Wir danken Dr. Randy Chitwood für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der Whitehall-Stiftung und der Alfred P. Sloan Foundation Zuschüsse für HJK unterstützt.

Ein. Optischer Aufbau (Abbildung 1) <ol><li> Für Zwei-Photonen-Anregung ein Infrarot gepulstes Lasersystem mit Femtosekunden-Pulsen verwendet wird. Eine hohe Laserausgangsleistung (teilweise&gt; 2W bei 890 nm Wellenlänge) ist erforderlich, um die großen Verluste durch die optischen Komponenten des Systems eingebracht wird, ausgeglichen. </li><li> Ein prechirper bestehend aus zwei Prismen verleiht eine negative Gruppengeschwindigkeitsdispersion (GVD) auf die Laserpulse vor den akustooptischen Ablenker (bevollmächtigten Anweisungsbefugten) für die zeitliche Dispersion durch den bevollmächtigten Anweisungsbefugten 1 eingeführt kompensieren. </li><li> Zwei bevollmächtigten Anweisungsbefugten mit großen Öffnungen (10 mm für eine 40x Wasser Immersionsobjektiv mit NA 0,8) lenken den Laserstrahl in zwei Dimensionen. </li><li> Eine reflektierende Beugungsgitter mit 100 Hainen / mm platziert ist 13 cm hinter den bevollmächtigten Anweisungsbefugten, um die räumliche Verteilung von bevollmächtigten Anweisungsbefugten eingeführt kompensieren, wenn unter Verwendung kurzer Laserpulse. </li><li> Der Laserstrahl wird mit zwei Relais-Teleskope in den Kamera-Anschluss eines aufrechten Mikroskopie gerichtetpe. </li><li> Irisblenden sind in regelmäßigen Abständen für die Ausrichtung der optischen Komponenten angeordnet. </li><li> Ein dichroitischer Strahlteiler vor dem Ziel überträgt das Infrarot Anregungslicht auf die Probe und reflektiert das Fluoreszenzlicht aus der Probe auf einen Detektor. </li><li> Epi-und transfluorescence Detektoren (Photomultiplier, PMT) zu sammeln Fluoreszenzsignals durch das Objektiv und - falls vorhanden - durch den Kondensator. </li><li> Farbglasfilter (BG-39, 3-5 mm) vor der Detektoren angeordnet, um Anregungslicht zu verhindern Erreichen der Detektoren. </li><li> Die AOD Ablenkwinkel werden von einem Computer mit einem Digital-Analog-Wandler Karte (156,25 kHz Taktrate), die wiederum treibt spannungsgesteuerte Oszillatoren ausgestattet gesteuert. </li><li> Das Signal von den Photomultipliern wird durch eine Tiefpaß-Butterworth-Filter (Grenzfrequenz von 100 kHz) weitergeleitet und digitalisiert durch einen Analog-Digital-Wandler (156,25 kHz Taktrate), bevor sie in gespeichertenein Computer für die Analyse. </li><li> Ausrichtung und elektrischem Rauschen werden durch Aufzeichnung der Verteilung der Fluoreszenz-Signalen mit und ohne Laserlicht getestet, bei niedrigen und bei hohen Verstärkung der Photomultiplier, sowie mit und ohne Indikator. Der Scanner ist korrekt einzustellen und abgeschirmt, wenn die Breite der Verteilung der Fluoreszenzsignale bei hoher Verstärkung und mit Indikator ist viel größer als die Breiten der anderen Verteilungen von Fluoreszenzsignalen (Abb. 2). </li></ol> 2. Experimentelle Verfahren <ol><li> Dithered Random-Access-Scans beruht auf Detektion von intrazellulären Anstieg der Kalzium. Eine große Anzahl von Neuronen können angefärbt unter Verwendung Bolusinjektion des Esters Form eines Calcium-Indikator (beispielsweise Oregon Green 488 Bapta-1 AM) in neuronale Gewebe 5 ist. </li><li> Mehreren Orten aus jedem Neuron Soma aufgezeichnet sind, jeweils für eine kurze Zeit (&quot;Dithering&quot;, 4 Orten 6,4 us für jeden Ort = 25,6 us Aufnahmezeit für Each Neuron in jedem Zyklus, Fig. 3C). Um Neuronen von Interesse wählen Sie eine Full-Frame aus 256x256 Pixel erworben wird (Abb. 3A). Die Mitte jedes Neuron Soma aufzuzeichnenden wird manuell innerhalb dieses Bildes ausgewählt. Die Steuerungs-Software fügt automatisch drei Punkte bei 2 um Abstand um dieses Zentrum. </li><li> In jedem Zyklus wird die Fluoreszenz-Signal von jedem der 40 Neuronen (3B) aufgezeichnet. Dieser Prozess wird für die gesamte Dauer einer Aufnahme (5 = zweiten Aufzeichnungsbereich 3255 Zyklen, 1 Zyklus = 1,536 ms) wiederholt. </li></ol> 3. Online Software-Tools zur Spike-Erkennung zu maximieren <ol><li> Spike Detektion von Fluoreszenz-Signalen somatischen Calcium beruht auf einem hohen Signal-zu-Rauschen (S / N) Verhältnis der somatischen Fluoreszenz Calcium Signale. Ein hohes S / N durch Erhöhen Anregungsintensität erreicht werden. Anregungsintensität kann jedoch nur bis zu einem gewissen Grenzwert aufgrund Lichtschäden erhöht werden. Spike-Erkennung ist in einem sehr kleinen windo hohenw von Anregungsintensitäten nur wo Fluoreszenzsignale ein hohes S / N haben aber nur eine sehr