Die Arbeit wurde von der schwedischen Stiftung für strategische Umweltforschung (MISTRA) durch den DOM-Programm und Grant 211684 (BACSIN) aus der Europäischen Union Gemeinschaft Rahmenprogramm FP7 unterstützt. Wir danken J. Engstrand für die Unterstützung bei Dreharbeiten für den X-ray-Analyse und L. Tang für die Hilfe bei der konzeptionellen Erzählung.

1. Anbau und Ernte von P. putida <ol><li> Bereiten Sie ein Starter-Kultur von Pseudomonas putida durch Impfen 100 ml CASO-Bouillon (TSB) mit einer Kolonie von P. putida Zellen auf Agar mit CASO-Bouillon (TSA) ergänzt kultiviert. Halten Sie die Kultur bei 30 ° C auf einem Schüttler bei 130 rpm Bord gesetzt. </li><li> Nach 7 Stunden einen aliquoten aus dem Starter-Kultur entspricht 1/10 der letzte Band der Hauptkultur an die frische TSB-Medium. Halten Sie die Zellen bei 30 ° C auf einem Schüttler bei 130 rpm Bord für 16 Stunden. </li><li> Nach 16 h des Wachstums werden die Zellen durch Drehen der Zellkultur bei 1.500 xg für 20 min bei RT geerntet. Man dekantiert die überstehende und die Zellen werden durch Resuspendieren des Zellpellets in einer NaCl-Lösung, isotonische zum Wachstumsmedium ist. In diesem Fall wird eine 150 mM NaCl-Lösung verwendet. Die Zellen werden dann einmal zentrifugiert und der Überstand vor dem Resuspendieren der Zellen in der Formulierung Medium dekantiert,siehe Schritt 3.2. </li></ol> 2. Der Anbau von anderen Spezies <ol><li> Um das Protokoll zu anderen Bakterienarten passen sich die Anbau-und Ernteverfahren sollte entsprechend den Anforderungen dieser Art geändert werden. Einem osmotischen Schock zu vermeiden, wenn die Handhabung der Zellen während der Ernte und dem Waschschritt (e), muss die Osmolalität der Lösungen, die von dem Wachstumsmedium bei der Ernte entsprechen. </li></ol> 3. Formulierung von Zellen <ol><li> Bereiten Sie die Formulierung Lösungen durch Abwiegen der jeweiligen Matrix-Komponenten und löst sie in Wasser. Um isotonischen Bedingungen zu erreichen, entweder einstellen, wie viel Hilfsstoff oder fügen NaCl oder eine andere Zelle kompatibel solute um den gewünschten Osmolalität zu erreichen. Für Stoffe mit niedrigem Molekulargewicht wie Disaccharide die Mengen können leicht angepasst werden, um isotonischen Bedingungen zu erreichen. Für Substanzen, wie Polymere, die mit hohem Molekulargewicht sind, hat die Tonizität mit Zelle kompatibel so eingestellt werden,Lauten, zB NaCl oder Disaccharide. Beachten Sie, dass jeder Zugabe einer Substanz, die physikalischen Eigenschaften der Formulierung, die ihrerseits Gefriertrocknen Verhalten und das Überleben der Zelle zu beeinflussen beeinflussen können. </li><li> Dekantieren der Waschlösung (in diesem Fall NaCl) und wieder die Zellen in der jeweiligen Formulierung Medien. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Zellen homogen verteilt sind. Formulierungen mit niedriger Viskosität werden verwirbelt während Formulierungen höhere Viskositäten gemischt verwenden, indem zB., Einen Rührstab und Schütteln des Behälters, bis eine homogene Durchmischung erreicht ist. </li><li> Teilen Sie die Formulierungen in Gefriertrockners Fläschchen. Die Ampullen sollte leer gewogen wird, mit der Probe vor und nach dem Gefriertrocknen, um die Menge von Wasser während der Gefriertrocknung entfernt berechnen. </li><li> In Gummistopfen auf den Fläschchen, wenn die Flaschen im Gefriertrockners abgedichtet werden, siehe Schritt 4.3. </li><li> Zählen Sie die Zellen in jeder Formulierung vor Gefriertrocknung, siehe Schritt 6. </li> &lt;/ Ol&gt; 4. Gefriertrocknung <ol><li> Die Gefriertrocknung Bedingungen müssen mit den physikalischen Eigenschaften der Formulierung eingestellt werden. Der wichtigste Parameter ist dabei die Glasübergangstemperatur Tg der Formulierung bezeichnet Tg &quot;für die Gefriertrocknung konzentrierte Probe, um anzuzeigen, dass das Wasser noch vorhanden ist. Die Tg &#39;der Gefriertrocknung konzentrierten Formulierung leicht wird mittels Differential Scanning Kalorimetrie (DSC), siehe Schritt 7. </li><li> Die Parameter des Gefriertrocknungsprozesses, so dass die Temperatur der Probe immer unterhalb der Tg der Probe und der Kammerdruck ermöglicht eine schnelle Sublimation des Eises, dh ersten Trocknung und Restwasser in der Formulierung, dh sekundäre Trocknen. Wenn die Temperatur der Probe oben Tg &#39;während der Trocknung gibt es ein großes Risiko der strukturellen Zusammenbruch der Probe, die erheblich verringern kann die zelluläre Überleben. </li><li> Um die trockene Produkte nach f schützenreeze-Trocknen der Probe Atmosphäre kontrolliert werden muss. Wenn möglich, dichten die Proben in den Gefriertrockner, bevor das Vakuum am Ende der