> Um die Phosphoreszenz erkannt, angeschlossen ein Langpaßfilter (&gt; 620 nm) und eine Photovervielfacherröhre (PMT) mit dem anderen Anschluss des Mikroskops. Die PMT sollten sensibel auf roten Wellenlängen, besonders um 700 nm liegt. </li><li> Probieren Sie die Phosphoreszenz-Signal (500 Punkte bei 200 kHz abgetastet) und berechnen Sie die Zeitkonstante des Zerfalls durch den Einbau einer e-Funktion, um den Zerfall. </li><li> Für die Kalibrierung bereiten zwei Satz von Proben mit Pd-TCPP-Lösung mit pO 2 150 mmHg und 0 mmHg. Fügen Natrium Dithionit 1% im Volumen zu probieren, um Abwesenheit von Sauerstoff zu produzieren. Halten Sie den pH-Wert der Proben bei 7,4 und die Temperaturtur bei 37 ° C während der Kalibrierung. </li><li> Befestigen Sie die Stern-Volmer-Konstante k und q Sauerstoff-freien Lumineszenzabklingzeit τ 0 in der Gleichung (1) 3. In unserem Fall, in dem Pd-TCPP Lösungen bei 37 ° C und einem pH von 7,4, k q 374 mmHg -1 s -1 und τ 0 beträgt 0,74 ms. Diese Messung Parameter hängen von der Ausrüstung (zB Laser, Detektor, anderen optischen Geräten) und dem Signalverarbeitungsverfahren, so dass die Kalibrierung in jedem Messsystem 4 benötigt. τ 0 / τ = ​​1 + k q • τ 0 • pO 2 (1) </li><li> Stellen Sie die Maus auf der Platte auf dem Mikroskoptisch, beobachten Sie die hepatische Mikrozirkulation, und passen Sie die Position des Ziels microvessel bis zu dem Punkt des Laserspots. </li></ol> 6. Hepatitis-Modell <ol><li> Schnelle Mäuse mit freiem Zugang zu Wasser über Nacht. </li><li> Bereiten Sie ein20 mg pro ml Lösung von Acetaminophen (APAP) in DMSO. </li><li> Injizieren Sie es intraperitoneal bei 1 ml/100 g Körpergewicht (dh 200 mg / kg KG). Nach der Injektion kann die Maus den freien Zugang zu Futter und Wasser 5 gegeben werden. </li><li> 24 Stunden nach Injektion, die Maus zu betäuben und setzen die Leber, indem eine Medianschnitt. Wenn Hepatitis erreicht wird, wird Nekrose in der Region perizentralen gut sichtbar für das bloße Auge. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Beispiel Bilder der hepatischen Mikrozirkulation in 1, wobei (a) ist eine Durchlicht-Bild und (b) ist ein Fluoreszenz-Bild zu sehen. Individuelle FITC-markierten Erythrozyten werden in der Video-Film beobachtet und Portal Venolen, Sinusoide und zentrale Blutgefäße werden durch den Blutfluss Richtungen anerkannt. Wie in 2 gezeigt, war der Laserspot Bestrahlen einer zentralen Venole durch eine Objektivlinse x100 approximately 10 m im Durchmesser. Intravaskuläre pO 2 in der hepatischen Mikrozirkulation wurde bei männlichen C57BL / 6 Mäusen gemessen, und Abbildung 3 (a) zeigt die Beziehungen zwischen pO 2 und Gefäßdurchmesser in zentralen Portal und Venolen. Der pO 2-Gradienten von Portal zur zentralen Venolen zeigt an, dass Erythrozyten geben Sauerstoff effizient, während sie durch Sinusoide. Wie in Abbildung 3 (b) gezeigt, betrug die durchschnittliche pO2 59,8 mmHg in Pfortadergefäße, 48,2 mmHg in Sinusoide, und 38,9 mmHg in zentralen Venolen. Wenn wir eine akute Hepatitis produziert durch Einspritzen von APAP intraperitoneal, intravaskuläre pO 2 wurde signifikant in jedem Teil der hepatischen Mikrozirkulation erhöht: p &lt;0,05 im Pfortader-und p &lt;0,01 in Sinusoide und zentrale Venen (Abbildung 3 (c)). <img src="/files/ftp_upload/3996/3996fig1.jpg" alt="1" /> 1. Schwachen Vergrößerungsmodus iEs werden Magier hepatischen Mikrozirkulation mit (a) übertragenen Lichts und (b) Fluoreszenz. <img src="/files/ftp_upload/3996/3996fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Das Bild der Laserspot Bestrahlen einer gezielten zentralen Venole für pO 2-Messung. <img src="/files/ftp_upload/3996/3996fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. PO 2 Gradienten in hepatischen Mikrozirkulation von gesunden Kontroll-Mäusen und von Mäusen mit Paracetamol-induzierten Leberschädigung. (A) zeigt pO 2 im Vergleich zu Gefäßdurchmesser für Portal Venolen (PV) und zentralen Venolen (CV), und (b) zeigt die Sauerstoff-Gradient von PV CV über Sinusoide (S). Der pO 2 Differenz zwischen PV und CV spiegelt den Sauerstoffverbrauch von Hepatozyten oder anderen Parenchymzellen. (C) zeigt, dass bei Hepatitis Bedingungen durch APAP Verwaltung induziert, pO 2 deutlich wurde in PV, S und CV und der pO 2 erhöhtGefälle verringert, was darauf hinweist, dass der Sauerstoffverbrauch der Leber beeinträchtigt wurde.

