Wir möchten Sarah Dick für die Bereitstellung von kritischen Lektüre und Kommentare. MAR hält den Canada Research Chair in Molecular Genetics und ist ein International Research Scholar des Howard Hughes Medical Institute. Diese Arbeit wurde durch Stipendien an MAR von den National Institutes of Health, der Howard Hughes Medical Institute, die kanadische Institutes of Health Research, die Muskeldystrophie Association und der Canada Research Chair Program unterstützt.

Alle Experimente wurden nach der University of Ottawa Vorschriften für tierische Pflege und Handhabung behandelt. Siehe Tabelle 1 für einen Überblick über das Protokoll. Ein. Vor dem Starten der Isolation <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen: 0,2% Collagenase Typ I in DMEM (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium, hohe Glukose, L-Glutamin mit 110 mg / ml Natriumpyruvat). EDL für zwei Muskeln vorzubereiten 2 ml 0,2% Collagenease in DMEM. Die Lösung wird durch einen 0,22 um-Filter. 10 min vor der Isolierung, vorwärmen auf 37 ° C im Wasserbad. Zusätzliche Aliquote unverdünnten Collagenase kann bei -20 ° C für eine spätere Verwendung eingefroren werden. Anmerkung: Mit DMEM mit Natriumpyruvat in allen der Prozedur. Fasern nicht in Natriumpyruvat-freiem Medium überleben. <ul><li> Waschen Medien (verwenden, um alle Wäschen durchführen). DMEM ergänzt mit 1% Penicillin / Streptomycin. Anschließend wird durch 00,22 um-Filter vor dem Gebrauch. </li><li> Myofiber Kulturmedien. Supplement DMEM mit 20% FBS, 1% Hühnerembryo-Extrakt und 1% Penicillin / Streptomycin. Filtern durch 0,22 um-Filter vor dem Gebrauch. </li><li> Matrigel beschichteten Schalen. Um Kultur Fasern für längere Zeit, empfehlen wir die Verwendung Matrigel als Beschichtung Substrat. Um Matrigel beschichteten Gerichte zubereiten, tauen ein Aliquot Matrigel bei 4 ° C über Nacht. Am Tag nach verdünnen Matrigel 1:10 in DMEM. Halten Matrigel bei 4 ° C zu allen Zeiten und vermeiden abrupte Temperaturänderungen da dies mikroskopischen Kristallen innerhalb der Matrigel-Lösung, was zu einer ungleichmäßigen Beschichtung zu schaffen. Ort Gerichten auf Eis überzogen werden. Coat Gerichte mit gerade genug Volumen, um die Oberfläche zu bedecken. Lassen Sie es für 1 min sitzen. Vollständig zu entfernen die übrig gebliebenen Matrigel. Lassen Sie Speisen trocken bei 37 ° C für mindestens 3 Stunden vor dem Gebrauch oder über Nacht. </li></ul> Hinweis: Aliquots der verdünnten Matrigel kann mehrfach für die Beschichtung Zweck wieder verwendet, wenn bei 4 &amp; de gespeichertg; C. </li><li> Schließlich sollten Sie das Mikroskop Station und Sezieren Werkzeuge mit 70% Ethanol reinigen. </li><li> Für zwei EDL Isolationen (eine Maus) vorzubereiten fünf Kunststoff-Petrischalen (60 * 15mm) wie folgt: <ul><li> Vier Gerichte für die Isolierung (1 für Muskel-Dissoziation, 3 für serielle Wäschen). Alle Gerichte müssen mit Pferdeserum (HS) beschichtet werden, um Muskelfasern von der Befestigung auf Kunststoff zu vermeiden. Zu beschichten, Pipette 3 ml Pferdeserum in jede Schale, wirbeln um eine gleichmäßige Beschichtung zu ermöglichen, entfernen Sie das Pferdeserum und lassen die Schale trocken für mindestens 30 min. 4 ml DMEM zu jedem Gericht. Halten Schalen bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Inkubator vor dem Gebrauch. </li></ul> Hinweis: Pferdeserum kann mehrfach wiederverwendet werden, wenn steril gehalten. Alternativ kann eine Lösung von 10% HS in DMEM zu beschichten Speisen verwendet werden. Verwenden HS beschichtete Platten während des gesamten Protokolls und bei der Kultivierung Muskelfasern auf schwimmenden