Gefriertrocknung Zyklus freigegeben wird. Alternativ können die Phiolen können mit einer bevorzugten Atmosphäre gefüllt werden. Es ist wichtig zu vermeiden, dass die Proben an die Umgebungsbedingungen wie Feuchtigkeit oder Sauerstoff, die in dem Speicher Atmosphäre beeinflussen das Überleben der Zellen. </li><li> Wiegen Sie die Fläschchen. </li></ol> 5. Rehydrierung <ol><li> Rehydrieren die Proben mit entionisiertem und sterilem Wasser. Die Menge an Wasser hinzugefügt werden sollte, dass gleich der Menge während der Gefriertrocknung entfernt und wird aus dem Gewicht des leeren Fläschchen derselben Küvette mit der Probe vor und nach dem Gefriertrocknen berechnet. Vortex die Proben hin und wieder dann, bis die Lösungen erscheinen homogen. </li></ol> 6. Enumeration <ol><li> Zeichnen Sie 100 ul von jeder Probe und machen 10-fache serielle Verdünnungen. Von den Verdünnungen von inteRest 100 ul auf TSA-Platten ausplattiert. Die Platten werden bei der Temperatur und der Zeit, die erforderlich inkubiert. </li></ol> 7. Charakterisierung der Formulierung von Freezing Behavior <ol><li> Nehmen Sie eine kleine Menge, 5 - 10 mg, der Probe und setzen Sie ihn in einem DSC-Aluminium-Pfanne mit Deckel. Bereiten Sie eine leere Pfanne als Referenz. </li><li> Stellen Sie die Temperatur DSC-Scan-Programm. Die Kühlung ist damit festgelegt, um den Gefrierpunkt Schritt der Gefriertrocknung Programm zu imitieren. Dies geschieht, da die Kühlung Kinetik der Tg &#39;der hydratisierten Formulierungen beeinflussen können. Bevor die Erwärmungsabtastung beginnt um die Temperatur weit unter dem erwarteten Tg &quot;der untersuchten Formulierungen normalerweise -100 ° C. </li><li> Wählen Sie einen geeigneten Heizrate, normalerweise eine Heizrate von 5 - 40 ° C / min verwendet wird. Das aufgenommene Wärmestrom Signal wird in Watt und wird von der Aufheizgeschwindigkeit beeinflußt werden. Eine höhere Heizrate geben ein größeres Signal von Tg &#39;. </li><li> Stellen Sie den Temperaturbereich, so dass icht gilt sowohl Tg &#39;und das Schmelzen der Formulierung. </li></ol> 8. Messungen der Oberflächenspannung der Hydrated Formulierungen <ol><li> Der Versuchsaufbau ist in diesem Experiment verwendet wird, nach dem du Noüy Methode zur Oberfläche zu messen. </li><li> Reinigen Sie die Platin-Ring und die Meßgefäßes sorgfältig. Der Behälter wird mit Aceton gespült, wischte mit einem fusselfreien Tuch, und dann auf der Innenseite mit einer farblosen Flamme verbrannt. Der Ring leuchtet rot in einer farblosen Flamme. </li><li> Füllen Sie den Behälter mit der Lösung und lassen Sie die Oberfläche vor der Messung zu begleichen. Für Lösungen, bei denen der Gleichgewichtszustand erst nach langer Zeit erreicht ist, z. B. Polymere, wird das einfache Setup verwendet hier qualitative Daten. </li><li> Bei Formulierungen mit hohen Viskositäten, z. B. Lösungen von 2% (w / w) HEC oder HPMC weist die Oberflächenspannung auf Lösungen mit niedrigen Konzentrationen gemessen und extrapoliert. Dies kann durch die Tatsache zunutze gemacht, dassder Abfall der Oberflächenspannung einpendelt bei Konzentrationen unterhalb von 0,5% (w / w). </li></ol> 9. X-ray Analysis der trockenen Formulierungen <ol><li> Nehmen Sie eine kleine Menge von Matrix / Bakterien und laden Sie es auf einem Probenhalter. </li><li> Montieren Sie den Probenhalter in die X-ray-Diffraktometer. </li><li> Um eine kristalline Phase in der Probe zu analysieren die EVA-Programmpaket von Bruker eingesetzt werden. </li></ol> 10. Electron Microscopy <ol><li> Nehmen Sie eine kleine Menge von Matrix / Bakterien aus den Fläschchen und befestigen Sie es auf einem SEM Stummel. </li><li> Legen Sie die Halterung in der SEM Sputter-Coater (Thermo VGScientific Polaron SC7640 in der vorliegenden Arbeit verwendet) und Mantel der Probe mit einem wenige nm Au / Pd oder Pt. In diesen Experimenten wurde die Sputter-Parameter waren: 1900 V, 20 mA und 20 sec bei einer ~ 5 - 10 nm Au / Pd-Beschichtung. Die Beschichtung reduziert die elektrische Aufladung während der Bildaufnahme. Es wird empfohlen, mit einer dünnen Schicht beginnen und, wenn Aufladung besteht und bewirkt BildArtefakte, sollte die Probe erneut beschichtet werden. </li><li> Legen Sie die Halterung in der SEM SEM Kammer. Wählen Sie den entsprechenden Bildparameter. Für das Instrument in Abbildung 2 (FEI Strata DB235) verwendeten wir verwendet 5 kV Beschleunigungsspannung, Lichtfleck 3, einem Arbeitsabstand von 5 mm und der Sekundärelektronen-Detektor. </li><li> Optional ist es möglich, den fokussierten Ionenstrahl zu verwenden, um Querschnitte der Bakterien in dem Polymer eingebettet sind, um weitere Einzelheiten sichtbar zu machen. </li></ol>

