Diese Arbeit wurde von der INSERM, der Universität Aix-Marseille und Career Development Award von HFSPO von CL Forestier erhalten unterstützt.

Ethics Statement: Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Protokolle, die von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der Aix-Marseille Université, Frankreich genehmigt wurden durchgeführt. Weibliche C57BL / 6-Mäuse in 8 - 10 Wochen wurden im Handel bezogen und nach den Regeln der Décret N ° 8 87-848, 19. Oktober 1987, Paris abgewickelt. Alle Experimente mit L. donovani LD1S Parasiten wurden in Übereinstimmung mit der biologischen Sicherheit Verordnungen aus dem Französisch und Rechtsvorschriften der Europäischen Union durchgeführt. 1. Maus Infektion mit L. donovani-Promastigoten Parasites <ol><li> Vorbereitung des Kulturmediums für die in vitro Aufrechterhaltung L. donovani-Promastigoten Parasiten, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D). <ol><li> Verwenden Sie M199-Medium. Ergänzen M199-Medium mit 10% fötalem Kälberserum (bei ​​56 ° C für 30 min hitzeinaktiviert), 25 mM HEPES pH 6,9, 12 mM NaHCO 3, 1 mM GluTamine RPMI 16040 Vitaminmischung, 10 mM Folsäure, 100 mM Adenosin, 7,6 mM Hämin, 50 U / ml Penicillin und 50 mg / ml Streptomycin. </li></ol></li><li> Kultur LD1S Parasiten in 10 ml Komplettmedium M199 bei 26 ° C in einem 25 cm 2 Kolben belüftet. </li><li> Unter Verwendung aufeinanderfolgender Differenz Zentrifugationsschritte, bereiten eine Bevölkerung von promastigote Parasiten, die in metazyklisch Formen angereichert sind. <ol><li> Ernte einen mittleren logarithmischen Phase Parasit Kultur. Zählen Sie auf ein hemocytomer. Resuspendieren 5 x 10 5 Parasiten / ml in 10 ml Komplettmedium M199. Wächst der Parasit Kultur in anaeroben Bedingungen, bis sie das Ende der stationären Phase (in etwa 5-6 Tage) zu erreichen. </li><li> Drehen Sie das LD1S Kultur bei 1200 × g für 10 min bei 26 ° C zu pelletieren nicht metazyklisch Parasiten, erholen Sie den Überstand und Spin es wieder bei 2500 × g bei 26 ° C für 10 min. Hinweis: Diese endgültige Pellet wird in hohem Grade in metazyklisch promastigote Parasiten bereichert. </li><li> Das Pellet in 100 &amp; mgr; l PBS. Entfernen Sie eine kleine Teilmenge zur Fixierung mit 25% Glutaraldehyd 1/100 v: v und zählen Parasiten mit einer Zählkammer. </li></ol></li><li> Verdünne das angereicherte metazyklisch Parasitenpopulation bis 1 x 10 7/100 &amp; mgr; l in PBS. Spritzen Sie die Suspension Parasit in die Schwanzvene einer narkotisierten Maus (siehe unten) mit einer 1-ml-Spritze mit einer 30-G-Nadel. Für Kontrolltieren injizieren 100 ul PBS in die Schwanzvene. </li></ol> 2. Chirurgische Verfahren <ol><li> Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche mit einem Biozid Desinfektionsspray und alle chirurgischen Instrumente mit 70% Ethanol für 30 min. </li><li> Vorbereiten eines Anästhetikums, entsprechend dem Gewicht des Tieres, die 125 mg / kg Ketamin und 12,5 mg / kg Xylazin in PBS verdünnt. </li><li> Wiegen Sie die Maus intraperitoneal injiziert und die geeignete Dosis des Anästhetikums unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer 30 G-Nadel. </li><li> Halten Sie die Maus warm und prüfen Sie, ob die Maus vollständig anesthedurch Einklemmen des Fuß-Pad, bevor abgeschrieben. Re-Injektion eine halbe Dosis des Anästhetikums in der Maus alle 60 min. </li><li> Rasieren Sie die Maus Bauch und