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HINWEIS: Alle Verfahren, die die Verwendung von Tieren werden entsprechend der lokalen Gesetzgebung erfolgen. Unsere Arbeit wird von der Sydney Lokale Gesundheit Bezirk Animal Welfare Committee genehmigt. Die zulässigen Verfahren werden in dem Projekt-Lizenz Dokumentation beschrieben und folgen Richtlinien, die das Wohlbefinden des Tieres jederzeit zu gewährleisten. Achten Sie darauf, die Einhaltung der Rechtsvorschriften über Tierversuche des Landes, in dem die Arbeit ausgeführt wird. 1. Protokoll zur Herstellung von EM Fixative <ol><li> Für 100 ml Fixiermittel, bereiten Para durch Zugabe von 2 g Paraformaldehyd Pulver zu 25 ml destilliertem Wasser in einem Erlenmeyerkolben, Hitze bis 65 ° C unter ständigem Rühren mit einem Magnetrührer. HINWEIS: Glutaraldehyd, Para und Natriumcacodylatpuffer sind alle gefährlichen Substanzen und müssen immer in Abzug, behandelt werden. </li><li> Wärme bei 65 ° C für 2 Minuten, dann abkühlen lassen. Falls erforderlich, fügen Sie Natronlauge dropwise unter Rühren zu Lösung vollständig zu löschen. HINWEIS: Natriumhydroxid ist gefährlich, mit Vorsicht handhaben. </li><li> 10 ml EM Sonderschaft Glutaraldehyd, 50 ml von 0,2 M Natriumcacodylatpuffer und 2 g Saccharose und rühren mit Magnetrührer. 2 ml von 1,0 M CaCl 2. </li><li> Auf pH 7,4 vor der Herstellung Lösung auf 100 ml mit destilliertem Wasser. Die endgültige Fixiermittel enthält 2,5% Glutaraldehyd, 2% Paraformaldehyd, 2 mmol CaCl 2, 2% Saccharose in 0,1 M Cacodylatpuffer. Stellen Sie sicher, dass die Gesamt Osmolalität 440 mOsmol / L. Verwenden Sie innerhalb von 24 Stunden der Vorbereitung. </li></ol> 2. Perfusionsfixierung der Leber <ol><li> Warm Perfusionspuffer und Fixiermittel zu 35 bis 37 ºC. Die richtige Temperatur des Puffer Ausbluten und Fixiermittel hilft Gewebeintegrität zu gewährleisten. </li><li> Betäuben des Tieres mit einer einzelnen intraperitonealen Injektion von 50 mg / kg Ketamin und 5 mg / kg Xylazin. </li><li> Sobald das Tier untertiefe Narkose, von der hinteren Gliedmaßen und Schwanz Rückzug Prise beurteilt wird ein Y Schnitt mit stumpfen Enden Schere im Tierleib, die Leber und Pfortader freizulegen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Ausrüstung sauber, um eine Kontamination von Proben mit Mikroorganismen und allgemeinen Schmutz, die sich leicht auf SEM zu sehen sein wird zu vermeiden. </li><li> Binden zwei sehr lose Fäden um die Pfortader einer proximal der Leber, der andere weiter distal in die Leber. </li><li> Kanülieren die Pfortader mit einer entsprechend dimensionierten IV Kanüle (18 G für Ratten, 22 G für Mäuse) .Tighten Nähte Kanüle zu sichern. </li><li> Beginnen Perfusion mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf 37 ºC und bei einem Druck von 10 cm H 2 0. Zwischen 5 und 20 ml PBS ist in der Regel erforderlich, um die Leber exsanguinate. HINWEIS: Nicht, damit Luftblasen, um die Leber durch die an der Kanüle, wie sie veran Artefakte sekundär zu Embolisation und Druck verbunden Rohre geben; Schäden an den Hepatozyten sinusoids und LSEC fenestrations tritt auf, wenn die Perfusion Druck zu hoch ist. </li><li> Trennen die Bauch- und Brust Hohlvene, damit der Puffer frei von der Leber zu verlassen. Dies verhindert, dass hohe Gegendruck Schäden an LSECs. </li><li> Sobald die Leber ist frei von Blut, ersetzen PBS mit EM Fixiermittel und perfundieren ca. 5 Minuten, bis die Leber ist gehärtet und sehr blass. </li><li> Unterbrechen Sie die Perfusion und schneiden Sie die feste Leber in 1-2 mm 3 Blocks mit einem scharfen Skalpell. </li><li> Post-fix Gewebe in EM Fixiermittel für 24-72 h bei 4 ºC. HINWEIS: In der Regel verursacht underfixation mehr Artefakte als overfixation. </li><li> Ändern Sie folgende Fixierungs post-fix Zeitraum auf 0,1 M Natriumcacodylatpuffer für Lagerung bei 4 ºC. HINWEIS: Proben auf diese Weise gespeichert werden für einen längeren Zeitraum (bis zu 12 Monate), aber rechtzeitige sekundäre Fixierung erhalten bleiben und Prüfung für die besten Ergebnisse empfohlen. </li></ol> 3. Nadel Perfusion HINWEIS: Needle Fixierung ist eine Variante der Perfusionsfixierung die Injektion direkt in Fixativ biopsiert Lebergewebe handelt. Ziel ist es, für Fixiermittel, um durch