<ol>
	<li>Wessman, P., Mahlin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+matrix+properties+on+the+survival+of+freeze-dried+bacteria.">Impact of matrix properties on the survival of freeze-dried bacteria.</a> J. Sci. Food Agric. 91 (14), 2518-2528 (2011).</li><li>Ablett, S., Izzard, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Scanning+Calorimetric+Study+of+Frozen+Sucrose+and+Glycerol+Solutions.">Differential Scanning Calorimetric Study of Frozen Sucrose and Glycerol Solutions.</a> Journal of the Chemical Society-Faraday Transactions. 88 (6), 789-794 (1992).</li><li>Knopp, S. A., Chongprasert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+type+TMDSC+curve+of+frozen+sucrose+solutions+and+collapse+during+freeze-drying.">The relationship between type TMDSC curve of frozen sucrose solutions and collapse during freeze-drying.</a> Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 54 (2), 659-672 (1998).</li><li>Crowe, J. H., Leslie, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Vitrification+Sufficient+to+Preserve+Liposomes+during+Freeze-Drying.">Is Vitrification Sufficient to Preserve Liposomes during Freeze-Drying.</a> Cryobiology. 31 (4), 355-366 (1994).</li><li>Jain, P., Sen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glass-forming+biopreservatives+on+head+group+rotational+dynamics+in+freeze-dried+phospholipid+bilayers:+A+P-31+NMR+study.">Effect of glass-forming biopreservatives on head group rotational dynamics in freeze-dried phospholipid bilayers: A P-31 NMR study.</a> Journal of Chemical Physics. 131 (2), (2009).</li><li>Stock, J. B., Rauch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+Space+in+Salmonella-Typhimurium+and+Escherichia-Coli.">Periplasmic Space in Salmonella-Typhimurium and Escherichia-Coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 252 (21), 7850-7861 (1977).</li><li>Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anhydrobiosis.">Anhydrobiosis.</a> Annual Review of Physiology. 54, 579-599 (1992).</li><li>Leslie, S. B., Israeli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+and+Sucrose+Protect+Both+Membranes+and+Proteins+in+Intact+Bacteria+during+Drying.">Trehalose and Sucrose Protect Both Membranes and Proteins in Intact Bacteria during Drying.</a> Applied and Environmental Microbiology. 61 (10), 3592-3597 (1995).</li><li>Nesarikar, V. V., Nassar, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cations+and+anions+on+glass+transition+temperatures+in+excipient+solutions.">Effect of cations and anions on glass transition temperatures in excipient solutions.</a> Pharmaceutical Development and Technology. 12 (3), 259-264 (2007).</li><li>You, Y., Ludescher, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sodium+chloride+on+molecular+mobility+in+amorphous+sucrose+detected+by+phosphorescence+from+the+triplet+probe+erythrosin+B.">The effect of sodium chloride on molecular mobility in amorphous sucrose detected by phosphorescence from the triplet probe erythrosin B.</a> Carbohydr. Res. 343 (2), 350-363 (2008).</li><li>Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Nguyen, K. H. N., Crowe, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+vitrification+involved+in+depression+of+the+phase+transition+temperature+in+dry+phospholipids.">Is vitrification involved in depression of the phase transition temperature in dry phospholipids.</a> Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1280, 187-196 (1996).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Motiv für diese Studie war es, einige Eigenschaften, die Formulierung von Bedeutung für das Überleben der Zelle während der Gefriertrocknung kann untersuchen. Obwohl der innere Trocknung Toleranz variiert zwischen verschiedenen Spezies, wie in 1A, der Trend ab, wie gut die verschiedenen Formulierungen Unterstützung Zellüberleben ist ähnlich dargestellt. Es ist aufschlussreich, mit einem Vergleich der Saccharose und Ficoll starten. Es wird angenommen, dass ein wesentlicher Faktor für eine For...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll PM 400</td>
			<td>GE-healthcare</td>
			<td>17-0300-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEC (Natrosol-M Pharm Grade)</td>
			<td>Ashland</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Gift from Ashland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPMC (Methocel F4M)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2395</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71376</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105459</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105458</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyostar II</td>
			<td>FTS Kinetics</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyris Diamond DSC</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>N.A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>N.A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kr&uuml;ss Educational Tensiometer</td>
			<td>Kr&uuml;ss</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulations for freeze-drying of bacteria and their influence on cell survival