reinigen Sie sie mit Vetedine. Einen kleinen Einschnitt in der Haut und der Muskulatur unter dem Brustkorb auf der linken Seite des Bauches. </li><li> Legen Sie ein Stück feuchten Gaze auf dem Bauch knapp unter dem geöffneten Bereich. Setzen Sie die Leber und legen Sie sie auf die Gaze. Legen Sie ein Stück feuchten Gaze über der Leber. </li><li> Platzieren Sie eine 24 x 60 mm 2 bis 150 &amp; mgr; m dicke Deckglas, Cyanacrylat-gebundene an einem Metallrahmen, auf die Leber für die Visualisierung unter dem Mikroskop. </li><li> Schützen Sie die Augen der Maus mit einem nassen Gaze. </li><li> Nach dem Imaging-Sitzung, einschläfern das Tier betäubt durch Genickbruch. </li></ol> 3. Intravitalmikroskopie Imaging der Leber Architektur <ol><li> Führen Sie die Intravitalmikroskopie-Experimente auf einem invertierten konfokalen Mikroskop mit ausgestattethermostatic gesteuerten Kammer, eine apochromatische 63X Ölimmersionsobjektiv Glycerin (NA 1,4), Argon (488 nm) und He-Ne (543 nm, 633 nm) und ein blauer Laser-Diode (405 nm). </li><li> Platzieren Sie die Maus auf der Bühne des Mikroskops mit dem Deckglas für den Leber nach unten auf das Ziel. Eingestellt, die Temperatur der Kammer auf 29 ° C. Stellen Sie den Fokus mit der Leber, um Autofluoreszenz zur Visualisierung der Sinuskurven zu ermöglichen. </li><li> Um das Gefäßsystem sichtbar zu machen, wird eine Lösung von 500 ug BSA-Alexa 647 in 100 ul PBS, für jede Maus. Injizieren dieser Lösung intravenös in die Schwanzvene von anästhesierten Maus unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer 30 G-Nadel. </li><li> Um die Leberzellkerne sichtbar zu machen, wird eine Lösung aus Hoechst 33342 in PBS. Injizieren dieser Lösung bei 8 mg / kg Maus intraperitoneal unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer 30 G-Nadel. </li><li> Benutzen Sie die normalen sequentiellen Modus, die 63X Sionsobjektiv und den Scanner bei 400 Hz, um Bild die LeberZellkerne und die Leber Vaskulatur. Schalten Sie den 405 nm blauen Diode für Hoechst Anregung und 633 nm Laser für BSA-Alexa 647-Anregung. Schalten Sie den Argon-Laser 488 nm, und definieren eine große Akquisition Band, um die Leber Autofluoreszenz zu visualisieren. </li></ol> 4. Intravitalmikroskopie Imaging der Leber für den Blutfluss Geschwindigkeitsmessung <ol><li> Öffnen Sie die LAS-Software des Mikroskops (LAS AF-Viewer Version 3.1.0 build 8587). Wählen Sie das Resonanzscanner-Modus beim Öffnen des Mikroskop-Software. </li><li> Klicken Sie auf die Registerkarte Konfiguration, um die Hardware eingestellt. Klicken Sie auf und wählen Sie den Laser HeNe 633 Laser. Klicken Sie auf Einstellungen und wählen Sie 12 Bit Auflösung. </li><li> Klicken Sie auf die Übernahme-Menü. Im Weg Einstellungsfenster Strahl, wählen Sie die Ziel 63X und die 633 Laserleistung auf 100%. Aktivieren Sie die Signalverstärkung und Ausschalten eingestellten Parameter durch Auswahl Alexa-633 aus der PM1-3 Dropdown-Menü. </li><li> In der Registerkarte erwerben, wählen Sie die &#39;XYT&#39; ErwerbModus. Stellen Formatbreite bei 1.024 x 1.024. Wählen Geschwindigkeit bei 8.000 Hz. Wählen Sie die Lochblende von 3 Airy-Einheiten. Wählen Sie einen Zoomfaktor von 3. den bidirektionalen Modus wählen Sie nicht. </li></ol> 5. Quantitative Analyse von RBC Velocity Mit den xyt Images (Methode 1) <ol><li> Klicken Sie auf &quot;Live&quot; Symbol, um die Durchblutung an einem