die Blutgefäße, um sie exsanguinate und setzen alle der Gewebeblock zu Fixativ gespült werden. Ist darauf zu achten, um den Einspritzdruck niedrig, um den Druck zu vermeiden Verletzungen 18,19 zu halten. <ol><li> Nehmen Sie ein kleines Stück Leber aus dem Tier oder Gegenstand und spülen in Kochsalzlösung, Blut und Schmutz zu entfernen. </li><li> Zeichnen Sie die physiologische Kochsalzlösung in die Spritze mit einer feinen Nadel (typischerweise eine Insulinspritze) ausgestattet. </li><li> Spritzen Sie die Kochsalzlösung sehr langsam in die Leber, bis Blut aus dem Gewebe gespült. Mehrfachinjektionen erforderlich. </li><li> Zeichnen Sie die EM Fixiermittel in eine andere Spritze mit einer feinen Nadel (typischerweise eine Insulinspritze) ausgestattet. </li><li> Spritzen Sie die Fixiermittel sehr langsam in die Leber, bis es hart und tan in Farbe wird. Mehrfacheinspritzungs erforderlich sein. </li><li> Schneiden Sie die festen Leber in 1-2 mm 3 Blocks mit einem scharfen Skalpell. Inkubieren EM Fixativ für 24 bis 72 h 4 ° C. Vor Beginn der Sekundärfixation 3 mal in 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer waschen. </li></ol> 4. Vorbereitung für die Rasterelektronenmikroskopie <ol><li> Waschprobe 3 mal in 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer. Um Lipide zu beheben, senden Sie fixieren die Probe in 2% Osmiumtetroxid in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer für 2 Stunden. HINWEIS: Gründliches Waschen ist sehr wichtig, wie Glutaraldehyd und Osmiumtetroxid Quer reagieren und Artefakte auf SEM. </li><li> Spülen der Proben in zunehmenden Konzentrationen von Ethanol zur Dehydratisierung begonnen. Erste Spülung in 50% Ethanol für 5 Minuten; dann 3-mal für 5 min mit 70% Ethanol; Spülen 3 mal für 5 min mit 90% Ethanol; Spülen 2 mal für 5 Minuten in 100% Ethanol; und schließlich 2 mal Spülen für 10 Minuten in 100% Ethanol (Molekularsieb). </li><li> Entfernen Sie das gesamte Ethanol aus den Proben<html> und ersetzen Sie mit Hexamethyldisilazan (HMDS) in Abzug, und lassen für 10 Minuten. HMDS Entfernen von Gewebeproben und verdampfen lassen. HINWEIS: HMDS ist stark hygroskopisch, wenn kalt daher erlauben, RT, bevor Sie zur abschließenden Entwässerungsschritt zu erreichen. </li><li> Optional montieren Sie die Proben sofort oder legen Sie sie in einem Exsikkator, bis bereit, für SEM montieren. </li></ol> 5. Montage Hinweis: Die korrekte Probenmontage wird die Anzahl der klar abgegrenzten Sinuskurven für die Analyse unter SEM zur Verfügung zu maximieren. <ol><li> Beschriften Sie die Basis der Metall SEM Stubs und gelten doppelseitigen leitfähigen Kohlenstoff-Band an der Spitze der Stichleitungen. </li><li> Visualisieren Proben unter Verwendung eines Binokular, die Oberfläche mit den besten Sinusoide zur nachfolgenden SEM identifizieren. Ort, der Oberfläche nach oben auf dem Kohlenstoffbandoberfläche der Stichleitung. </li><li> Stick Exemplare fest mit dem Stummel, sind nun bereit für die Proben Sputterbeschichtung. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Coating HINWEIS: Die Beschichtung der Probe mit einem feinen Film aus leitfähigem Metall (Gold oder Platin) in ein Zerstäubungsbeschichter Gründen der Probe und schützt sie vor Schäden durch den Elektronenstrahl. Wenn die Beschichtung zu dick Strukturen von Interesse können verdeckt werden. <ol><li> Platz Stummel in die Vakuumkammer der automatischen Fein Zerstäubungsbeschichter, Set-Modus, um die Drehung und automatische Sputterbeschichtung für 45 sec. Verwenden Platinbeschichtung für feinere Details, aber Gold ist ebenfalls geeignet. </li><li> Eine dünne Schicht aus Kohlenstofffarbe auf die Außenflächen der Leberproben angebracht, dabei nicht zur Beschichtung der sinusförmigen Oberflächen. </li><li> Sobald die Proben mit Platin beschichtet und Kohlenstoff Farbe getrocknet sind sie bereit für die Beobachtung auf der SEM. Proben können in einem Exsikkator gelagert werden. </li></ol> 7. Mit dem Rasterelektronenmikroskop <ol><li> Platz Exemplaren in Rasterelektronenmikroskop und Rück Mikroskop Vakuum. &lt;/ Li&gt; <li> Mit Standard-Mikroskop Betriebsverfahren zur Visualisierung von Proben durch, beginnend bei geringer Vergrößerung, die schrittweise Erhöhung Vergrößerung. </li><li> Stellen