Wir danken Olivier Vallon für den Antiserum gegen CF1β. Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft und Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (Systems Biology Initiative FORSYS, Projekt GoFORSYS) unterstützt.

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	<li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+a+macromolecular+complex:+the+toolkit+of+methods.">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li><li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction:+mass+spectrometry-based+approaches.">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Eine Vernetzung Schritt zur Erfassung transienter Protein-Protein-Interaktionen (QUICK-X), und eine Steuereinheit Niederschläge für ungleiche Niederschläge Wirkungsgrade 6 normalisieren: Wir haben vor kurzem zwei Verbesserungen an der QUICK Ansatz eingeführt. Hier haben wir ein Protokoll, das zwei weitere Verbesserungen der QUICK präsentieren: Zunächst ersetzen wir SILAC 5 für 15 N metabolische Markierung. Die Vorteile sind, dass 15 N metabolische Markierung viel billiger als SILAC ist, wenn 15 N als einfache anorganische Salz versehen ist. Weiterhin mit 15 N metabolische Markierung QUICK können Organismen prototrophen für alle Aminosäuren angewendet werden, wie die meisten Pflanzen, Pilzen und Bakterien. Und schließlich ist Arginin-zu-Prolin Interkonversion inhärent SILAC 5,6 kein Problem für die Quantifizierung von 15 N markierten Peptiden. Beispiele für geeignete Instrumente für die quantitative Auswertung von 15 N Proteomik-Daten sind MSQUANT 12 oder IOMIQS 13. Zweitens stellen wir Affinität Modulation als Mittel zur gezielten Verringerung der Menge an Proteinen Interagieren mit einer gegebenen Zielproteins in einer Probe gegenüber einem anderen. Die Vorteile dieser Vorgehensweise sind, dass sie den Bau von Knockdown-Mutanten, die für einige Modellsysteme sind schwer zu erzeugen oder gar nicht bei wesentlichen Zielproteine ​​erzeugt werden umgeht. Ferner vermeidet sie Fehlinterpretationen durch differentielle Proteinexpression eventuell auftretende als Antwort der Zelle auf Klopfen Niederhalter ein Zielprotein verursacht: wenn andere Proteine ​​herabreguliert sind so gut und mit dem Antiserum für die Immunpräzipitation eingesetzt kreuzreagieren, würden sie interpretiert werden als wahr Interaktionspartner des Zielproteins. Endlich hebt Affinität Modulation die Notwendigkeit der Suche nach einem geeigneten Antikörper-to-Antigen-Verhältnis. Obwohl wir unser Protokoll Chlamydomonas reinhardtii als Modellorganismus, Kann es leicht zu einem anderen Organismus, in Zellkultur gezüchtet werden können und in der Lage ist Ammonium oder Nitrat als Stickstoffquelle zu verwenden angepasst werden. Affinität Modulation von Proteinkomplexen durch ATP / ADP kann direkt an andere Chaperone, deren Wechselwirkung mit Substraten und Kohorte Proteine ​​hängt vom ATP Zustand aufgetragen werden, wie die GroEL/HSP60/Cpn60 oder HSP90 Chaperonsysteme 14,15, oder zu einem anderen System, bei dem Bindungsaffinitäten sind moduliert durch ATP. Affinität Modulation sollte auch für Fälle, in denen Affinitäten zwischen Protein-Wechselwirkungen durch spezifische Medikamente, wie Radicicol oder Geldanamycin im Fall von HSP90-Systeme 15 verändert werden arbeiten. Eine klare Beschränkung unserer Protokoll ist, dass es erfordert affinitätsgereinigten Antikörper gegen ein Zielprotein bekanntlich empfindlich auf eine spezifische Behandlung / Medikament, seine Affinität für Partner Proteine ​​moduliert. Daher ist es nicht Hochdurchsatzverfahren.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> ProteinA Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (Dimethyl pimelimidate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8388 </td><td> Bewahren Sie trocken bei -20 ° C, direkt auflösen, bevor verwenden </td></tr><tr><td> Protease-Inhibitor (komplett, EDTA-free) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (Adenosin-5&#39;-triphosphat) </td><td> Carl Roth </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> Kreatinphosphat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> Kreatinphosphokinase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP Dithiobis [Succinimidylpropionat] </td><td> Thermo Sientific </td><td> 22585 </td><td> Bewahren Sie trocken bei 4 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH 4 Cl </td><td> Cambridge Isotopen Laboratorien, Andover, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (Endoproteinase Lys-C) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin Perlen (Poroszyme immobilisiertem Trypsin) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> Gründlich