Live-Modus zu visualisieren. Wählen Sie das Gebiet von Interesse und ein bestimmtes Blutgefäß für die Analyse. Stellen Sie das Gefäß von Interesse in die horizontale Position durch Einstellung des &quot;X&quot;, &quot;Y&quot; und Scanfeld Drehkoordinaten auf USB Bedienfeld. </li><li> Stoppen Sie den &quot;Live&quot; Modus, sobald das Gefäß von Interesse eingestellt. Ändern Sie das Format Satzbreite zu 1.024 x 256 in der Erfassungsmodus-Einstellungsfenster, Rauh = 1, Rahmen mittel = 1, wählen Sie &quot;Stapel&quot; 150. Klicken Sie auf &quot;Start&quot;, um Bilder zu erwerben. </li><li> Für die quantitative Analyse von RBC Geschwindigkeit mit dem &quot;xyt&quot; Bild öffnen Sie die ImageJ Software. Wählen Sie das &quot;Datei&quot;Registerkarte in ImageJ, klicken Sie auf &quot;Öffnen&quot; wählen Sie dann die Datei von Interesse. </li><li> Gehen Sie auf die &quot;Plugin&quot; -Menü in ImageJ, wählen LOCI und Bio-Formaten importieren Optionen. In diesem Fenster wählen Sie den Stapel sehen Parameter als &quot;Hyperstack. In dem Stapel Bestelloption, wählen Sie die Option: &quot;xyzct&quot;. Hinweis: Es öffnet sich ein Fenster mit der ganzen Reihe von Akquisitionen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Plugins&quot; auf der ImageJ Menü und wählen MTrackJ Option. Klicke Sie auf &#39;Add&#39; auf das kleine Fenster und klicken Sie auf die RBC zu verfolgen. Klicken Sie auf das gleiche RBC in jedem folgenden Frame und klicken Sie auf das Symbol &quot;Maßnahme&quot;, um die Geschwindigkeit zu messen. Hinweis: Die erzeugte in .exl-Format gespeichert werden Datei. </li><li> Verfolgen Sie mindestens fünf RBCs pro Schiff und ein Minimum von drei einzelnen Schiffen gleicher Größe zu analysieren. </li></ol> 6. Quantitative Analyse von RBC Velocity Mit den xt Linienbilder (Methode 2) <ol><li> Klicken Sie auf &quot;Live&quot;, um das Blut f visualisierenniedrig im Live-Modus. Wählen Sie einen bestimmten Blutgefäß für die Analyse. Stellen Sie das Gefäß von Interesse in die horizontale Position. Stoppen Sie den &quot;Live&quot; Modus, sobald das Gefäß von Interesse eingestellt. </li><li> Wählen Sie den &quot;xt&quot; Scan-Modus und stellen Sie die zentralen Lumen des ausgewählten Schiffes entlang der Linie Scan. Set Formatbreite bei 1.024 x 512, speed = 8,000Hz, Linie mittel = 32 Zeit = 512. Klicken Sie auf &quot;Start&quot; und die xt Linienbilder erwerben. </li><li> Generieren Streifen zur quantitativen Analyse von RBC Geschwindigkeit durch Öffnen des .lif Datei und Öffnen des xt Linienbild von Interesse. In LAS AF-Software, wählen Sie &quot;Experimente&quot;, öffnen Sie das .lif und wählen Sie das Bild. Hinweis: Es wird automatisch eine kymograph öffnen. </li><li> Messen der Zeit (t, auf der Y-Achse erhalten wird) für ein Partikel Strähne (die dunklen Reflexion) erforderlich, um einen bestimmten Abstand (d, auf der X-Achse erhalten wird) zu diesem kymograph reisen. Wählen Sie das Werkzeug &quot;Draw line&quot; und ziehen Sie eine Linie horizontal zur Ader. Beachten Sie die Entfernung inum und die Zeit in Sekunden, in der Ergebnis Lasche an der Unterseite des Bildes erzeugt. </li><li> Berechnen Geschwindigkeit als V = Weg / Zeit unter Verwendung der von der kymograph erhaltenen Werte. </li><li> Quantifizierung mindestens fünf Teilchen Streifen Bild xt pro und ein Minimum von drei einzelnen Schiffen der gleichen Größe. </li></ol>

<ol>
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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+liver+biology+in+vivo+using+conventional+confocal+microscopy.">Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy.</a> Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).</li><li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+malaria+parasites+in+the+murine+liver.">In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver.</a> Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).</li><li>Vacchina, P., Morales, M. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+RBC+velocity,+flux,+hematocrit+and+shear+rate+in+vascular+networks.">Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks.</a> Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).</li><li>MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittence+of+blood+flow+in+liver+sinusoids,+studied+by+high-resolution+in+vivo+microscopy.">Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy.</a> Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die jüngste Entwicklung der intravitalmikroskopische der Mausleber eröffnet neue Möglichkeiten für die Untersuchung der physiologischen Reaktion auf die Infektion in vivo und in Echtzeit 5,9,10. Organdurchblutung ist ein wichtiger physiologischer Parameter, der häufig bei vielen Erkrankungen verändert ist. Der Status der Leber-Hämodynamik unter physiologischen und ansteckende Bedingungen bleibt jedoch ein wenig erforscht Bereich. In dieser Studie IVM-basierte Verfahren, das zuvor für die Unte...

Organspezifische Hämodynamik sind wichtige physiologische Eigenschaften aller Säugetierorgans. Anomalien des Blutflusses können die Folge von Entzündungen und ein Zeichen von Organdysfunktion 1 sein. Somit Blutfluß Organisation, Struktur und Funktion werden als kritischer Parameter für die Analyse unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Die Techniken, die üblicherweise zur Analyse des Blutflusses in einem spezifischen Organ verwendet worden sind, enthalten mehrere Einschränkungen, einschließlich der Auflösungsgrenze des Verfahrens selbst (zB Doppler-Bildgebung des Blutflusses), die Fähigkeit zur Messung der absoluten Blutfluß nur (Volumen Blut pro Einheit dient ein Organ) (zB die optische Kohärenztomographie) und die Messung der durchschnittlichen Veränderungen in der Geschwindigkeit in einem großen und heterogenen Population von Blutgefäßen 2,3. Der Leber-Kreislauf-System verbindet verschiedene Gefäßtypen, die heterogene in ihrer Größe, Struktur und Funktion sind. ImDiese Studie, Intravitalmikroskopie (IVM) Bildgebungstechnik wird angewandt, um Leber-Hämodynamik in vivo zu bewerten, in Echtzeit mit hoher Auflösung und in parallelen, um die Eigenschaften der einzelnen Blutgefäße, die den Leberorgan umfassen aufzudecken. Die jüngste Entwicklung dieser leistungsfähigen optischen Bildgebungsverfahren ermöglicht es dem Forscher, um dynamische Daten an lebenden Tieren mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu sammeln. Dadurch, dass die direkte Visualisierung und Echtzeit-Überwachung von spezifischen und schnellen biologischen Prozesse in vivo, bietet IVM eine einzigartige Gelegenheit, den Forscher für Bild in einzelne Blutgefäße und zu messen und zu quantifizieren, die Geschwindigkeit der einzelnen roten Blutzellen (RBC) in einem speziell ausgewählten Lebergefäß. In dieser Studie haben wir die IVM Technik in der Mausleber L. geführt, um den Einfluss der Maus Infektion mit dem hepatotropen Parasiten Leishmania auf Leber-Hämodynamik zu untersuchen. donovaniist die für die viszerale Leishmaniose, einer schweren Krankheit, die durch akut auf chronisch entzündliche Reaktionen und eine Pathologie, die in mehreren Organen, einschließlich der Milz und der Leber verantwortlich ist Mittel. In einem experimentellen Mausmodell von viszeraler Leishmaniose, ist die Leberinfektion ohne Behandlung während die Milz-Infektion ist progressiv. 4 Diese Ergebnisse Leishmania Infektion in Bezug auf einzelne Organe noch nicht vollständig verstanden. Untersuchung von Leber und Milz Hämodynamik unter pathologischen Bedingungen wird ein neues Licht auf Wirt-Parasit-Interaktionen und Krankheitsentstehung zu vergießen. Unsere experimentelle Modellsystem ist auf Belichtung und Abbildung der Leber eines anästhesierten Maus, die eine intravenöse Injektion von spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen zur Markierung der Leber intravasculature erteilt hat. Die Leber ist ein Organ für die günstigen innerVitalMikroskopie. Nach der Durchführung einer kleinen incision in den Bauch, ist die Leber sanft externalisiert und auf nasser Gaze gelegt, dann auf einem Deckglas mit dem Ziel der Verringerung keine Bewegungsartefakte durch Herzschlag und Atmung. Die Leber wird dann innerhalb der Ansicht eines Mikroskopobjektivs angeordnet. Im Vergleich zu der Milz und Lymphknoten, die die Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie für IVM Studien erfordern, ist der Vorteil der Leber liegt in der homogenen 3D-Architektur / Anatomie, die für die Verwendung eines herkömmlichen konfokalen Mikroskop ermöglicht, mit einer maximalen Eindringtiefe etwa 50 &amp; mgr; m für Intravitalmikroskopie Bildgebung 5-8. Diese Studie beschreibt zwei unabhängige bildgebenden Verfahren für die quantitative Bestimmung von RBC Geschwindigkeit und Blutströmungsgeschwindigkeit in den einzelnen Blutgefäßen. Im ersten Verfahren wird Leberblutfluss unter Verwendung eines xy zweidimensionalen Modus über die Zeit erfasst. Die resultierenden xyt Daten werden mit dem MtrackJ Plugin im freien ImageJ Software, die für die Verfolgung der indivi ermöglicht analysiertual RBCs im Laufe der Zeit. Bei der zweiten Methode wird eine einzelne Blutgefäß ausgewählt und dessen entsprechende Durchblutung unter Verwendung der Zeilenabtastung schnelle Erfassungsmodus der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop analysiert. Das interessierende Gefäß wird bei hoher Frequenz entlang seiner zentralen Achse durch eine axiale Linie abgetastet. Die Blutflussgeschwindigkeit wird dann auf der Basis der Kontrastunterschied zwischen unmarkiertem dunklen Erythrozyten und fluoreszenzmarkierten Plasma quantifiziert. Die Fluoreszenzintensitäten der RBCs und Plasma entlang der Linie Abtastung erfasst werden gegen die Zeit aufgetragen, um Streifen zu erhalten, deren Winkel sind proportional zu den Geschwindigkeiten eines RBC. Das Ziel dieses Artikels ist es, eine einfache und reproduzierbare Methode zur Bildgebung und Messung des Blutströmungsgeschwindigkeit in den einzelnen Blutgefäßen der Leber zu geben und für die erfolgreiche Performance der Maus Chirurgie, IVM und quantitative Analysen der Geschwindigkeit verfügbar zu machen die grundlegenden Werkzeuge einzelnen RBCs. Tsein Ansatz wird es den Forschern ermöglichen neue Einblicke in Blutgeschwindigkeit unter pathologischen Bedingungen zu gewinnen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Alexa 647</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>A34785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC 500 mol wt</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>46947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>PanPharma</td>
			<td>20434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>KP07KEU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetedine</td>
			<td>Pharma Animal</td>
			<td>6869029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate liquid</td>
			<td>Cyanolit</td>
			<td>5833300005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N&#176;: 5013</td>
			<td>Molecular machines</td>
			<td>50103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm</td>
			<td>DiaPath</td>
			<td>61061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS-SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-AF viewer&#160;</td>
			<td>Leica software</td>
			<td>Version 3.1.0 buid 8587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: an assessment of hepatic hemodynamics