Cellular Wasser entfernt werden, um reversibel inaktiviert Mikroorganismen Lagerung zu erleichtern. Eine solche Methode der Entfernung ist die Gefriertrocknung, die als eine sanfte Dehydratisierung Verfahren. Um das Überleben der Zellen während des Trocknens zu erleichtern, werden die Zellen häufig formuliert vorher. Die Formulierung bildet eine Matrix, die die Zellen eingebettet und schützt sie vor verschiedenen schädlichen Belastungen der Zellen beim Einfrieren und Trocknen eingeführt. Wir stellen Ihnen hier eine allgemeine Methode, um die Überlebensrate der Zellen nach Gefriertrocknung bewerten und wir zeigen es durch den Vergleich der Ergebnisse mit vier verschiedenen Formulierungen erhältlich: das Disaccharid Saccharose, die Saccharose abgeleitet Polymer Ficoll PM400 und die jeweiligen Polysaccharide Hydroxyethylcellulose (HEC ) und Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), auf zwei Bakterienstämme, P. putida KT2440 und A. chlorophenolicus A6. In dieser Arbeit, die wir zeigen, wie Formulierungen für die Gefriertrocknung vorbereitet und wie man die mechanische untersuchenIsmen des Überlebens von Zellen nach der Rehydratation durch Charakterisierung der Formulierung unter Verwendung der Differential-Scanning-Kalorimetrie (DSC), Messungen der Oberflächenspannung, Röntgenstrukturanalyse und Elektronenmikroskopie und über diese Daten zu Überlebensraten. Die Polymere wurden gewählt, um eine monomere Struktur des jeweiligen Polysaccharids ähnlich Saccharose in unterschiedlichem Grad zu erhalten. Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass Setup Polymere können das Überleben der Zelle so effektiv zu unterstützen, wie Disaccharide wenn bestimmte physikalische Eigenschaften der Formulierung 1 gesteuert werden.

Tabelle 1: Daten Formulierung Zusammensetzung thermischen Ereignisse durch DSC bei Erwärmung des gefrorenen Formulierungen Struktur der trockenen Proben und der Oberflächenspannung der Formulierung Lösungen aufgenommen. Die T g &#39;von Saccharose auf -40 ° C 2, 3 festgelegt und kann schwierig sein, für Saccharose-Konzentrationen unter 20% w / w zu erkennen. Die thermische Ereignis bei -35 ° C wird wahrscheinlich zu Beginn der Eis Auflösung 2 verwandt. Di...

