Wir beschreiben hier zum ersten Mal eine Methode, die ein hochdurchsatzreiches Arzneimittelscreening auf senotherapeutische Verbindungen ermöglicht, die sich bei alterungsbedingten Erkrankungen als vorteilhaft erwiesen haben. Tatsächlich sind derzeit mehrere klinische Studien mit Medikamenten, die in dieser Essenz getestet wurden, im Gange. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, zwischen zwei Arten von senotherapeutischen Medikamenten, Senolytika und Senomorphika, zu unterscheiden, indem der etablierte Nachweis von SA-beta-Galactosidase in seneszierenden Zellen verwendet wird.
Diese Technik ist ein wichtiges Screening-Tool für neuartige senotherapeutische Verbindungen. In der Tat, mehrere Verbindungen, die mit Hilfe dieses Bildschirms identifiziert wurden, sind in verschiedenen hochkarätigen Publikationen vorgestellt, und sind derzeit in klinischen Studien. Diese Technik ist extrem vielseitig und kann an mehrere Bildschirme mit hohem Durchsatz angepasst werden.
In der Tat, Es ist möglich, Multiplex-Bildschirme, und Bildschirm für Verbindungen, die Seneszenz über die Aktivierung oder Hemmung eines von mehreren Wegen unterdrücken. Schneiden Sie jeden Embryo in einen Millimeter Stücke und Pfeifen Sie es auf und ab mehrmals. Als nächstes fügen Sie 10 Milliliter Wachstumsmedium zu den Geweben jedes Embryos hinzu.
Sie in einem 10-Zentimeter-Kulturgericht verzieren und bei 37 Grad Celsius in 3% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid für zwei bis drei Tage brüten. Und den Rest jedes Embryos mit 0,25%Trypsin-EDTA-Mischung für 10 Minuten inkubieren. Um Zellen zu versuchen, entfernen Sie zuerst vorsichtig das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 Millilitern 1X PBS.
Fügen Sie dann zwei Milliliter einer 025 Trypsin EDTA-Lösung zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für zwei bis drei Minuten. Überprüfen Sie anschließend die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen von der Oberfläche getrennt sind. Fügen Sie die gleiche Menge an Wachstumsmedium hinzu, um die Trypsin-Verdauung zu beenden, und übertragen Sie die Zellen in eine konische Röhre.
Zentrifugieren Sie dann die Zellen bei 200 mal G für drei Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, und fügen Sie frisches Wachstumsmedium hinzu, um die Zellen wieder auszusetzen. Als Nächstes zählen Sie die Zellen und säen sie in neuen Platten bei der projizierten Zelldichte aus.
Bei nicht-senesenter Subkultivierung zunächst die konfluenten Zellen im Verhältnis eins zu vier. Dann brüten Zellen bei 37 Grad Celsius in 3%Sauerstoff und 5% Kohlendioxid für einen anderen Durchgang zu verlängern. Um die Zellseneszenz zu induzieren, spaltet der Samen die konfluenten Zellen von Durchgang eins im Verhältnis eins zu vier und inkubiert sie drei Tage lang bei 37 Grad Celsius in 20% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid- und 5%Kohlendioxid-Umgebung.
Um die zelluläre Seneszenz mit einem fortschrittlichen Coulter Cell Counter-System zu überwachen, messen Sie die allmähliche Zunahme des Zelldurchmessers und des Zellvolumens während jedes Trypsinisierungsschritts. Um mit dem Beta-Gal-Screening-Assay zu beginnen, samen 5 000 seneszente Zellen oder 3.000 nicht-seneszierende Zellen pro Brunnen in 96 Brunnenplatten. Dann fügen Sie 100 Mikroliter Wachstumsmedium zu jedem Brunnen und inkubieren Zellen bei 37 Grad Celsius und 20% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid für sechs Stunden.
Als nächstes fügen Sie den MEF-Zellen Arzneimittelverdünnungen hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 20 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid für 24 bis 48 Stunden. Nach der Inkubation entfernen Sie die Arzneimittellösung und waschen Sie Zellen mit 100 Mikroliter1X PBS. Um eine lysosomale Alkalinisierung zu induzieren, behandeln Sie Zellen mit 90 Mikroliter bafilomycin A1-Lösung, verdünnt in frischzelligen Kulturmedium in einer Endkonzentration von 100 Nanomolar.
Dann inkubieren Zellen bei 37 Grad Celsius in 20% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid-Umgebung für eine Stunde. Für die Fluoreszenzanalyse der SA-beta-Gal-Aktivität, machen Sie eine frische Arbeitslösung von C12FDG in Wachstumsmedium verdünnt, bei einer Endkonzentration von 100 Mikromolar. Dann fügen Sie 10 Mikroliter der Arbeitslösung in das Kulturmedium bei einer Endkonzentration von 10 Mikromolaren hinzu und inkubieren Sie Zellen bei 37 Grad Celsius in 20% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid für zwei Stunden.
Waschen Sie Zellen mit 100 Mikroliter 1X PBS. Als nächstes fügen Sie zwei Mikroliter eines 100 Mikrogramm pro Milliliter Hoechst 33342 Farbstoffs bei einer Endkonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, 20% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid für 20 Minuten.
Nach der Inkubation entfernen Sie die Medien, fügen Sie 100 Mikroliter frisches Wachstumsmedium hinzu und gehen Sie zur Bildgebung über. In dieser Studie ermöglichte eine hochgehaltige fluoreszierende Bildaufnahme- und Analyseplattform die Identifizierung von senolytischen Medikamenten, wie z. B. 17-DMAG, die die gesamten SA-Beta-Gal-Aktivitäten in murinen embryonalen Fibroblastenzellkulturen reduzierten, die seneszierende Zellen in Durchgang fünf enthielten. Die softwaregenerierten quantitativen Analysen von Mischungen von seneszenten und nicht-seneszenten Zellen ermöglichen eine klare Demonstration seneszenenter zellspezifischer Effekte und die Eliminierung der Beta-Galactosidase-Aktivität im Hintergrund durch Bafilomycin A. Stellen Sie sicher, dass alle notwendigen Zellsteuerungen enthalten sind, insbesondere unbehandelte seneszente Zellen und seneszente Zellen, die mit einer positiven Kontrolle behandelt werden.
Dieser Aufsatz beinhaltet die Arbeit mit Primärzellen unter oxidativem Stress, was zu Variationen führen kann, die überwacht werden müssen. Dieses Verfahren ist der erste Schritt beim Nachweis von senotherapeutischen Medikamenten. Zur Bestätigung der Screening-Ergebnisse müssen zusätzliche Zelllebensfähigkeit und zellseneszierende Essays durchgeführt werden.
Mehrere neue senolytische Medikamente wurden mit diesem Aufsatz nachgewiesen, einschließlich der ersten senolytischen Arzneimittelkombination Dasatinib Quercetin, Hitzeschockprotein 90-Inhibitoren, Bcl-2-Familieninhibitoren und dem Polyphenol-Fisetin.