Bedingungen. <ul><li> Ein Gericht wird zu Kultur Muskelfasern nach der Isolierung verwendet werden. Alternative Teller Größen oder Formate können für die endgültige Kultur der Muskelfasern abhängig Downstream-Anwendungen verwendet werden. Allerdings wissen wir nicht vorschlagen, Teller Größen größer als 60 * 15mm. Muskelfasern können in Suspension nicht länger als 96 Stunden aufbewahrt werden, bevor hyper Kontraktion auftritt. Für mehr Kultur Zeiten, empfehlen wir die Verwendung Matrigel beschichteten Schalen oder Platten. </li></ul></li><li> Für eine Faser Trennung (2 EDL), bereiten zwei sterile Pasteur Pipetten: eine große Bohrung Pipette für Muskel-Handling und eine kleine Bohrung Pipette für myofiber Manipulation. Verwenden Sie ein Diamant-Stift, um jede Glaspipette auf die gewünschte Länge und Wärme polieren Pipette Kanten zu glätten geschnitten. Durch die Verwendung der Flamme, Kurve die Spitze des kleinen Bohrung Pipette. Dies wird dazu beitragen die Handhabung einzelner Fasern. Flamme zu sterilisieren. Coat jede Pipette mit HS vor dem Gebrauch. </li></ol> 2. Muscle Dissection und Verdauung <ol><li> Für den Zweck dieser Experimente, 8 Wochen alt SV129, Pax7 Creer Cklr; Rosa26TdTomato (Pax7Cre-TdTomato) und Myf5-Cre; Rosa26YFP verwendet wurden. </li><li> Sprühen Hinterbeine mit 70% Ethanol. Merken das Tier (face up) auf einer Trägerplatte, um ein besseres Verständnis der Hintergliedmaße während des Verfahrens haben. </li><li> Mit Hilfe der Schere, durch die gesamte Länge des Gliedes schneiden und legen das darunterliegende Muskel. Entfernen Sie die Haut sowie keine Haare oder Fell (Abbildung 1A). </li><li> Mit einer feinen Schere, durch die dünne Faszie geschnitten, ohne die darunter liegenden Muskeln. Optisch zu lokalisieren die EDL. Die EDL ist im vorderen Fach des Hinterbein knapp unterhalb des Tibialis Anterior (TA) Muskel gefunden. </li><li> Mit Hilfe von zwei Zangen, setzen die distalen Sehnen. </li><li> Schneiden Sie den distalen Sehnen (sowohl der TA und EDL) mit scharfen Cohann-Vannas Frühjahr Schere. </li><li> Mit Hilfe einer Zange halten sowohl TA und EDL Muskeln durch ihre Sehnen und zart ziehen Sie die Muskeln um bis zum proximalen Ende. An diesem Punkt sollten Sie in der Lage sein, klar zu sehenDie EDL Muskel knapp unterhalb der TA Muskel. Jetzt trennen die EDL aus der TA Muskel durch Ziehen an den beiden Sehnen in entgegengesetzte Richtungen (Abbildung 1B). Vermeiden Sie Dehnen der EDL Muskel während Sie diesen Vorgang ausführen, da dies die Muskelfasern beschädigt wird. </li><li> Setzen Sie die EDL Sehne. Zur besseren Visualisierung der proximalen Sehne kann es an dieser Stelle helfen, die TA Muskel zu entfernen. Es kann auch helfen abzuschneiden einige das Bindegewebe um das Knie (Abbildung 1C). </li><li> Schneiden Sie die proximale Sehne und entfernen Sie vorsichtig die EDL (1D). </li><li> Durch Halten des Muskels durch ihre Sehnen, dann in 2 ml des zuvor hergestellten Kollagenaselösung. Bei 37 ° C im Wasserbad. Hinweis: Isolierung für erfolgreiche Faser, ist es wichtig, die EDL aus Sehne-Sehne so isolieren, daß die myofiber Integrität aufrechterhalten wird. Schritte können von 2,3 bis 2,9 unter einem Präpariermikroskop durchgeführt werden. Alternativ kann die Verwendung eines magndern, indem Glas kann auch dazu beitragen, eine bessere Sicht auf die Muskeln. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 2,3 bis 2,9, die zweite EDL zu isolieren. Übertragen Sie die zweite EDL in das gleiche Rohr. Um ungleichmäßige Verdauung zu vermeiden, sollte die Isolierung des zweiten EDL nicht mehr als 5 min nach dem ersten auszufüllen. Hinweis 1: Inkubationszeit muss möglicherweise angepasst je nach Kollagenase-Aktivität werden. Längere oder kürzere Inkubationszeit ist möglicherweise erforderlich, je nach Größe, Alter und / oder Muskel-Zustand (zB fibrotische Muskeln brauchen mehr Verdauung Zeit). Hinweis 2: Wenn die Prüfung Satelliten-Zellen Verhalten unter quiescence Bedingungen Agitation während Muskel Aufschlusszeit aktivieren können Satelliten-Zellen 10. </li><li> Während der Verdauung Zeit, regelmäßig zu überprüfen, den Muskel über-Verdauung zu vermeiden. Stoppen Sie die Verdauung, wenn die Muskeln zu lockern beginnen und Muskelfasern sind sichtbar. Zur Verdauung zu stoppen, transferieren es vorsichtig in beide Muskeln eine vorgewärmte Petrischale mit 4 ml DMEM (dissociatiauf Teller). Nutzen Sie den großen Bohrung Pipette, um diesen Vorgang durchzuführen. Hinweis: Vermeiden Sie Muskeln overdigestion da dies unweigerlich in der Isolation hyper vertraglich Muskelfasern. </li></ol> 3. Einzel Myofiber Dissoziation und Kultur <ol><li> Um Muskelfasern freizugeben, verwenden Sie die große Bohrung Glaspipette, um den Muskel mit warmem Medium spülen, bis Fasern natürlich beginnen freigegeben wird. Nicht verreiben den Muskel, da dies zwangsläufig schädlich Fasern führen. Führen Sie diese und die folgenden Schritte unter einem Binokular. </li><li> Weiter Loslassen Muskelfasern, bis die gewünschte Zahl erreicht ist. Wenn der Teller bei Raumtemperatur für mehr als 10 min erforderlich erlauben eine 5 min (minimale) Inkubation bei 37 ° C, 5% CO 2 wieder äquilibrieren das Medium. Anmerkung: Wenn Füllgut bis Temperaturen unter physiologischen (37 ° C) über einen längeren Zeitraum Muskelfasern wird sterben. </li><li> Mit der geringen Größe Bohrung Pipette transfer leben einzelnen Muskelfasern zu einer neuen vorgewärmte Schüssel (erste von drei aufeinanderfolgenden Waschungen). Fassen myofiber individuell statt der Übertragung Großteil der Muskelfasern auf einmal. Falls erforderlich, Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 für 10 bis 15 min erneut äquilibrieren das Medium. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3,3 für 2 weitere Male oder bis alle tot Muskelfasern und Schmutz entfernt werden. Wir empfehlen mindestens drei aufeinanderfolgenden Waschungen für eine ordnungsgemäße Reinigung. Hinweis: dead Muskelfasern erscheint so kurz und hyper Vertrag unter dem Mikroskop Licht. </li><li> Inkubieren einzelnen Muskelfasern bei 37 ° C, 5% CO 2 in der letzten Waschung Näpfe (DMEM nur) für mindestens eine Stunde vor dem Umschalten in Kulturmedium. Dies ermöglicht Muskelfasern um die in vitro-Bedingungen in Abwesenheit von Serum einzustellen. Wir fanden, dass die sofortige Kultur der Muskelfasern im Serum Vollmedium erhöht Faser Schrumpfung. </li><li> Nach einer Stunde, übertragen Muskelfasern zu einer neuen vorgewärmten Teller oder in den entsprechenden Kultur-Formatin Abhängigkeit von der stromabwärts Anwendung. Kultur Fasern in hoher Serum-Medium zu ermöglichen Satelliten-Zell-Aktivierung. Alternativ können unterschiedliche Konzentrationen von Serum oder Hühnerembryo-Extrakt eingesetzt werden. Ändern Medium jeden zweiten Tag. </li></ol> 4. Downstream-Anwendungen <ol><li> Immunfärbung. Live Muskelfasern festlegbar und zu jedem Zeitpunkt angefärbt werden während der Isolierung. Immunfluoreszenz kann sowohl schwimmend und Substrat-attached Muskelfasern durchgeführt werden. Wenn Flecken floating Muskelfasern, verwenden Sie eine kleine Bohrung Glaspipette um Muskelfasern von einer Lösung auf ein anderes übertragen. Alternativ ist es möglich, in der gleichen Muskelfasern gut halten im ganzen Verfahrens und Hinzufügen / Entfernen