Sie sicher, das Mikroskop in geeigneter Weise für die Arbeitsabstand, Punktgröße und Astigmatismus angepasst. </li><li> Überprüfen Sie zur Fixierung Integrität. Wenn der LSEC ist meist frei von Lücken und enthält fenestrations Mess 30-250 nm Durchmesser dies in der Regel darauf hin, dass die Probenvorbereitung erfolgreich war. </li><li> Wenn die Sinuskurven sind voll von Lücken oder ohne Fensteranordnungen der Probenvorbereitung nicht erfolgreich war oder eine signifikante Pathologie. In diesem Fall schneiden die Probe mit einer sehr feinen Rasierklinge, und die Schnittflächen neu beschichtet und für die erfolgreiche Festsinuskurven analysiert. </li><li> Bei ca. 15.000-20.000 facher Vergrößerung wählen Flach LSEC Oberflächen, die frei von Schmutz mit guter Fixierung und wo die Fensteranordnungen deutlich sichtbar sind (in der Regel, die mindestens 10 Fensteranordnungen sind). </li><li> Bilder von mindestens 10 Sinuskurven zu speichern pro Leber, aus verschiedenen Bereichen der Blöcke unter Verwendung von mindestens zwei Blöcken pro Leber. Probenahme 10 Mikroaufnahmen bei 15.000 - 20.000-facher Vergrößerung pro Tier ist in der Regel ausreichend für die Quantifizierung der Fensteranordnungen, um stellvertretend für die gesamte Leber. </li></ol> 8. Analyse HINWEIS: ImageJ-Software, die von der NIH kostenlos heruntergeladen werden kann wird verwendet, um Fensterdurchmesser und Frequenz (Quantifizierung <a href="http://imagej.nih.gov/ij">www.imagej.nih.gov/ij</a> ). <ol><li> Bild öffnen J und stellen Sie die Waage mit der Maßstabsleiste im Bild (Screen shot 1) eingebettet ist. </li><li> Unter Verwendung der Polygon-Werkzeug in ImageJ, Spur um den gesamten flachen Bereich der LSEC einschließlich gefenstert und defenestrated Bereichen. Nicht nur verfolgen Sie die Siebplatten da dies fälschlich aufzublasen Porosität. Schließen alle großen Trümmerstücke, die auf der Zelloberfläche, die obscuri werden können, sindng Fensteranordnungen. </li><li> Zur Messung der Fensterdurchmesser, Spuren eine Linie durch den längsten Durchmesser jedes Fenster indem Sie das Linienwerkzeug aus und drücken Sie &quot;m&quot;, um die Linie zu messen, und &quot;d&quot; (zu ziehen), um die Linie auf das Bild dauerhaft zu ziehen. Diese Linie wird als die Fensterdurchmesser. Die Länge der Leitung wird nun zur Verfügung stehen im Ergebnisfeld von ImageJ (Screen shot 2). </li><li> Messen alle Lücken, die größeren Löcher im LSEC Zytoplasma als 250 nm sowie fenestrations sind. Lücken sind oft Artefakte reflektierenden schlechter Durchblutung oder Fixierung jedoch Lücken können auch als Folge von Krankheit und Toxizität auftreten. Die Daten für die Lücken aus Berechnung der Fensterparameter später in der Analyse ausgeschlossen werden. </li><li> Der Bereich der Lücken, die nicht kreisförmig sind, sollten von Tracing um die Lücken und die Berechnung ihrer Fläche auf ImageJ berechnet werden. </li><li> Fügen Sie die Daten aus der Box in ImageJ Ergebnisse in eine Excel-Tabelle für further Analyse. </li></ol> 9. Berechnungen <ol><li> Durchschnittliche Fensterdurchmesser = Durchschnitt aller Fenster Durchmesser (ohne Lücken, wo Lücken ≥ 250 nm). </li><li> Fläche = Fenestration pgr; r 2, wobei r der Radius, von dem einzelne fenestrations Durchmesser (r = d / 2), ohne Lücken berechnet. </li><li> Porosität (%) = (Σ (&amp; pgr; r 2) / Gesamtfläche analysiert - Σ (Bereich der Lücken =)) (&amp; mgr; m 2)) × 100. </li><li> Fenestration Frequenz = Gesamtzahl der fenestrations / (Gesamtfläche analysierten-Σ (Bereich der Lücken) (&amp; mgr; m 2). </li></ol> 10. Präsentation der Fenestration Daten Hinweis: Wann immer möglich, Publikationen, darunter die Quantifizierung von Fenster Daten sollten folgende Informationen enthalten <ol><li> Fenestration Durchmesser, mit einer Erklärung bestätigt, was Grenzdurchmesser verwendet werden, um in dem Fensteranordnungen in der Regel zu definieren (zwischen 50 bis 250 nm), Fenestration Frequenz (Zahl / &amp; mgr; m 2) und die Porosität (%). </li><li> Eine Erklärung zur Bestätigung, ob Lücken in der Analyse, Frequenzverteilung Graph der Fensterdurchmesser und die Anzahl der Leber, die Blöcke, Bildern und Fensteranordnungen sollten in die Analyse einbezogen werden einbezogen. </li></ol>