geringe Lichtschäden wird 3 beobachtet. Um sicherzustellen, dass die aufgenommenen Signale innerhalb des Fensters der hohen Spike-Erkennung sind bei Aufnahmen überwachen wir Photonen-Rate (siehe Gleichung 3.2) und Rückgang der Fluoreszenzgrundlinienmessungen mit Online-Analyse. </li><li> Grobe Photon pro Neuron ausgewählt ist aus einem kurzen Zeitfenster (100-200 ms) des Basislinienrauschen berechnet. Anzahl von Photonen (λ N) und Photonen Rate (λ = N λ / At) aus den Fluoreszenz-Werte durch die Verteilung (σ) der relativen Fluoreszenz ändert sich mit der folgenden Gleichung berechnet: </li></ol><img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/4052/4052eq1.jpg" /> Diese Gleichung stellt die Poisson-Verteilung für Photonen Schrotrauschen mit einer Änderung der Variable relative Fluoreszenz Änderung: &amp;Dgr; F / F = (G * N λ (t)-G * N &amp; lambda;, 0) / G * N λ, 0, wobei G bezeichnet die kumulative Gewinn von Photomultiplier und alle anderen elektronischen Komponenten. Man beachte, dass diese Gleichung nicht korrekt bestimmt die Anzahl der detektierten Photonen für die in vivo-Aufnahmen weil andere Lärmquellen (Bewegungsartefakte), zusätzlich zu Photon Schrotrauschen sind. Dennoch ist diese Gleichung nützlich für die in vivo-Aufnahmen, um das Rauschen zu schätzen. <ol start="3"><li> Fluoreszenzbasismesswert aus dem gleichen Zeitfenster berechnet und als Funktion der Zeit oder Studien. Der durchschnittliche Rückgang der Grundlinie unter 0,0002 / s durch Anpassung Laserleistung, weil Spike-Erkennung rasch ab, wenn diese Grenze überschreiten, gehalten. </li><li> Jedes 10-20 min das Neuron Somata Positionen werden durch erneutes Erwerb ein Vollbild überprüft. Falls erforderlich, werden Aufnahmeorte angepasst. Standorte können für alle Neuronen auf einmal, oder für einzelne Neuronen eingestellt werden. </li></ol> 4. Reconstruction von Spike Timings von Fluoreszenz-Signalen (Dekonvolution) <ol><li> Die Fluoreszenz-Signale, die aus neuronalen Aktivität oft in summieren Zeit, weil der Zerfall der Calciumtransienten ist lang (einige hundert Millisekunden). A Dekonvolutionsverfahren rekonstruiert Spike und Spike Timings von Fluoreszenz-Signalen. </li><li> Um die wahrscheinlichste Spike Train zugrundeliegenden aufgezeichneten Fluoreszenzsignal zu bestimmen, werden verschiedenen Modellen verglichen. Hier haben wir einen genetischen Algorithmus, um das Modell zu bestimmen - und damit die Spike Train und Spike-Timings - mit der höchsten Wahrscheinlichkeit. </li><li> In inhomogenen Populationen von Neuronen, kann der Spike-evozierte Kalzium-Signal zwischen den Neuronen variieren. Für den unbeaufsichtigten Analyse der Datensätze gestalteten wir einen Algorithmus, der unter Berücksichtigung der Variation des Spike-evozierte Calcium Signal von Neuron zu Neuron. </li><li> Um eine große Anzahl von Fehlalarmen zu vermeiden, ist es sinnvoll zu verengen den zulässigen Amplitude und Abklingzeitkonstante des modell der Spitze hervorgerufenen Calcium-Signal. Die gemeinsame Verteilung der Amplitude und Abklingzeitkonstante Single-Spike evozierte Kalzium Transienten werden in einer separaten Reihe von Experimenten aus der gleichen Art von Neuronen unter den gleichen Versuchsbedingungen mit gleichzeitiger elektrophysiologische und optische Aufnahmen aufgezeichnet. </li><li> Um für langsame Baseline Veränderungen ausmachen und Rechenaufwand der Entfalten zu reduzieren, werden längere Aufnahmen in mehrere kürzere Spuren von 1-5 Sekunden geteilt. </li><li> Für jedes Neuron und jeder Aufzeichnung kann der Entfaltungs-Algorithmus Testen einer Vielzahl von Modellen (bis zu 1.000.000 verschiedene Modelle oder mehr). Zur Beschleunigung Dekonvolution, ist ein Experiment auf bis zu 10 verschiedenen Rechnern parallel entfalteten. </li><li> Nach Dekonvolution, wird der Dorn Daten analysiert und geprüft. Eine peri-Stimulus-Histogramm, dem Spike-Wahrscheinlichkeit, und Feuerungsrate (Durchschnitt pro Spike Neuronen) werden in einer automatisierten Art und Weise berechnet. </li></ol> 5.Repräsentative Ergebnisse Erfolgreiche Spitzen-Detektionssignals Scharniere auf einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis der erfassten Fluoreszenz somatischen Calcium Signale. Einfach mit hoher Anregungsraten (hohe Laserleistung) kann in einem negativen Auswirkungen der Photoeffekte auf biologisches Material (Lichtschäden) führen. In geditherten Random-Access-Scans Lichtschäden manifestiert sich als Rückgänge in Fluoreszenzgrundlinienmessungen und sinkt der Spike-evozierte Calcium Fluoreszenzsignale. Der