<ol>
	<li>Ishikawa, M., Sekizuka, E., Shimizu, K., Yamaguchi, N., Kawase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+RBC+velocities+in+the+rat+pial+arteries+with+an+image-intensified+high-speed+video+camera+system.">Measurement of RBC velocities in the rat pial arteries with an image-intensified high-speed video camera system.</a> Microvasc. Res. 56, 166-172 (1998).</li><li>Tsukada, K., Sekizuka, E., Oshio, C., Tsujioka, K., Minamitani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+velocity+and+oxygen+tension+measurement+in+cerebral+microvessels+by+double-wavelength+photoexcitation.">Red blood cell velocity and oxygen tension measurement in cerebral microvessels by double-wavelength photoexcitation.</a> J. Appl. Physiol. 96, 1561-1568 (2004).</li><li>Stern, O., Volmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Abklingzeit+der+Fluoreszenz.">&#220;ber die Abklingzeit der Fluoreszenz.</a> Physik. Zeitschr. 20, 183-188 (1919).</li><li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+phosphorescence:+a+novel+method+for+measuring+oxygen+distribution+in+perfused+tissue.">Imaging of phosphorescence: a novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue.</a> Science. 241, 1649-1651 (1988).</li><li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+metabolomics+reveals+ophthalmic+acid+as+an+oxidative+stress+biomarker+indicating+hepatic+glutathione+consumption.">Differential metabolomics reveals ophthalmic acid as an oxidative stress biomarker indicating hepatic glutathione consumption.</a> J. Biol. Chem. 281, 16768-16776 (2006).</li><li>Goda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+heme+oxygenase+isoforms+in+rat+liver.+Topographic+basis+for+carbon+monoxide-mediated+microvascular+relaxation.">Distribution of heme oxygenase isoforms in rat liver. Topographic basis for carbon monoxide-mediated microvascular relaxation.</a> J. Clin. Invest. 101, 604-612 (1998).</li><li>Grote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physiologie der Menschen. , 560 (1980).</li><li>Suganuma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocytes+with+T-state-stabilized+hemoglobin+as+a+therapeutic+tool+for+postischemic+liver+dysfunction.">Erythrocytes with T-state-stabilized hemoglobin as a therapeutic tool for postischemic liver dysfunction.</a> Antioxid Redox Signal. 8, 1847-1855 (2006).</li><li>Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+method+for+measurement+of+dioxygen+concentration+based+upon+quenching+of+phosphorescence.">An optical method for measurement of dioxygen concentration based upon quenching of phosphorescence.</a> J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).</li><li>Bernal, W., Auzinger, G., Dhawan, A., Wendon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+liver+failure.">Acute liver failure.</a> Lancet. 376, 190-201 (2010).</li><li>Hinson, J. A., Roberts, D. W., James, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+acetaminophen-induced+liver+necrosis.">Mechanisms of acetaminophen-induced liver necrosis.</a> Handb. Exp. Pharmacol. 169, 369-405 (2010).</li><li>Hinson, J. A., Reid, A. B., McCullough, S. S., James, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetaminophen-induced+hepatotoxicity:+role+of+metabolic+activation,+reactive+oxygen/nitrogen+species,+and+mitochondrial+permeability+transition.">Acetaminophen-induced hepatotoxicity: role of metabolic activation, reactive oxygen/nitrogen species, and mitochondrial permeability transition.</a> Drug Metab. Rev. 36, 805-822 (2004).</li><li>Lieber, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+disorders+of+alcoholism.">Medical disorders of alcoholism.</a> N. Engl. J. Med. 333, 1058-1065 (1995).</li><li>Zimmerman, H. J., Maddrey, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetaminophen+(paracetamol)+hepatotoxicity+with+regular+intake+of+alcohol:+analysis+of+instances+of+therapeutic+misadventure.">Acetaminophen (paracetamol) hepatotoxicity with regular intake of alcohol: analysis of instances of therapeutic misadventure.</a> Hepatology. 22, 767-773 (1995).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Bereitstellung von Sauerstoff zu Geweben ist eine wesentliche Rolle der Mikrozirkulation, und eine Menge Papiere beschreiben Krankheiten im Zusammenhang mit microvessel Anatomie und Rheologie 6. Leberdurchblutung ist eine Kombination von arteriellen und venösen Blut. Etwa 30% des Blutflusses zur Leber ist gut sauerstoffreiches Blut durch die Leberarterie und die andere 70%, durch die Pfortader vorgesehen ist, ist das schlecht sauerstoffreiches Blut venösen Abfluss aus der Milz und Magen-Darm-7. L...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Pd (II) meso-Tetra (4-carboxyphenyl) porphin </td><td> Frontier Scientific, Inc. </td><td> PdT790 </td></tr><tr><td> Fluoresceinisothiocyanat Isomer I </td><td> Sigma-Aldrich Co. </td><td> F7250 </td></tr><tr><td> Acetaminophen </td><td> Sigma-Aldrich Co. </td><td> A7085 </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> Bezeichnung des Geräts </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Photovervielfacherröhre </td><td> Hamamatsu Photonics KK </td><td> H10722-20 </td></tr></tbody></table>