von Lösungen unter Verwendung einer Glaspipette. Vermeiden Standard Aspiration da dies die Entfernung der Muskelfasern sowie führt. Kurz gesagt, vollständig zu entfernen Kulturmedium; fix Muskelfasern in vorgewärmten 4% Paraformaldehyd (PFA) für 5 min. Weitgehend in PBS mehrmals waschen. Incubate Muskelfasern in 1% Glycin in PBS oder andere Standard-Abschrecken Lösungen zur Minimierung PFA Hintergrundfärbung. Falls erforderlich, permeabilisieren Muskelfasern mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 10 min durch einen 5 min Waschschritt in PBS. Inkubieren Fasern in Blockierungslösung (10% Pferdeserum, 0,1% Triton X-100, 1% NaN) für 1 h bei Raumtemperatur oder vorzugsweise über Nacht bei 4 ° C. Alternative Blockierungslösungen können verwendet werden, abhängig von der Antikörper von Interesse. Waschen einmal in PBS für 5 min. Inkubieren mit dem entsprechenden primären Antikörper in Blocking-Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° verdünnt C. Waschen Fasern 3 mal in 5 min pro Waschgang in PBS, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen. Inkubieren mit dem entsprechenden sekundären Antikörper für 45 min bis 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie 3 mal in 5 min pro Waschgang in PBS. Gegenfärbung Kerne mit 1 mg / ml DAPI. Wenn Anfärben schwimmenden Fasern, jede Faser übertragen auf einen Glasobjektträger für Mikroskopie. Entfernen Sie überschüssiges PBS oder Medium. Bewerben Montage medium und fügen Sie dann das Deckglas. Fahren Sie mit Muskelfasern unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen. Siehe Abbildung 4 für repräsentative Immunfluoreszenz auf EDL Muskelfasern. Alternative Färbeverfahren Verwendung stärkerer Fixiermitteln in Verma, M. et al. 11 und Wosniak, AC et al. 12 beschrieben. </li><li> Oligonukleotid oder Plasmid transienter Transfektion. Live Muskelfasern mit Plasmid-oder siRNA für spezifische Gen / s von Interesse transfiziert werden. Bei der Verwendung von siRNA, ist doppelt Transfektion für eine effiziente Gen-Knockdown empfohlen. Wir empfehlen die Durchführung der ersten Transfektion nach 8 Stunden aus der Isolation. Sechs Stunden nach der Transfektion mit frischem Medium ersetzt. Für siRNA-Transfektion, schlagen wir ausgehend unter Verwendung einer Endkonzentration von 50 nM. Genexpression knockdown kann durch RNA-Extraktion oder vorzugsweise durch Immunfärbung analysiert werden. </li><li> Virusinfektion. Infektion von lebenden Muskelfasern ist möglich, obwohl die Inzidenz der ZelleTod ist höher als mit Oligo Transfektion und die Effizienz der Infektion kann variabel in Abhängigkeit von Muskelerkrankungen und Alter aufweisen. Zum Beispiel sind intakt erwachsenen Muskel Muskelfasern insbesondere nicht in Reaktion auf virale Infektion durch die Anwesenheit von die Basalmembran von dem gezeigt wurde, um eine Schutzbarriere gegen Infektion Host 13, 14 vorzusehen. Lentivirale Vektoren werden über retrovirale Vektoren bevorzugt, weil sie Ruhestrom (nicht mitotischen Zellen) infizieren können. Bei viralen Infektionen, ist es ratsam, Kultur Fasern auf einer Matrigel beschichteten Teller oder Platte und lass Muskelfasern Medienberichten Bedingungen für die ersten 24 Stunden einzustellen. </li><li> Live-Imaging. Leben Bildgebung von Muskelfasern ist besonders zeitaufwendig und erfordert ein Mikroskop mit einem 37 ° C, 5% CO 2-Kammer ausgestattet. Es ist sinnvoll, bei der Beurteilung des Verhaltens der einzelnen Satelliten-Zellen. Arbeit mit dieser Technik wurde für die Entdeckung der Satelliten-Zell-Heterogenität instrumentalen und ihre beha studierenVior auf Fasern (15 und 16). </li></ol>