Intravitalmikroskopie (IVM) ist ein leistungsfähiges optisches bildgebendes Verfahren, das die Visualisierung, Überwachung und Quantifizierung der verschiedenen biologischen Ereignisse in Echtzeit und mit lebenden Tieren möglich gemacht hat. Diese Technologie hat sich unser Verständnis der physiologischen Prozesse und die Pathogen-vermittelte Phänomene in bestimmten Organen vorgerückt. In dieser Studie IVM ist mit der Mausleber zur In-vivo das Kreislaufsystem der Leber angewendet und Protokolle sind so konzipiert und messen roten Blutkörperchen (RBC) Geschwindigkeit in einzelnen Lebergefäße. Um die verschiedenen Behälter Subtypen, der Leberorgan charakterisieren visualisieren und führen Blutströmungsgeschwindigkeit Messungen werden C57BL / 6-Mäusen intravenös mit einem fluoreszierenden Reagenz Plasma, die die Leber-assoziierten Gefäßen Etiketten injiziert. IVM ermöglicht in vivo, Echtzeit, Messung von RBC Geschwindigkeit in einem bestimmten Gefäß von Interesse. Gründung dieser Methode wird es möglich zu machen,Untersuchung der Leber-Hämodynamik unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Letztlich wird dies Imaging-basierte Methodik wichtig für die Untersuchung des Einflusses von L. sein donovani-Infektion auf die Leber-Hämodynamik. Dieses Verfahren kann auf andere Infektionsmodelle und Maus Organe angewandt werden und könnte weiter ausgebaut vor, eine klinische Prüfung eines Arzneimittels Wirkung auf die Entzündung durch die Quantifizierung seiner Wirkung auf den Blutfluss werden.