Rückgang in der Spike-evozierten Signals kann schnell zu einem Ausfall, um Spitzen aufzudecken. Es ist nur noch ein sehr kleines Zeitfenster Anregungsintensität wo Spitzen-Detektionssignals aus Fluoreszenz-Signale hoch ist. Am oberen Ende dieses Fenster wird durch Lichtschäden begrenzt, am unteren Ende die Fluoreszenzsignale ein niedriges Signal-zu-Rausch-Verhältnis aufweisen. Für kortikalen Neuronen in akuten Schnitten verwenden wir Laserleistung was Photonen Raten von etwa 400,000-1,500,000 Photonen / s bei der Aufnahme um 100 um unterhalb Scheibenoberfläche. Bei Verwendung einer hohenAffinität Anzeige - Hier Oregon Green 488 BAPTA - 1 - dieses Signal ist ausreichend, um einzelne Spitzen zu erkennen. Fig. 3E zeigt ein Beispiel eines Fluoreszenzsignals bei sehr niedrigen Anregungsrate, die ein Beispiel einer Aufnahme innerhalb des Detektionsfensters, und man bei sehr hohen Anregungsrate aufgezeichnet. Im Vergleich zu anderen Techniken, um neuronale Aktivität mit Single-Cell-und Single-Spike-Auflösung aufzuzeichnen, gedithert Random-Access-Scanning kann aus einer größeren Anzahl von Neuronen aus dem gleichen, Bevölkerung aufzuzeichnen, und ist weniger invasiv beispielsweise gegenüber Tetrode / Multielektroden Aufzeichnungen . So geditherten Random-Access-Scanning kann verwendet werden, um neuronale Aktivität von vielen Neuronen aufzeichnen, um die gegenseitige Information von überschwelligen Aktivität 6 (Abb. 4A), Veränderungen der neuronalen Aktivität in einer Population von Neuronen (kortikale Plastizität) signalisiert zu messen, und die Vermehrung von überschwelligen Aktivitäten werden Populationen von Neuronen durch 14 (4B) <img<html> alt = &quot;Abbildung 1&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4052/4052fig1.jpg&quot; /&gt; Abbildung 1. Optische Gestaltung der Dithering-random access Scanning Setup. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4052/4052fig2.jpg" /> Abbildung 2 Ausrichtung und Prüfung:. Ausschüttungen von Fluoreszenz-Signalen unter verschiedenen Bedingungen aufgezeichnet. A) Nr. Laserlicht und niedrigen Photovervielfacher Verstärkungsfaktor, B) Bei höheren PMT-Verstärkung, aber kein Laserlicht ist die Verteilung breiter wegen der Photovervielfacher Dunkelstroms. C) Mit der Laser auf und erfasst bei hohen PMT-Verstärkung. Ein Unterschied zwischen den Verteilungen in in B gezeigt und dieser Verteilung würde anzeigen, dass Anregungslicht erreicht die PMT Detektoren. D) Die Verteilung von Fluoreszenz-Signalen bei hoher Verstärkung von Neuron Somata aufgezeichnet. Wenn keine andere Lärmquelle beiträgt, stellt sich diese Verteilung von Photonen Schrotrauschen nur. . Jpg &quot;/&gt; Abbildung 3 A) Full-Frame-Fluoreszenz-Bild zu erkennen und auszuwählen Neuron Somata Positionen, B) Scan Weg eines Zyklus, C) Illustration des Dithering-Prinzip;. In jedem soma (Kreis) mehrere Standorte sind, bevor Sie den Strahl auf die nächste aufgezeichnete Soma, D) Illustration von dem Ausgang der zwei D / A-Kanäle. Für jedes Neuron Soma wird Fluoreszenzsignal aus 4 verschiedenen Stellen in jedem Soma (s1-s4) aufgezeichnet. Die Lage von jedem Fleck wird durch seine x-und y-Position gegeben. Die x-und y-Positionen für alle Flecken und allen Neuronen werden dem Digital-zu-Analog-Umsetzer in einer sequentiellen Weise gesendet. Während der Strahl zwischen zwei Neuronen Somata bewegt wird, wird kein Signal erworben (leer). E) Beispiele von Fluoreszenzsignalen. Beachten Sie, dass jedes Beispiel als Reaktion auf eine Spitze zeigt (wie bei elektrophysiologischen Cell-Attached-Aufnahme gemessen). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4052/4052fig4.jpg" /> Abbildung 4. Studieren cortical Funktion mit Dithering Random-Access-Scans. A) Messung der gegenseitigen Information von Populationen von Neuronen signalisiert. Oberes Bild zeigt mikroskopische Aufnahme eines akuten Hirnschnittkultur und zwei Stimulation Pipetten in der gleichen Spalte in kortikalen Schicht 4 (L4) angeordnet ist. Zentrum Graphen zeigen neuronale Antworten für jede Wiederholung eines Reizes. Untere Graph zeigt Shannons gegenseitige Information von der aufgenommenen Population von Neuronen signalisiert. B) Messen Ausbreitung überschwellige Spiking Aktivität (Signallaufzeit) zwischen den Populationen von kortikalen Neuronen. Obere Graph zeigt experimentelle Design, mittlere Bild Fluoreszenzbild zeigt, gestrichelt Barrel Grenzen anzugeben, zeigt untere Graph detektierten Spitzen in Reaktion auf elektrische Stimulation des thalamokortikalen Fasern (Dreiecke).