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Keine konkurrierenden Interessen.

Die Isolierung und Kultivierung von einzelnen Muskelfasern aus intakten Muskeln eine ausgezeichnete in vitro-Modell, um den Prozess der Muskelregeneration studieren. Ein einzigartiges Merkmal dieses Systems ist die Erhaltung der Satelliten-Zellen in ihrer physiologischen Umgebung unterhalb der Basallamina. Vor allem aber können die Technik verwendet, um Muskeln Stammzellverhaltens sowohl Ruhe und aktivierten Zustände zu untersuchen. In den vergangenen 20 Jahren hat sich die myofiber Kultursystem aussagekräftige Einblicke in die Biologie des Satelliten-Zell-Population, die mit Bezug auf die beiden inneren und äußeren Determinanten. Durch Kultivierung einzelnen Muskelfasern, hat Satelliten-Zell-Heterogenität in Bezug auf myofiber, Muskel-Typ oder regenerative Potenzial wurde 15 gerichtet. Aufwändige Untersuchungen mit Live-Bildgebung von einzelnen kultivierten Fasern für die Einholung von Informationen über Satellit Zellmigration Muster 16 erlaubt. Der Erwerb von quantitativen Daten ist einelso möglich. Obwohl zeitaufwendig, bietet es wichtige Informationen über die Verteilung und das Auftreten von bestimmten Ereignissen (Stammzellen asymmetrische Teilung, Vermehrung und Differenzierung Verhältnis, etc.). Zusammen mit den zuvor beschriebenen Anwendungen ist Protein oder RNA-Extraktion aus Einzelfasern auch möglich, obwohl Isolierung reiner Population von Zellen durch FACS Satelliten oder andere Mittel eine bessere Plattform zu Protein oder Genexpression Veränderungen auf molekularer Ebene zu untersuchen vorsehen. In unserer Erfahrung ist der wichtigste Schritt für eine erfolgreiche Faser Trennung der &quot;Sehne Sehne&quot; Isolation (Schritte von 2,5 bis 2,9 im Protokoll Text). Dies gewährleistet, dass nach Muskel Verdauung, Fasern aus der EDL mit minimalen oder keinen Schaden wodurch ihre Leistung in folgenden Schritten freigegeben.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagent / Material </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0130-1g </td><td> Bereiten Sie frisches alle Zeiten für optimale Ergebnisse. Weitere Aliquots unverwässert Kollagenase können bei -20 ° C gelagert werden </td></tr><tr><td> DMEM high glucose + NaPyr </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td> Zugabe von Pen / Strep ist notwendig, um Luftverunreinigungen zu minimieren </td></tr><tr><td> Gekennzeichnet Fetal Bovine Serum </td><td> Hyclone </td><td> SH30396.03 </td><td> Lot # KUJ35152 </td></tr><tr><td> Horse Serum </td><td> Hyclone </td><td> SH300.74.03 </td><td> Lot # AVJ82494 </td></tr><tr><td> Huhn Embryo Extract </td><td> Accurate Chemical </td><td> CE-650-T, Batch B7035010 </td><td> Vermeiden Gefrier-/Tauzyklen. </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td></td><td> Shop Aliquots bei -20 ° C. Vermeiden Gefrier-/Tauzyklen. Bewahren verdünnten Aliquots bei 4 ° C. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Cohann-Vannas Frühling Scissor 6mm Blades-Straight-Sharp </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15000-02 </td><td></td></tr><tr><td> Extra Thin Irisschere-10.5cm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Moria-Irispinzette Curved </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11373-12 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteurpipetten </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td><td> 14672-200 </td></tr><tr><td> Diamant Pen </td><td> VWR </td><td> 52865-005 </td><td></td></tr><tr><td> 60 * 15mm Petrischale </td><td> VWR </td><td> 25384-092 </td><td></td></tr><tr><td> Acrodisc 0,22 um Filter </td&gt; <td> VWR </td><td> CA28-145-477 </td><td></td></tr><tr><td> Seziermikroskop StemiV6 </td><td> Zeiss </td><td></td><td> Eine zusätzliche Lichtquelle erforderlich sein, um eine bessere Fokussierung Sicht haben werden </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle

Muscle Regeneration im adulten wird von ansässigen Stammzellen genannt Satelliten-Zellen durchgeführt. Satelliten-Zellen zeichnen sich durch ihre Position zwischen der Basallamina und der Sarkolemm jedes myofiber definiert. Aktuelle Kenntnisse über ihr Verhalten in hohem Maße von der Nutzung der einheitlichen myofiber Trennung Protokoll. Im Jahr 1985 beschrieben Bischoff ein Protokoll, um einzelne lebende Fasern vom Flexor digitorum brevis (FDB) von erwachsenen Ratten mit dem Ziel, ein in vitro-System, in dem die physikalische Verbindung zwischen dem myofiber und dessen Stammzellen 1 erhalten bleibt erstellen isolieren. In 1995, die Bischoff Protokoll, so dass Muskelfasern werden einzeln aufgenommen und separat nach Kollagenaseverdau anstatt von Schwerkraftsedimentation 2, 3 getrennt gehandhabt Rosenblattmodified. Das Rosenblatt oder Bischoff-Protokoll ist seitdem auf verschiedene Muskeln, des Alters oder Bedingungen 3-6 angepasst. Die einzigen myofiber Trennung Technik ist ein unverzichtbaresTool aufgrund seiner einzigartigen Vorteile. Zuerst wird in dem einzigen myofiber Protokoll sind Satellitenzellen unterhalb der Basalmembran beibehalten. Dies ist ein einzigartiges Merkmal des Protokolls als andere Techniken wie Fluorescence Activated Cell Sorting chemische und mechanische Gewebedissoziation 7 erfordern. Obwohl die myofiber Kultur kann nicht für in vivo Studien zu ersetzen, bietet es eine hervorragende Plattform, um relevante biologische Eigenschaften von Muskel-Stammzellen befassen. Einzel Muskelfasern kann in Standard Plattierungsbedingungen oder schwimmende Bedingungen kultiviert werden. Satelliten-Zellen auf schwimmenden Muskelfasern sind kaum ein anderer Einfluss als die myofiber Umgebung ausgesetzt. Substrat Steifigkeit und Überzüge erwiesen sich Satelliten Zellen die Fähigkeit zur Muskeln 8, 9 regenerieren so zu beeinflussen, in der Lage zu jeder dieser Faktoren steuern unabhängig ermöglicht Diskriminierung zwischen nischenartigen abhängige und unabhängige Reaktionen. Verschiedene Konzentrationen von Serum habenAuch wurde gezeigt, dass eine Wirkung auf den Übergang von der Aktivierung quiescence haben. Um die Ruhe Zustand des zugehörigen Satelliten-Zellen zu erhalten, sollten Fasern in niedrigen Serum-Medium 1-3 gehalten werden. Dies ist besonders nützlich, wenn das Studium Gene in der Ruhephase involviert Zustand. Im Serum Vollmedium, Satelliten-Zellen schnell zu aktivieren, vermehren, zu migrieren und zu differenzieren, so imitiert die in vivo regenerativen Prozess 1-3. Das System kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Assays, wie die Prüfung chemischer Inhibitoren durchzuführen; ektopische Expression von Genen, die durch Viren Lieferung; Oligonukleotid basierte Gen-Knock-Down-oder Live-Bildgebung. Dieses Video Artikel beschreibt das Protokoll derzeit in unserem Labor verwendet, um einzelne Muskelfasern vom extensor digitorum longus (EDL) Muskeln von erwachsenen Mäusen (6-8 Wochen alt) zu isolieren.