visualization and analysis of blood flow and oxygen consumption in hepatic microcirculation: application to an acute hepatitis model

Es besteht eine erhebliche Diskrepanz zwischen Sauerstoffversorgung und-bedarf in der Leber, weil Leber Sauerstoffverbrauch ist relativ hoch, aber etwa 70% der Blutversorgung der Leber ist schlecht Pfortader Blut aus dem Magen-Darmtrakt und Milz ableiten Sauerstoff angereichert. Sauerstoff wird durch Hepatozyten Blut fließt von einem Terminal Zweig der Pfortader an eine zentrale Venole über Sinusoide geliefert, und das macht eine Sauerstoff-Gradienten in Leberläppchen. Der Sauerstoff-Gradienten ist eine wichtige physikalische Parameter, der die Expression von Enzymen vor und hinter der hepatischen Mikrozirkulation, aber das Fehlen von Techniken zur Messung von Sauerstoff Verbrauch in der hepatischen Mikrozirkulation verzögerte sich die Aufklärung der Mechanismen in Bezug auf Sauerstoff-Stoffwechsel in der Leber verbunden ist. Deshalb FITC-markierten Erythrozyten verwendet, um die hepatische Mikrozirkulation visualisieren und verwendet laserunterstützte phosphorimetry, um den Partialdruck von Sauerstoff in den Mikrogefäßen dort zu messen. Noncontact und kontinuierliche optische Messung kann quantifizieren Blutflussgeschwindigkeiten, Gefäßdurchmesser und Sauerstoff-Gradienten in Bezug auf den Sauerstoffverbrauch in der Leber. Bei einer akuten Hepatitis-Modell haben wir durch die Gabe von Paracetamol bei Mäusen beobachteten wir erhöhte Sauerstoff-Druck in beiden zentralen Portal und Venolen aber eine verminderte Sauerstoff-Gradienten in den Sinusoiden, was darauf hinweist, dass Hepatozyten-Nekrose im perizentralen Zone könnte den Sauerstoffdruck Hochschalten und Enzym-Expression beeinflussen in der periportalen Zone. Abschließend können unsere optischen Methoden zur Messung der hepatischen Hämodynamik und Sauerstoffverbrauch zeigen Mechanismen im Zusammenhang mit Lebererkrankungen.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model at JoVE.com