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+neuronal+spiking+activity+from+unbiased+populations+of+neurons+with+high+spike+detection+efficiency+and+high+temporal+precision.">Optical recording of neuronal spiking activity from unbiased populations of neurons with high spike detection efficiency and high temporal precision.</a> J. Neurophysiol. 104, 1812-1824 (2010).</li><li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision.">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nat. 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Methods. 3, 377-383 (2006).</li><li>Hendel, T., Mank, M., Schnell, B., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in+vitro.">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro.</a> J. Neurosci. 28, 7399-7411 (2008).</li><li>Ranganathan, G. N., Koester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+decrease+with+propagation+of+spiking+activity+in+the+mouse+barrel+cortex.">Correlations decrease with propagation of spiking activity in the mouse barrel cortex.</a> Front Neural Circuits. 5, 8 (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dithered Random-Access-Scans indirekt erkennt überschwellige Spiking-Aktivität aus dem Anstieg der intrazellulären Calcium-somatischen mit jedem Spike in einem Neuron Somata verbunden. Der Anstieg der intrazellulären Calcium durch fluoreszierende Kalzium Farbstoffe nachgewiesen. Die Grenzen der geditherten Random-Access-Überprüfung ergeben weitgehend aus der begrenzten Signal-zu-Rausch-Verhältnis der Calcium Fluoreszenzsignalen. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis wird wiederum durch Lichtschäden, die es nicht erla...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Optische Komponenten werden in Reihenfolge, beginnend von dem Laser </td></tr><tr><td> Titan: Saphir-Laser </td><td> Coherent Inc. </td><td> Chameleon Ultra 2 </td><td> Hohe Leistung empfohlen (&gt; 2W bei 900 nm) </td></tr><tr><td> Achromatische Linse f = 30 mm </td><td> Thor Labors </td><td> AC254-030-B </td><td> Anti-Reflex-Beschichtung (AR) für 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Achromatische Linse f = 100 mm </td><td> Thor Labors </td><td> AC254-100-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Objektiv f = 75 mm </td><td> Thor Labors </td><td> LA1608-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Objektiv f = 175 mm</td><td> Thor Labors </td><td> LA1229-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Achromatische Linse f = 300 mm </td><td> Thor Labors </td><td> AC254-300-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Achromatische Linse f = 100 mm </td><td> Thor Labors </td><td> AC254-100-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Achromatische Linse f = 100 mm </td><td> Thor Labors </td><td> AC254-100-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Akusto-optische Deflektoren </td><td> Intraaction Corp </td><td> ATD 6510CD2 </td><td></td></tr><tr><td> Reflektierende Beugungsgitter </td><td> Newport </td><td> 53-011R </td><td> 100 Rillen / mm bevollmächtigten Anweisungsbefugten mit 65 MHz Bandbreite und Scan-Winkel von 45 mrad </td></tr><tr><td> 21,6 mm Brewster-Prismen </td><td> Lambda Research Optics Inc. </td><td> IBP21.6SF10 </td><td></td></tr><tr><td> Colored Glass </td><td> Schott </td&gt; <td> BG-39 </td><td></td></tr><tr><td> Dichroitischen Spiegel </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> Z532RDC </td><td></td></tr><tr><td> Photomultiplier-Module </td><td> Hamamatsu </td><td> H9305-03 </td><td></td></tr><tr><td> DAC-ADC Bord </td><td> National Instruments </td><td> PCI-6115 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 BAPTA-01.00 </td><td> Invitrogen </td><td> O-6807 </td><td></td></tr></tbody></table>

