Die Autoren bedanken sich bei der technischen Unterstützung von C. Zambataro während der Dreharbeiten zu diesem Protokoll zu bestätigen. Wir danken für die Unterstützung des Glenn Foundation for Medical Research (SM), Die Hillblom Fundament, und die National Institutes of Health für eine Nathan Shock Center Award (P30AG025708) und PO1AG025901. JMF wurde von T32AG000266 verliehen, die Buck Institute for Research on Aging unterstützt.

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	<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst.">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).</li><li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li><li>D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+objective+copy+number+profiling+using+real-time+quantitative+PCR.">Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR.</a> Methods. 50 (4), 262-270 (2010).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anatomy+of+the+Laboratory+Mouse.">The Anatomy of the Laboratory Mouse.</a> Informatics. , (1965).</li><li>Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta.">Aorta.</a> Radiopaedia. , (2008).</li><li>St&#229;hlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling:+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations.">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li><li>Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells.">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).</li><li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart.">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li><li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature,+nurture,+or+chance:+stochastic+gene+expression+and+its+consequences.">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li><li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Freier Zugang und Produktion dieses dieses Artikels ist Sigma-Aldrich gesponsert.</p

Diese Methode hat die Möglichkeit, Kardiomyozyten für eine Reihe von funktionalen als auch Genexpressionsstudien generieren. Die Untersuchung der einzelnen Zellen ist ein aktuelles Gebiet in der Genexpressionsanalyse. Der Vorteil der Untersuchung transkriptioneller Ebene auf der Ebene der einzelnen Zelle ist, dass sie die Prüfung eines reinen Zellpopulation, die nicht aus ganzen Gewebes Vorbereitungen möglich erlaubt. Darüber hinaus ermöglicht einzelne Zelle Analyse für die Prüfung der stochastischen Variation der mRNA-Spiegel in einzelnen Zellen auf Zellpopulationen, die bisher glaubten, eine homogene 8,9 definieren. Neben der Identifizierung von Genen, die möglicherweise stochastische in ihrer Genexpression 10,11,12 sind, die Methode ermöglicht es auch für die Identifizierung von seltenen Zellpopulationen durch ihre Genexpressionsprofile definiert. Während diese Methode bietet eine Reihe von spannenden Einsatzmöglichkeiten in der Genexpressionsanalyse, gibt es some Einschränkungen und Überlegungen in die Verwendung von einzelnen Zellen. Der primäre Beschränkung auf einzelne Zelle Analyse, ist die Sammlung von genügend Zellen in dem Experiment um eine statistische Signifikanz in Bezug auf die Metrik von Interesse zu erreichen, zum Beispiel Varianz. In Fällen, in denen die Zahl der Zellen aus dem Gewebe von Interesse isoliert ist keine Einschränkung, kann man untersuchen, Hunderte von Zellen pro Gruppe, wobei Ansätze wie der nächsten Generation Sequenzierung, oder nanofluidischen Arrays. In einigen Fällen kann es zu Schwierigkeiten bei der Beschaffung genügend Zellen aus dem Gewebe von Interesse sein. Dies kann zum Teil durch eigenwillige zeitintensive Verfahren für die Erhebung der gezielten Zelltyp verursacht werden. Allerdings kann eine sorgfältige Planung und Vorbereitung vor mit einzelnen Zelle Kollektion Verfahren noch einer strengen einzelne Zelle Analyse mit begrenzten technischen Fehler erlauben. Bei der Prüfung der Ergebnisse davon ausgegangen werden muss, dass, obwohl dieses Verfahren zur Isolierung von Zellen in zahlreichen studie verwendet wurdes (einschließlich Mikroskopie, Elektrophysiologie, etc.), könnte die Isolierung selbst potenziell Wirkung Genexpression. Wie bei jeder Methode, die biologischen Proben manipuliert, sollten Sie die Ergebnisse Ihrer Ergebnisse sorgfältig überprüft werden, um sicherzustellen, dass die einzelne Zelle Ausdruck steht stellvertretend für die Gewebe selbst und nicht technische Bias. Methoden wie in-situ-Hybridisierung kann nützlich sein, um diese Ergebnisse in der intakten Gewebe zu überprüfen. Schließlich ist es entscheidend, um sicherzustellen, dass die generierten Daten sorgfältig für die Qualitätskontrolle überprüft. Die Daten in Abbildung 8 zeigt, dass qPCR-Assays können als sehr robust in ihrer Spezifität, wie z. B. Test Nr. 13 (A13) oder haben ein hohes Maß an Variabilität, die technische Varianz wie Assay # 34 (A34) führen kann.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td> Brenztraubensäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 einbasischen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Traubenzucker </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td> Protease, Type XIV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, Type I </td><td> Worthington </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> 1x DNA Suspension Buffer (10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) </td><td> TEKnova, </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Natrium-Pentobarbital </td><td> Henry Schein Vet. Versorgung * </td><td> Kontaktlieferant für die Bestellung </td><td> * Muss durch einen Tierarzt oder Versuchstier professionelle beschafft werden </td></tr><tr><td> ExoSAP IT </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> CellsDirect 2x Rxn Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> SuperScript III RT Platinum Taq Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT-STA Primermischung </td><td> IDT </td><td> Brauch </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease freies Wasser </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50rxn </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> QIAcube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop Spektralphotometer </td><td>NanoDrop </td><td> 2000c </td><td></td></tr><tr><td> BioAnalyzer DNA 7500 Kit </td><td> Agilent </td><td> 7500 Kit </td><td></td></tr><tr><td> Eine Farbe Labeling Kit </td><td> Roche NimbleGen- </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Mus Musculus 12x135k Array </td><td> Roche NimbleGen- </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A Scanner </td><td> Molecular Devices </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex Ganzes Transkriptom Amplification Kit (WTA2 Kit) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes

Während zahlreiche Studien Veränderungen der Genexpression aus Homogenaten von Herzgewebe untersucht haben, verhindert dies die Untersuchung der inhärenten stochastischen Variation zwischen den Zellen innerhalb eines Gewebes. Isolierung von reinen Kardiomyozyten Populationen durch eine Kollagenase Perfusion von Mäuseherzen vereinfacht die Erstellung von einzelnen Zelle Microarrays für die ganze Transkriptom-Genexpression oder qPCR spezifische Ziele mit nanofluidischen Arrays. Wir beschreiben hier ein Verfahren zur einzelnen Zelle Genexpressionsprofile von Kardiomyozyten aus dem Herzen isoliert zu untersuchen. Dieses Paradigma ermöglicht die Auswertung der Messdaten von Interesse, die nicht auf den Mittelwert angewiesen (zB Varianz zwischen den Zellen innerhalb eines Gewebes), die nicht möglich ist, wenn mit konventionellen ganze Gewebe Workflows für die Auswertung der Gen-Expression (Abbildung 1). Wir haben robuste Verstärkung der einzelnen Zelle Transkriptom Nachgeben Mikrogramm doppelsträngigen cDNA, dass der Einsatz von Microarrays auf i erleichtert erreichtndividuelle Zellen. In das Verfahren beschreiben wir die Verwendung von NimbleGen Arrays, die für ihre Benutzerfreundlichkeit und die Fähigkeit, ihr Design anpassen ausgewählt wurden. Alternativ kann ein Reverse-Transkriptase - ermöglicht spezifische Target-Amplifikation (RT-STA) Reaktion, für die qPCR von Hunderten von Zielen durch nanofluidischen PCR. Mit diesen beiden Ansätzen ist es möglich, die Variabilität des Ausdrucks zwischen den Zellen, sowie die Prüfung Expressionsprofile von seltenen Zelltypen innerhalb eines Gewebes zu untersuchen. Insgesamt ermöglicht die einzelne Zelle Genexpression Ansatz für die Generierung von Daten, die möglicherweise identifizieren können eigenwilligen Ausdruck Profile, die typischerweise sind bei der Prüfung Ausdruck von Millionen von Zellen, die aus typischen Homogenaten von ganzen Geweben erzeugt werden gemittelt.

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Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Einzel-Zell-Expression Profiling ermöglicht die detaillierte Genexpressionsanalyse einzelner Zellen. Wir beschreiben Methoden zur Isolierung von Kardiomyozyten, und die Vorbereitung der daraus resultierenden Lysate entweder für ganze Transkriptom-Mikroarray oder qPCR der spezifischen Ziele.

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

single-cell-transcriptional-profiling-of-adult-mouse-cardiomyocytes

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17.2K Aufrufe.  Buck Institute for Research on Aging. Einzel-Zell-Expression Profiling ermöglicht die detaillierte Genexpressionsanalyse einzelner Zellen. Wir beschreiben Methoden zur Isolierung von Kardiomyozyten, und die Vorbereitung der daraus resultierenden Lysate entweder für ganze Transkriptom-Mikroarray oder qPCR der spezifischen Ziele.