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Ein optisches System wurde entwickelt, um hepatischen Mikrozirkulation mit FITC-markierten Erythrozyten visualisieren und die Sauerstoff-Partialdruck in der Mikrogefäße laserunterstützte phosphorimetry messen. Diese Methode kann verwendet werden, um physiologische und pathologische Mechanismen durch die Analyse von mikrovaskulären Struktur, Durchmesser, Blutflussgeschwindigkeit, und Sauerstoff-Partialdruck zu untersuchen.

Visualisierung und Analyse des Blutflusses und der Sauerstoffverbrauch in hepatischen Mikrozirkulation: Anwendung auf eine akute Hepatitis-Modell

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

visualization-analysis-blood-flow-oxygen-consumption-hepatic

Research

JoVE Journal

Medicine

12.5K Aufrufe.  Keio University. Ein optisches System wurde entwickelt, um hepatischen Mikrozirkulation mit FITC-markierten Erythrozyten visualisieren und die Sauerstoff-Partialdruck in der Mikrogefäße laserunterstützte phosphorimetry messen. Diese Methode kann verwendet werden, um physiologische und pathologische Mechanismen durch die Analyse von mikrovaskulären Struktur, Durchmesser, Blutflussgeschwindigkeit, und Sauerstoff-Partialdruck zu untersuchen.

Serie: Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are administered specifically to the liver to induce a localised liver tumour, via mobilisation of the spleen and splitting into two, leaving intact the vascular pedicle for each half of the spleen. Lewis lung carcinoma cells that constitutively express the firefly luciferase gene (luc1) are inoculated into one hemi-spleen which is then resected 10 minutes later. The other hemi-spleen is left intact and returned to the abdomen. Liver tumour growth can be monitored by bioluminescence imaging using the IVIS whole body imaging system. Quantitative imaging of tumour growth using IVIS provides precise quantitation of viable tumour cells. Tumour cell death and necrosis due to drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This mouse model allows for investigating the mechanisms underlying metastatic tumour-cell survival and growth and can be used for the evaluation of therapeutics of liver metastasis. 

This article describes a procedure for the induction of orthotopic bioluminescent liver tumours in mice, and subsequent analysis of tumour growth confined to the liver using live whole body luminescence imaging.

Murine Bioluminescent Leber Tumor-Modell

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

Forschung

Medizin

Heterotopic Auxiliary Rat Liver Transplantation With Flow-regulated Portal Vein Arterialization in Acute Hepatic Failure

In acute hepatic failure auxiliary liver transplantation is an interesting alternative approach. The aim is to provide a temporary support until the failing native liver has regenerated.1-3 The APOLT-method, the orthotopic implantation of auxiliary segments- averts most of the technical problems. However this method necessitates extensive resections of both the native liver and the graft.4 In 1998, Erhard developed the heterotopic auxiliary liver transplantation (HALT) utilizing portal vein arterialization (PVA) (Figure 1). This technique showed promising initial clinical results.5-6 We developed a HALT-technique with flow-regulated PVA in the rat to examine the influence of flow-regulated PVA on graft morphology and function (Figure 2).
A liver graft reduced to 30 % of its original size, was heterotopically implanted in the right renal region of the recipient after explantation of the right kidney.&#160; The infra-hepatic caval vein of the graft was anastomosed with the infrahepatic caval vein of the recipient. The arterialization of the donor&#8217;s portal vein was carried out via the recipient&#8217;s right renal artery with the stent technique. The blood-flow regulation of the arterialized portal vein was achieved with the use of a stent with an internal diameter of 0.3 mm. The celiac trunk of the graft was end-to-side anastomosed with the recipient&#8217;s aorta and the bile duct was implanted into the duodenum. A subtotal resection of the native liver was performed to induce acute hepatic failure. 7
In this manner 112 transplantations were performed. The perioperative survival rate was 90% and the 6-week survival rate was 80%. Six weeks after operation, the native liver regenerated, showing an increase in weight from 2.3&#177;0.8 g to 9.8&#177;1 g. At this time, the graft&#8217;s weight decreased from 3.3&#177;0.8 g to 2.3&#177;0.8 g.
We were able to obtain promising long-term results in terms of graft morphology and function. HALT with flow-regulated PVA reliably bridges acute hepatic failure until the native liver regenerates.