optical recording of suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution

Signalisieren von Informationen in dem Vertebraten zentralen Nervensystems wird oft von Populationen von Neuronen statt einzelner Neuronen durchgeführt. Auch Ausbreitung überschwellige spiking Tätigkeit umfasst Populationen von Neuronen. Empirische Studien zu kortikalen Funktion direkt erfordern daher Aufnahmen von Populationen von Neuronen mit hoher Auflösung. Hier beschreiben wir ein optisches Verfahren und eine Entfaltungs-Algorithmus auf neurale Aktivität von bis zu 100 Neuronen mit Single-Cell-und Single-Spike-Auflösung aufzeichnen. Diese Methode beruht auf dem Nachweis der transienten Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration somatischen mit überschwelligen elektrischen Spitzen (Aktionspotentiale) in kortikalen Neuronen verbunden. Hohe zeitliche Auflösung der optischen Aufnahmen wird durch eine schnelle Random-Access-Scanning-Technik mit akusto-optische Deflektoren (bevollmächtigten Anweisungsbefugten) 1 erreicht. Zwei-Photonen-Anregung der Calcium-sensitiven Farbstoff Ergebnisse in hoher räumlicher Auflösung in undurchsichtigen Gehirn tisSue 2. Rekonstruktion der Spitzen von den Fluoreszenz-Calcium-Aufnahmen durch eine Maximum-Likelihood-Methode erreicht. Simultane elektrophysiologische und optische Aufnahmen zeigen, dass unsere Methode zuverlässig erkennt Spikes (&gt; 97% Spike Detektionseffizienz) weist eine geringe Rate an falsch positiven Spitzen-Detektionssignals (&lt;0,003 Spikes / s) und einer hohen zeitlichen Genauigkeit (etwa 3 ms) 3. Diese optische Methode der Spitzen-Detektionssignals können verwendet werden, um neuronale Aktivität in vitro und in vivo in narkotisierten Tieren 3,4 aufzuzeichnen.