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+oxidative+stress+on+the+liver+sieve.">The effects of oxidative stress on the liver sieve.</a> J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).</li><li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+atomic+force+microscopy+study+on+living+skin+fibroblasts+and+liver+endothelial+cells.">A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).</li><li>Monkemoller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+fenestrations+in+liver+sinusoidal+endothelial+cells+by+optical+localization+microscopy.">Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy.</a> Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die Fähigkeit, den Status der Lebersinus Endothel genau und reproduzierbar zu messen, ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Biologie dieser hochspezialisierten Zellen. Neuere Techniken wie strukturierte Beleuchtung Mikroskopie 32, Rasterkraftmikroskopie 33 und d-STORM (direkte Stochastic Optical Reconstrucion Microscopy) 34 wichtige Informationen vermitteln über die Morphologie dieser Zellen in vitro, aber SEM bleibt die primäre Methode zur Visualisierung und Messung...

Die Lebersinus Endothelzellen (LSECs) sind sehr differenzierte Endothelzellen, die die Wand des hepatischen Sinusoid auszukleiden. LSECs mit Fensteranordnungen, die nicht-blendete perforiert Poren trans 50-250 nm Durchmesser. Bis zu 20% der Oberfläche des LSECs durch Fensterungen, die üblicherweise hunderte genannten Siebböden 1-3 (Figur 1) werden in Gruppen von zehn bedeckt. Fensteranordnungen ermöglichen die Übertragung von Plasma und nanosubstrates zwischen Blut und Hepatozyten, die Schaffung eines hocheffiziente Ultrafiltrationssystem. Fensteranordnungen sind dynamische Strukturen - sowohl ihrer Größe und / oder Anzahl kann als Reaktion auf verschiedene physiologische Zustände, Drogen und Krankheit verändert werden. Zum Beispiel sind Fensterungen im nüchternen größer als im gesättigten Zustand 4; 2-Di-iodoamphetamine erhöht Fensternummer; 5,6 und eine Reduktion der Größe und Anzahl von Fensteranordnungen pro Zelle in Alterung und viele Krankheitszustände 7-13 auftritt </sup&gt;. Genaue Messung der Größe und Anzahl von Fensteranordnungen ist wichtig für das Verständnis, wie LSEC Morphologie wird durch verschiedene Krankheiten, toxische und physiologischen Zuständen beeinflusst; ihre Auswirkungen auf die Leberfunktion; und für die Entwicklung von Fenster modulierenden therapeutischen Interventionen 1. Das Studium der fenestrations ist schwierig. Der Durchmesser der Fensteranordnungen unterhalb der Auflösung der herkömmlichen Lichtmikroskopie, so bisher nur Beobachtung mittels Elektronenmikroskopie sowohl in intakten Lebergewebe oder Zucht LSECs möglich war. Das Rasterelektronenmikroskop (SEM) wurde am häufigsten verwendet, um Fenstergröße, die Frequenz und die Porosität (der Prozentsatz der LSEC Membran, die durch Fensterung perforiert ist) zu studieren, weil SEM ermöglicht die Beobachtung von großen Flächen der endothelialen Oberfläche und Messung von Tausenden wenn nicht Zehntausende von Fensteranordnungen. Trotz seiner Nützlichkeit, die Ergebnisse, die sich aus gemeldet werden SEM-basierte Studien fürLSEC Parameter wie Fenstergröße, die Anzahl, die Häufigkeit und die Porosität variieren weithin in der Literatur beschrieben (Tabelle 1). Fensteranordnungen und Siebplatten sind fragile Strukturen Vertrag zu brechen, erweitern oder zusammenwachsen während der Probenvorbereitung ist somit schonende Verarbeitung benötigt, um ihre Integrität zu bewahren. Erhöhte Perfusionsdruck 14; falsche Osmolarität der Fixiermittel und Puffer 15; unzureichende Fixierung oder Fixierungszeit; und die Geschwindigkeit der Postfixierung Entwässerung und Trocknung sind alle Bereiche der Verarbeitung für SEM, die Artefakte, die mit der Erhaltung der Ultrastruktur eingreifen (Figur 2) erzeugen kann. Verlust Fensterungen (&quot;Fenstersturz) und Fensterung Schrumpfung als Folge der schlechten Fixierung auftreten, was zu einer verringerten Durchmesser und Fensterung Zellporosität. Methoden, um den Erhalt von Proben für die REM-Analyse zu verbessern zuvor 15-17 beschrieben und diskutiert werdenhier mit zusätzlichen Tipps, wie Sie Probekonservierung zu verbessern. Die Hauptziele der Probenkonservierung sind, um Blut von der Sinusoide entfernen, so dass die Oberfläche der LSEC visualisiert