Auxiliary liver transplantation provides a temporary support in acute hepatic failure, until regeneration of the failing liver. The heterotopic auxiliary liver transplantation (HALT) with portal vein arterialization (PVA) renders sufficient liver function. We developed an analogous technique in the rat, to examine the influence of the portal vein arterialization on the morphology and function of the graft.

Heterotope Hilfs Ratte Leber-Transplantation mit strömungs geregelt Pfortader Arterialisation in akutes Leberversagen

In acute hepatic failure auxiliary liver transplantation is an interesting alternative approach. The aim is to provide a temporary support until the ...

The Rabbit Blood-shunt Model for the Study of Acute and Late Sequelae of Subarachnoid Hemorrhage: Technical Aspects

Early brain injury and delayed cerebral vasospasm both contribute to unfavorable outcomes after subarachnoid hemorrhage (SAH). Reproducible and controllable animal models that simulate both conditions are presently uncommon. Therefore, new models are needed in order to mimic human pathophysiological conditions resulting from SAH.
This report describes the technical nuances of a rabbit blood-shunt SAH model that enables control of intracerebral pressure (ICP). An extracorporeal shunt is placed between the arterial system and the subarachnoid space, which enables examiner-independent SAH in a closed cranium. Step-by-step procedural instructions and necessary equipment are described, as well as technical considerations to produce the model with minimal mortality and morbidity. Important details required for successful surgical creation of this robust, simple and consistent ICP-controlled SAH rabbit model are described.

The experimental intracranial pressure-controlled blood shunt subarachnoid hemorrhage (SAH) model in the rabbit combines the standard procedures &#8212; subclavian artery cannulation and transcutaneous cisterna magna puncture, which enables close mimicking of human pathophysiological conditions after SAH. We present step-by-step instructions and discuss key surgical points for successful experimental SAH creation.

Das Kaninchen Blut-Shunt-Modell für die Untersuchung von akuten und Spätfolgen Subarachnoidalblutung: Technische Aspekte

Early brain injury and delayed cerebral vasospasm both contribute to unfavorable outcomes after subarachnoid hemorrhage (SAH). Reproducible and ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an important target for neuroprotective therapies. Although several techniques have been described to assess SCBF, they all have significant limitations. To overcome the latter, we propose the use of real-time contrast enhanced ultrasound imaging (CEU). Here we describe the application of this technique in a rat contusion model of SCI. A jugular catheter is first implanted for the repeated injection of contrast agent, a sodium chloride solution of sulphur hexafluoride encapsulated microbubbles. The spine is then stabilized with a custom-made 3D-frame and the spinal cord dura mater is exposed by a laminectomy at ThIX-ThXII. The ultrasound probe is then positioned at the posterior aspect of the dura mater (coated with ultrasound gel). To assess baseline SCBF, a single intravenous injection (400 &#181;l) of contrast agent is applied to record its passage through the intact spinal cord microvasculature. A weight-drop device is subsequently used to generate a reproducible experimental contusion model of SCI. Contrast agent is re-injected 15 min following the injury to assess post-SCI SCBF changes. CEU allows for real time and in-vivo assessment of SCBF changes following SCI. In the uninjured animal, ultrasound imaging showed uneven blood flow along the intact spinal cord. Furthermore, 15 min post-SCI, there was critical ischemia at the level of the epicenter while SCBF remained preserved in the more remote intact areas. In the regions adjacent to the epicenter (both rostral and caudal), SCBF was significantly reduced. This corresponds to the previously described &#8220;ischemic penumbra zone&#8221;. This tool is of major interest for assessing the effects of therapies aimed at limiting ischemia and the resulting tissue necrosis subsequent to SCI.

Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

Kontrastverstärkten Ultraschall-Bildgebung zur Beurteilung der Spinal Cord Blood Flow in Experimental Rückenmark-Verletzung

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

Sauerstoff-Glukose Deprivation und Reoxygenierung als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ischämie-Reperfusion Injury Modell zum Studium der Blut-Hirnschranke Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

Eine akute Retinal Modell zur Bewertung von Blut Retinal Barrier Breach und potenzielle Medikamente für die Behandlung

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Optimierte Analyse von<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Hepatosteatose

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but regardless of the approach, an in vivo model is needed to test each treatment. The pig is one of the most used large animal models for cardiovascular disease. Its heart is very similar in anatomy and function to that of a human. The ameroid placement technique creates an ischemic area of the heart, which has many useful applications in studying myocardial infarction. This model has been used for surgical research, pharmaceutical studies, imaging techniques, and cell therapies.
There are several ways of inducing an ischemic area in the heart. Each has its advantages and disadvantages, but the placement of an ameroid constrictor remains the most widely used technique. The main advantages to using the ameroid are its prevalence in existing research, its availability in various sizes to accommodate the anatomy and size of the vessel to be constricted, the surgery is a relatively simple procedure, and the post-operative monitoring is minimal, since there are no external devices to maintain. This paper provides a detailed overview of the proper technique for the placement of the ameroid constrictor.

The purpose of this protocol is to demonstrate the placement of a delayed constricting device (an ameroid constrictor) around a coronary artery in a swine model. This device creates an ischemic area of the heart that is useful for studying new diagnostic imaging techniques and new methods of treatment.

Ein chronischer kardialer Ischämie-Modell bei Schweinen, die mit einem Ameroid Constrictor

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an important contributing factor to impaired cardiac function found in heart failure. By contrast, restoring defective mitochondrial function may have beneficial effects to improve cardiac function in the failing heart. Therefore, studying the regulatory mechanisms and identifying novel regulators for mitochondrial function could provide insight which could be used to develop new therapeutic targets for treating heart disease. Here, cardiac myocyte mitochondrial respiration is analyzed using a unique cell culture system. First, a protocol has been optimized to rapidly isolate and culture high viability neonatal mouse cardiomyocytes. Then, a 96-well format extracellular flux analyzer is used to assess the oxygen consumption rate of these cardiomyocytes. For this protocol, we optimized seeding conditions and demonstrated that neonatal mouse cardiomyocytes oxygen consumption rate can be easily assessed in an extracellular flux analyzer. Finally, we note that our protocol can be applied to a larger culture size and other studies, such as intracellular signaling and contractile function analysis.

The goal of this protocol is to illustrate how to use mouse neonatal cardiomyocytes as a model system to examine how various factors can alter oxygen consumption in the heart.

Analyse von Sauerstoff-Verbrauch im primären kultivierten Maus neonatale Herzzellen mit einer extrazellulären Flux-Analyzer

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the body&#39;s circulatory system demands a reliable and multiparametric approach that evaluates the possible hematologic complications caused by these devices (i.e., activation and destruction of blood components). Comprehensive in vitro hemocompatibility testing of blood-contacting implants is the first step towards successful in vivo implementation. Therefore, extensive analysis according to the International Organization for Standardization 10993-4 (ISO 10993-4) is mandatory prior to clinical application. The presented flow loop describes a sensitive model to analyze the hemostatic performance of stents (in this case, neurovascular) and reveal adverse effects. The use of fresh human whole blood and gentle blood sampling are essential to avoid the preactivation of blood. The blood is perfused through a heparinized tubing containing the test specimen by using a peristaltic pump at a rate of 150 mL/min at 37 &#176;C for 60 min. Before and after perfusion, hematologic markers (i.e., blood cell count, hemoglobin, hematocrit, and plasmatic markers) indicating the activation of leukocytes (polymorphonuclear [PMN]-elastase), platelets (&#946;-thromboglobulin [&#946;-TG]), the coagulation system (thombin-antithrombin III [TAT]), and the complement cascade (SC5b-9) are analyzed. In conclusion, we present an essential and reliable model for extensive hemocompatibility testing of stents and other blood-contacting devices prior to clinical application.

This protocol describes a comprehensive hemocompatibility evaluation of blood-contacting devices using laser-cut neurovascular implants. A flow loop model with fresh, heparinized human blood is applied to mimic blood flow. After perfusion, various hematologic markers are analyzed and compared to the values gained directly after blood collection for hemocompatibility evaluation of the tested devices.