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Formulations for Freeze-drying of Bacteria and Their Influence on Cell Survival

Die Gefriertrocknung ist oft eine einfache und bequeme Möglichkeit, um trockene Produkte lebensfähiger Bakterienzellen zu erhalten. Ein Problem des Verfahrens ist das Überleben der Zelle. Wir hier ausführlich ein Verfahren zu untersuchen, wie das Überleben der Zelle während der Gefriertrocknung durch die Eigenschaften der verwendeten Formulierung beeinflusst wird.

Formulierungen für die Gefriertrocknung von Bakterien und deren Einfluss auf Zellebensdauer

Cellular water can be removed to reversibly inactivate microorganisms to facilitate storage. One such method of removal is freeze-drying, which is ...

formulations-for-freeze-drying-bacteria-their-influence-on-cell

Research

JoVE Journal

Biology

23.2K Aufrufe.  Swedish University of Agricultural Sciences. Die Gefriertrocknung ist oft eine einfache und bequeme Möglichkeit, um trockene Produkte lebensfähiger Bakterienzellen zu erhalten. Ein Problem des Verfahrens ist das Überleben der Zelle. Wir hier ausführlich ein Verfahren zu untersuchen, wie das Überleben der Zelle während der Gefriertrocknung durch die Eigenschaften der verwendeten Formulierung beeinflusst wird.

Serie: Formulations for Freeze-drying of Bacteria and Their Influence on Cell Survival

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made significant contributions to our understanding of the co-evolution of eukaryotes with their microbiota. The symbiotic association between the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and the bioluminescent bacterium Vibrio fischeri has been utilized as a model system for understanding the effects of beneficial bacteria on animal development. Recent studies have shown that macrophage-like hemocytes, the sole cellular component of the squid host's innate immune system, likely play an important role in mediating the establishment and maintenance of this association. This protocol will demonstrate how to obtain hemocytes from E. scolopes and then use these cells in bacterial binding assays. Adult squid are first anesthetized before hemolymph is collected by syringe from the main cephalic blood vessel. The host hemocytes, contained in the extracted hemolymph, are adhered to chambered glass coverslips and then exposed to green fluorescent protein-labeled symbiotic Vibrio fischeri and non-symbiotic Vibrio harveyi. The hemocytes are counterstained with a fluorescent dye (Cell Tracker Orange, Invitrogen) and then visualized using fluorescent microscopy.

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

This video will demonstrate how to obtain hemocytes (blood cells) from the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes for use in cell biological and bacterial adhesion assays. Hemocytes will be stained with a fluorescent dye and exposed to GFP-labeled bacteria.

Beziehen Blutzellen aus dem hawaiianischen Bobtail Squid Euprymna scolopes Und die Beobachtung ihrer Einhaltung Symbiotic und Non-symbiotischen Bakterien

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

Forschung

Biologie

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

Erkennung von Post-translationale Modifikationen auf Native Intact Nukleosomen mittels ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

Die Analyse der Funktion von kleinen GTPasen durch Mikroinjektion von Plasmiden in polarisierten Epithelzellen

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Strategien für die Spurhaltung Anastasis, einer Zelle Überleben Phänomen, das Apoptose Kehrt

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Eine standardisierte Methode für die Analyse von Leber sinusoidalen Endothelzellen und ihre Fenestrationen durch Rasterelektronenmikroskopie

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short lifespan, ease of culture, and parthenogenesis that enables clonal culture. However, caution is required when measuring their survival time as it is affected by maternal age and maternal feeding conditions. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of the survival time in Brachionus rotifers following a careful synchronization of culture conditions over several generations. Empirically, poor synchronization results in early mortality and a gradual decrease in survival rate, thus resulting in weak statistical power. Indeed, under such conditions, calorie restriction (CR) failed to significantly extend the lifespan of B. plicatilis although CR-induced longevity has been demonstrated with well-synchronized rotifer samples in past and present studies. This protocol is probably useful for other invertebrate models, including the fruitfly Drosophila melanogaster and the nematode Caenorhabditis elegans, because maternal age effects have also been reported in these species.

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

Rotifers are microscopic zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of survival time in Brachionus rotifers. Synchronization of culture conditions over several generations is of particular importance because maternal condition affects life history of offspring.

Die Messung der Überlebensdauer in<em&gt; Brachionus</em&gt; Rotifers: Synchronisation von Maternal Bedingungen

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

Untersucht die nachteiligen Effekte der Low Druck Plasmasterilisation auf das Überleben von Bacillus Subtilis Sporen mittels Live Cell Mikroskopie

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

Quantifizierung der standortspezifischen Protein Lysin Acetylierung und Succinylation Stöchiometrie mittels Massenspektrometrie Daten-unabhängige Übernahme

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...