Hier beschreiben wir die Isolierung einzelner Muskelfasern aus dem EDL Muskel erwachsenen Mäusen. Erfolgreiche Muskelfasern ergeben von mehreren Faktoren ab, wie z. B. Kollagenase Aktivität oder Muskelerkrankungen oder Alter abhängen. Am wichtigsten ist, zeigt die Isolierung der Muskel aus Sehne-Sehne führt zu langen, intakten Muskelfasern von EDL Muskel. Abbildung 1 eine schrittweise graphische Darstellung der &quot;Sehne-Sehne&quot; Isolation. Sobald der Muskel vollständig verdaut ist, werden Muskelfasern durch leichten Druck auf den Muskel freigesetzt. 2A zeigt ein repräsentatives Bild eines myofiber Isolationsexperiment nach der ersten Wäsche. Zu diesem Zeitpunkt die Kultur ein Gemisch aus Bündeln von einzelnen Muskelfasern, die so lang und glänzend erscheinen röhrenförmigen Strukturen enthält, kontrahiert hyper Muskelfasern, die dunkel und kurze und Fremdkörper aus der Verdauung sind. Am Ende von mindestens drei aufeinanderfolgenden Wäschen sollte nur einzelne Muskelfasern in der Live-di bleibensh für Kultur oder nachgeschaltete Analyse (Abbildung 2B). 2C zeigt eine lange, live Faser zu einer hyper vertraglich Faser (C &#39;) verglichen. Zum Zeitpunkt der Trennung, erscheinen Satellitenzellen als winzige Erhebungen auf der Oberfläche myofiber (Abbildung 3A). Wenn im Serum reichen Medium gehalten, aktivieren Satelliten-Zellen vermehren sich, wandern und schließlich in Myotuben (B) zu verschmelzen. Nach 15 Tagen in Kultur exprimieren alle Myotuben die Myf5 Reporter YFP (C) darauf hindeutet, dass die Regeneration der Muskulatur in der Erwachsenen durch Zellen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt während ihrer Entwicklung die myogene bestimmender Faktor Myf5 geäußert hatte ausgeführt wird. Alle Satelliten-Zellen exprimieren den paired box Transkriptionsfaktor Pax7 17. Der Reporter Mauslinie Pax7Cre-TdTomato können verwendet werden, um Satelliten-Zellen über die Expression des TdTomato Fluoreszenzsignal (Figuren 3D und E) zu verfolgen. Abbildung 4 zeigt eine repräsentative immunofluorescence der doppelten Pax7 + / MyoD Satelliten-Zellen. Klassisch Doppelzimmer Pax7 + / MyoD + Satelliten-Zellen sind proliferative engagierte Muskeln Vorfahren, die entweder komplett die Differenzierung Programm nach unten regulieren Pax7 unter Beibehaltung MyoD Ausdruck oder Rückkehr zur Ruhe, indem sich die Regulierung MyoD und Aufrechterhaltung Pax7 Ausdruck 18 werden berücksichtigt <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. EDL Muskel isoliert von der Maus Hinterlauf. A. Hinterlauf eines 8 Wochen alten adulten Maus. Pfeile zeigt das distale (Knie) Sehnen und das proximale (Fuß) Sehne. B. Anatomische Position des Tibialis Anterior (TA) Muskel und dem M. extensor digitorum longus (EDL) Muskel. C. Durch das Halten der EDL durch die proximale Sehne, wird der Muskel in Richtung Knie gezogen, um die distale Sehne freizulegen. D. Der distale Sehnegeschnitten und die EDL freigesetzt wird. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus einem einzigen myofiber Trennung Experiment. A. Hellfeld Bild von einem myofiber Trennung Experiment am ersten Waschschritt. Rote Pfeil zeigt Live-Muskelfasern, zeigt weißen Pfeil hyper kontrahierten Muskelfasern und gelbe Pfeil zeigt Zellen, myofiber oder ECM Schutt. B. Nach aufeinanderfolgenden Waschungen in DMEM, bleiben nur Live-Muskelfasern. C und C &#39;. Bild stellt eine lange intakten lebenden myofiber (C) und eine kurze hyper kontrahiert myofiber (C &#39;). Bar 10 um. Bilder wurden mit einem Zeiss Axio Observer Z1 Mikroskop mit AxioCam HR ausgestattet genommen. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Figur<html> e 3. Repräsentative Ergebnisse aus einem einzigen myofiber Kultur Experiment. A. Hellfeld-Bild eines einzelnen, Live myofiber mit seinem zugehörigen Satellitenzelle (Pfeil) direkt nach der Isolierung (Zeit 0). B. Einzel Muskelfasern wurden auf Matrigel ausplattiert und im Serum Vollmedium für 15 Tage. Weißer Pfeil zeigt differenziert Myotuben zu einzelnen Zellen (gelber Pfeil) C verglichen. Einzel Muskelfasern aus einer Myf5Cre; RosaYFP Maus wurden wie in B kultiviert. Der Pfeil zeigt Myf5 abgeleiteten Myotuben. D und E. Einzel Muskelfasern vom Pax7Cre; TdTomato wurden isoliert und direkt nach behoben. Die Pfeile zeigen Pax7 positive Ruhestrom Satelliten Zelle (E, rot). Zellkerne wurden mit DAPI (D) gegengefärbt. Bar: 50 um. Bilder wurden mit einem Zeiss Axio Observer Z1 Mikroskop mit AxioCam HR ausgestattet genommen. Wegen &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Beispiel für Immunfluoreszenzfärbung von Satelliten-Zellen auf Muskelfasern. Einzelzimmer Muskelfasern wurden isoliert und kultiviert für 72 Stunden in schwimmenden Bedingungen. Satellite Zellen Muskelfasern wurden für die Satelliten-Zell-spezifischer Marker Pax7 (B, rot) und des myogenen regulatorischen Faktor MyoD (C, grün) gefärbt. Zellkerne wurden mit DAPI (A) gegengefärbt. Bars: 50 um. Bilder wurden mit einem Zeiss Axio Observer Z1 Mikroskop mit AxioCam HR ausgestattet genommen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Muscle Dissection (5 min jeder Muskel) </td><td><ul><li> Sehne Sehne Trennung </li><li> Scharfe Werkzeuge </li><li> Minimal Muskelschäden </li></ul></td></tr><tr><td> Muscle Verdauung (30-45 min) </td><td><ul><li> Temperaturempfindlich </li><li> Vermeiden overdigestion </li></ul></td></tr><tr><td> Fiber Trennung </td><td><ul><li> Vermeiden Manipulation von Fasern </li><li> Beseitigen Sie Schmutz mit mehreren Wäschen </li></ul></td></tr><tr><td> Fiber Kultur (bis zu 3-4 Wochen) </td><td><ul><li> Format: beliebig </li><li> Beschichtung: Pferdeserum, Matrigel </li><li> Medium: basale oder hohe Serum </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Übersicht der myofiber Trennung Protokoll. Myofiber Trennung Protokoll besteht aus 4 großen Schritten. Für jede Stufe werden die ungefähre Zeit und große kritische Punkte diskutiert. Für detaillierte Diskussion der einzelnen Schritte, um das Protokoll Text beziehen.

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Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolierung und Kultivierung von Muskelfasern ist der Goldstandard<em&gt; In vitro</em&gt; System, um den Übergang von Satellitenzellen über quiescence, Aktivierung und Differenzierung zu studieren. Wichtig ist, bewahrt die einzelnen myofiber Kultursystem die myofiber / Stammzell-Vereinigung, die ein wesentlicher Bestandteil des Muskels Stammzellnische ist.

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

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Research

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Biology

62.1K Aufrufe.  Ottawa Hospital Research Institute. Isolierung und Kultivierung von Muskelfasern ist der Goldstandard In vitro System, um den Übergang von Satellitenzellen über quiescence, Aktivierung und Differenzierung zu studieren. Wichtig ist, bewahrt die einzelnen myofiber Kultursystem die myofiber / Stammzell-Vereinigung, die ein wesentlicher Bestandteil des Muskels Stammzellnische ist.

Serie: Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Forschung

Biologie

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Isolierung, Kultur und Transplantation von Muskel-Satelliten-Zellen

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Elektroporation, Isolierung und Imaging von Muskelfasern

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Skelettmuskelfibroblasten

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...