und LSEC Schäden die durch Hochdruck oder verzögerte Fixierung zu vermeiden. Ganze Leberperfusion Fixiermittel über die Pfortader ist die bevorzugte Methode für Leberfixierung. Wie im Detail beschrieben, an anderer Stelle muß 16,18 Perfusion bei niedrigem Druck durchgeführt werden (beispielsweise 10 cm H 2 0) in den druckbedingten Artefakte Perfusion und Beschädigungen des LSEC vermeiden, typischerweise manifestiert sich als große Lücken in der Zellmembran. Jedoch können angemessenen Fixierung häufig mittels Nadel Perfusion von Leberbiopsien von Menschen und Tieren gewonnen werden, wie an anderer Stelle beschrieben 19. Diese Technik beinhaltet das direkte Einspritzen Fixiermittel in das Gewebe, bis Blut aus der Probe gespült und das Gewebe fest und fixiert. Fixation von Proben für die Elektronenmikroskopie braucht perf seinORMED möglichst schnell nach Beendigung des Blutflusses zu ultrastrukturelle Veränderungen als Folge der Lebern extrem schnelle autolytische Prozesse zu verhindern. Wir stellen auch ein Verfahren zur Bildanalyse, die der Aufnahme von Artefakten minimiert, und vereinheitlicht die Messung von Fensteranordnungen. Variation bei der Auswahl der Sinuskurven für Mikroaufnahmen, Bildanalyse von Artefakten, und die Messung der Zellbereich für Porosität und Fensterfrequenz haben große Unterschiede in veröffentlichten Ergebnissen geführt. Eine Standardmethode zur Bewertung und Messung der Fensteranordnungen und der Mindestanforderungen für die Datendarstellung nicht eindeutig in der Literatur bisher 4,10,20-31 gerichtet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Name of material</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:93px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:311px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">EM grade Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:93px;">C001</td>
			<td style="width:311px;">Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:311px;">Always prepare Paraformaldehyde fresh</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:155px;">Sodium Cacodylate powder</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">C0250</td>
			<td style="width:311px;">Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:155px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">C1016</td>
			<td style="width:311px;">Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:155px;">Osmium tretroxide</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:93px;">C011</td>
			<td style="width:311px;">Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">Ethanol- Absolute</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>459836&#160;</td>
			<td style="width:311px;">100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Other grades of Ethanol</td>
			<td style="width:100px;">Labtech</td>
			<td style="width:93px;">EL5</td>
			<td style="width:311px;">Prepare graded Ethanols with dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:155px;">Hexamethyldisilazane</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>52619&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Allow to reach room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:155px;">Cannulas</td>
			<td style="width:100px;">Terumo</td>
			<td style="width:93px;">TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C</td>
			<td style="width:311px;">18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">Conductive Carbon tape</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td>IA0201</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:155px;">Carbon Paint</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td>I003</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">Ketamine</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:311px;">Must be optained under licence</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">Xylazine</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:311px;">Must be obtained under licence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:155px;">Molecular Sieve</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">208647</td>
			<td style="width:311px;">Removes water from the 100 % Ethanol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized method for the analysis of liver sinusoidal endothelial cells and their fenestrations by scanning electron microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