Die spezifische architektonische Gestaltung der Sinuskurven in der Leber visualisiert basieren auf dem Autofluoreszenz Eigenschaft dieses Organs (Abbildung 1, Abbildung B und C, grün), die intraperitoneale Injektion von Hoechst für die Kennzeichnung von Hepatozyten-Kerne (1B, blau) und die intravenöse Injektion von BSA für die Fluoreszenzfärbung des Leberkreislaufsystems (1C, rot). Die Leber ist von mehreren verschiedenen Gefäß Subtypen mit verschiedenen Funktion...

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Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Intravitalmikroskopie Imaging der Leber nach<em&gt; Leishmania</em&gt; Infection: Eine Bewertung von Leber Hämodynamik

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

intravital-microscopy-imaging-liver-following-leishmania-infection-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

11.4K Aufrufe.  University of Aix-Marseille. This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Serie: Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

In-vivo-Imaging von transgenen Leishmania Parasiten in einer Live-Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Intravitalmikroskopie der Leistenbruch Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Intravitalmikroskopie der Milz: Quantitative Analyse von Parasite Mobility und die Durchblutung

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Bildgebung des dem Maus-Kniekehlen-Lymphknoten

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Langzeitintravital Multiphotonen Mikroskopie Imaging von Immunzellen in gesunden und kranken Leber Mit CXCR6.Gfp Reporter Mäuse

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

Zwei-Photon intravitalen Bildgebung der Leukozyten im Rahmen der Immunantwort in Lipopolysaccharid behandelt Maus Leber

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

Bildgebung Zelle Interaktion in Trachealen Schleimhaut während der Influenza-Virus-Infektion mit Intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...