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Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Das Verständnis der Funktion des zentralen Nervensystems in Wirbeltieren erfordert Aufnahmen aus, weil viele Neuronen kortikale Funktion entsteht auf der Ebene der Populationen von Neuronen. Hier haben wir ein optisches Verfahren zur überschwelligen neuronale Aktivität mit Single-Cell-und Single-Spike Auflösung aufzeichnen beschreiben, gedithert Random-Access-Scans. Diese Methode records somatischen Fluoreszenz-Calcium-Signale von bis zu 100 Neuronen mit hoher zeitlicher Auflösung. Ein Maximum-Likelihood-Algorithmus deconvolves die darunterliegende überschwellige neuronale Aktivität von den somatischen Fluoreszenz Calcium Signale. Diese Methode erkennt zuverlässig Spikes mit hohen Erkennungsraten Wirkungsgrad und eine geringe Rate der False Positives und kann verwendet werden, um neuronale Populationen zu untersuchen<em&gt; In vitro</em&gt; Und<em&gt; In vivo</em&gt;.

Optische Aufnahme überschwellige neuronale Aktivität mit Single-Cell-und Single-Spike Auflösung

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

optical-recording-suprathreshold-neural-activity-with-single-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K Aufrufe.  The University of Texas at Austin. Das Verständnis der Funktion des zentralen Nervensystems in Wirbeltieren erfordert Aufnahmen aus, weil viele Neuronen kortikale Funktion entsteht auf der Ebene der Populationen von Neuronen. Hier haben wir ein optisches Verfahren zur überschwelligen neuronale Aktivität mit Single-Cell-und Single-Spike Auflösung aufzeichnen beschreiben, gedithert Random-Access-Scans. Diese Methode records somatischen Fluoreszenz-Calcium-Signale von bis zu 100 Neuronen mit hoher zeitlic...

Serie: Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery. Here we provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting electrode systems. We demonstrate the implantation procedure of both a penetrating and a surface electrode. The surgical process is described from start to finish, including detailed descriptions of each step throughout the procedure. It should also be noted that this video guide is focused towards procedures conducted in rodent models and other small animal models. Modifications of the described procedures are feasible for other animal models.

We provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting chronic neural recording electrodes. Techniques for both penetrating and surface electrode systems are described in a rodent animal model.

Chirurgische Implantation von Elektroden für die Neural Chronische Aufnahme Single Unit Activity und Electrocorticographic Signale

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Forschung

Neurowissenschaften

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktorische Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenetische Störung der neuronalen Aktivität mit Laser Illumination in Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron-Skala Resolution Optical Tomography von Entire Gehirn der Maus mit der konfokalen Mikroskopie Licht Blatt

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

Neuronale Aktivitätsausbreitung in einem ungefalteten Hippocampus Vorbereitung mit einem durchdringenden Mikroelektroden-Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Die extrazelluläre Aufnahme neuronaler Aktivität in Kombination mit Microiontophoretic Anwendung von neuroaktiven Substanzen in Awake Mäuse

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic applications. This protocol describes a fabrication technique of a modified cylindrical nerve cuff electrode to meet these criteria. Minimum computer-aided design and manufacturing (CAD and CAM) skills are necessary to consistently produce cuffs with high precision (contact placement 0.51 &#177; 0.04 mm) and various cuff sizes. The precision in spatially distributing the contacts and the ability to retain a predefined geometry accomplished with this design are two criteria essential to optimize the cuff&#39;s interface for selective recording and stimulation. The presented design also maximizes the flexibility in the longitudinal direction while maintaining sufficient rigidity in the transverse direction to reshape the nerve by using materials with different elasticities. The expansion of the cuff&#39;s cross sectional area as a result of increasing the pressure inside the cuff was observed to be 25% at 67 mm Hg. This test demonstrates the flexibility of the cuff and its response to nerve swelling post-implant. The stability of the contacts&#39; interface and recording quality were also examined with contacts&#39; impedance and signal-to-noise ratio metrics from a chronically implanted cuff (7.5 months), and observed to be 2.55 &#177; 0.25 k&#8486; and 5.10 &#177; 0.81 dB respectively.

This article provides a detailed description on the fabrication process of a high contact-density flat interface nerve electrode (FINE). This electrode is optimized for recording and stimulating neural activity selectively within peripheral nerves.

Die Herstellung von High-Kontakt-Dichte, Flach-Interface Nerve Elektroden für die Aufnahme und Stimulation Anwendungen

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

Analyse der neuronalen Aktivität und Konnektivität mit intrakraniellen EEG-Daten mit SPM-Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Weitfeld-Einzelphotonen optische Aufnahme in Gehirnscheiben mit spannungsempfindlichem Farbstoff

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...