Anfangs Visualisierung bei geringer Vergrößerung mit dem Rasterelektronenmikroskop zeigt, eine flache Oberfläche der Leber Probe mit einer exponierten Fläche groß genug, um viele große Lebergefäße und Sinusoide (Figur 1A) zu beobachten. Sicherstellen der korrekten Leberblock Platzierung auf der Montagestummel ist unerlässlich für den Erhalt von klaren Bildern der Sinusoide und die Glisson-Kapsel der Leber sollte aus diesem Grund (1B) vermieden werden. Erhöhen der Vergrößeru...

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A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Eine standardisierte Methode für die Analyse von Leber sinusoidalen Endothelzellen und ihre Fenestrationen durch Rasterelektronenmikroskopie

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Aufrufe.  University of Sydney and Concord Hospital. The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Serie: A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Forschung

Biologie

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Rasterelektronenmikroskopie von Mazerierte Gewebe zu visualisieren die extrazelluläre Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

Die Untersuchung der supramolekulare Organisation Photosynthetic Membranen innerhalb Gefrier gebrochen Blattgewebe von Cryo-Rasterelektronenmikroskopie

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Protokolle für Problematische Pflanze, Oomycete und Pilzproben

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

Vorbereitung der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen mit chemischen Trocknung für die morphologische Analyse in Rasterelektronenmikroskopie (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

Die CryoAPEX-Methode zur Elektronenmikroskopie-Analyse der Membranproteinlokalisierung in ultrastrukturell konservierten Zellen

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission Electron Microscopy (TEM) provided insight into cell ultrastructure, but in the recent decade, the development of modern Scanning Electron Microscopes (SEM) has changed the way of looking inside the cells. Even though the resolution of TEM is superior when protein-level structural details are needed, SEM-resolution is sufficient for the majority of the organelle-level cell biology-related questions. The advancement in technology enabled automatic volume acquisition solutions such as Serial block-face imaging (SBF-SEM) and Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Nevertheless, to this day, these methods remain inefficient when the identification and navigation to areas of interest are crucial. Without the means for precise localization of target areas before imaging, operators need to acquire much more data than they need (in SBF-SEM), or, even worse, prepare many grids and image them all (in TEM). We propose the strategy of "lateral screening" using Array Tomography in SEM, which facilitates the localization of areas of interest, followed by automated imaging of the relevant fraction of the total sample volume. Array tomography samples are conserved during imaging, and they can be arranged into section libraries ready for repeated imaging. Several examples are shown in which lateral screening enables us to analyze structural details that are incredibly challenging to access with any other method.

We describe the preparation of ribbons of serial sections and their collection on large transfer support for use as Array Tomography samples, along with automated imaging procedures in a scanning electron microscope. The protocol allows screening, retrieval, and targeted imaging of local, rare events, and the acquisition of large data volumes.

Array-Tomographie-Workflow zur gezielten Erfassung von Volumeninformationen mittels Rasterelektronenmikroskopie

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-REM) biologischer Gewebeproben

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...