mischen unmittelbar vor Gebrauch </td></tr><tr><td> Empore C 18 47 mm Scheibe </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind für viele biologische Prozesse in der Zelle von grundlegender Bedeutung. Deshalb spielt deren Charakterisierung eine wichtige Rolle in der gegenwärtigen Forschung und eine Vielzahl von Methoden für ihre Untersuchung steht ein. Protein-Protein Wechselwirkungen sind oft sehr dynamisch und kann auf der subzellulären Lokalisation, posttranslationale Modifizierungen und dem lokalen Proteinumgebung 2 abhängen. Daher sollten sie in ihrer natürlichen Umgebung untersucht werden, für die Co-Immunopräzipitation Ansätze die Methode der Wahl 3 sind. Co-gefällte Interaktionspartner werden entweder durch Immunoblotting in einem zielgerichteten Ansatz oder durch Massenspektrometrie (LC-MS/MS) in einer ungezielte Weise identifiziert. Die letztgenannte Strategie wird oft negativ von einer großen Zahl von falsch positiven Entdeckungen, vor allem aus der hohen Empfindlichkeit der modernen Massenspektrometern, die selbstbewusst erkennt Spuren von unspezifisch Ausfällen von Proteinen abgeleitet betroffen. A recent Ansatz zur Überwindung dieses Problems liegt der Gedanke zugrunde, dass verringerte Mengen an spezifischen Bindungspartner wird Copräzipitat mit einer gegebenen Zielprotein deren zelluläre Konzentration wird durch RNAi reduziert, während die Mengen an unspezifisch Ausfällen von Proteinen sein sollte unberührt. Dieser Ansatz, genannt QUICK zur quantitativen Immunpräzipitation mit Knockdown 4 Kombinierte beschäftigt Stable Isotope Labeling von Aminosäuren in Zellkultur (SILAC) 5 und MS, um die Mengen von Proteinen aus Wildtyp-und knock-down Stämme immunpräzipitiert quantifizieren. Proteinen in einem Verhältnis von 1:1 zu finden ist als Verunreinigungen, die in Ausscheidungen vom Wildtyp als spezifische Bindungspartner des Zielproteins angereichert betrachtet werden. Obwohl innovative trägt QUICK einige Einschränkungen: Erstens ist SILAC kostenintensiv und beschränkt auf Organismen, die im Idealfall auxotroph für Arginin und / oder Lysin. Außerdem, wenn schwere Arginin eingespeist wird, Arginin-zu-Prolin Umwandlung führt additional Masse verschiebt für jeden Prolin in einem Peptid und leicht verdünnt schwere mit Licht Arginin, die Quantifizierung mühsamer und weniger genau 5,6 macht. Zweitens erfordert QUICK dass Antikörper titriert sind, dass sie nicht in die Sättigung mit Zielprotein in Extrakten aus knock-down-Mutanten. Hier stellen wir ein modifiziertes Quick-Protokoll, das die obengenannten Einschränkungen von SCHNELL durch Ersetzen SILAC für 15 N metabolische Markierung und durch Ersetzen RNAi-vermittelte knock-down für Affinität Modulation von Protein-Protein-Wechselwirkungen überwindet. Wir demonstrieren die Anwendbarkeit dieses Protokolls unter Verwendung der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii als Modellorganismus und der Chloroplasten HSP70B Chaperon als Zielprotein 7 (Abbildung 1). HSP70s sind dafür bekannt, mit speziellen Co-Chaperone und Substrate nur in der ADP Zustand 8 interagieren. Wir nutzen diese Eigenschaft als ein Mittel, um den spezifischen überprüfenZusammenspiel von HSP70B mit seinen nucleotide exchange factor CGE1 9.

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A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Wir präsentieren eine Variation der QUICK (quantitativen Immunpräzipitation mit Knockdown kombiniert) Ansatz, der zuvor wurde eingeführt, um zwischen wahr und falsch Protein-Protein-Wechselwirkungen zu unterscheiden. Unser Ansatz basiert auf<sup&gt; 15N</sup&gt; Metabolische Markierung, die Modulation der Affinitäten von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch die Anwesenheit / Abwesenheit von ATP, Immunpräzipitation und quantitative Massenspektrometrie.

Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

a-protocol-for-identification-protein-protein-interactions-based-on

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

20.3K Aufrufe.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. Wir präsentieren eine Variation der QUICK (quantitativen Immunpräzipitation mit Knockdown kombiniert) Ansatz, der zuvor wurde eingeführt, um zwischen wahr und falsch Protein-Protein-Wechselwirkungen zu unterscheiden. Unser Ansatz basiert auf 15N Metabolische Markierung, die Modulation der Affinitäten von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch die Anwesenheit / Abwesenheit von ATP, Immunpräzipitation und quantitative Massenspektrometrie.

Serie: A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation