Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem kanadischen Stiftung für Innovation, Genome Canada, Ontario Genomics Institute, Ontario Ministerium für Innovation, und der kanadischen Institutes of Health Research Stipendium JG und AE The Red-exprimierenden E. unterstützt coli-Stamm DY330 war eine Art Geschenk von Donald L. Court (National Cancer Institute, Frederick, MD).

Ein. Bau von Gen-spezifische SPA-Tagging in E. coli DY330 Stamm <ol><li> Das Plasmid pJL148 umfassend den SPA-tag-DNA-Sequenz und die Kanamycin Antibiotikaresistenzmarker Kassette (Kan R) als Matrize in der Polymerasekettenreaktion (PCR)-Amplifikation 7 verwendet. A 45 nt genspezifischen Vorwärtsprimer, unmittelbar stromaufwärts des Zielgens Stoppcodon im Leserahmen mit einem 27 bp (5&#39;-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 &#39;) tag spezifischen Vorwärtsprimer befindet, und eine 45 nt genspezifischen Rückwärtsprimer, der unmittelbar stromabwärts des Zielgens Stoppcodon im Leserahmen mit einem 27 bp (5&#39;-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 &#39;) tag spezifischen Rückwärtsprimer, werden verwendet, um den SPA-tag und Kan ® Kassette aus dem pJL148 mit nachfolgenden PCR amplifizieren Zyklusbedingungen: 94 ° C für 5 min, 30 Zyklen von 94 ° C für 1 min, 55 ° C für 1 min, 68 ° C für 2 Min. 10 Sek., um 68 ° C für 10 min folgte. Diese verstärkten Sequenzen dienen as Substrate für die ektopisch eingeführt λ-Rot-Rekombination homologer Maschinen (siehe unten). </li><li> Das PCR-Produkt wird unter Verwendung einer QIAquick-PCR, um Salze, die mit der Elektroporation stören können, zu entfernen. Das gereinigte PCR-Produkt wird anschließend zur gezielten am 3&#39;-Ende (unmittelbar stromaufwärts des nativen Stopcodon) eines spezifischen Gens in DY330 Stamm, in dem der λ-Rot-Rekombination Maschinen 10 exprimiert wird integrieren. </li><li> Die DY330 λ-Red exprimierenden Stamm wird über Nacht in 2 ml Luria-Bertani (LB)-Medium bei 32 ° C gewachsen durch Schütteln bei 180 UpM. 1 ml der Übernacht-Kultur wird anschliessend in 70 ml frischem LB-Medium in 500 ml Erlenmeyerkolben inokuliert. Das Inokulum wird bei 32 ° C durch Schütteln bei 180 rpm, bis die OD 600 erreicht ~ 0,8 gewachsen. </li><li> Die Kultur wird in einem frischen 250 ml Erlenmeyerkolben, wo die Zellen durch Inkubation der Kolben im Wasserbad auf 42 ° C durch vorsichtiges Schütteln bei induziert übertragen180 rpm für 15 min. Unmittelbar nach der Induktion wird die Flasche in einem Eiswasser-Bad Aufschlämmung für mindestens 30 min unter Schütteln inkubiert. </li><li> Das eiskalte Kultur wird sofort in vorgekühlte 50 ml Polypropylen-Röhrchen transferiert und einer Zentrifugation bei 3993 × g für 6 Minuten bei 4 ° C. Das Zellpellet wird in 50 ml eiskaltem sterilen Wasser resuspendiert und erneut zentrifugiert bei 3993 xg für 6 Minuten bei 4 ° C. Das Zellpellet anschließend in 1 ml kaltem Wasser resuspendiert und in einem 1,5 ml Röhrchen Effendorf und zentrifugiert bei maximaler Geschwindigkeit für 20 sec bei 4 ° C. Nach zwei oder drei Waschschritten mit eiskaltem Wasser, wird das Zellpellet schließlich in 700 ul eiskaltem, sterilen Wasser resuspendiert, was in elektro-kompetenten Zellen. </li><li> Durch Elektroporation wird ein ul des gereinigten Amplikon in 40 ul der elektro-kompetenten Zellen eingeführt. 2,5 kV, 25 uF mit Puls: Die Zellen werden in einem Bio-Rad GenePulser II mit folgenden Einstellungen elektroporiertSteuerung von 200 Ω. Nach homologer Rekombination und Integration werden die Transformanten, die erfolgreich rekombiniert das Tag / Kassette in das Chromosom basierend auf Resistenz gegen Kan (Abbildung 1A) ausgewählt ist. Mehrere Transformanten werden für Western Blotting, um die korrekte Erzeugung (dh positive Signal) von SPA-markierte Fusionsproteine ​​mit anti-FLAG M2-Antikörper, die selektiv gegen die FLAG-Epitope des SPA-tag ist verifizieren ausgewählt. </li><li> Bestätigt carboxyterminalen SPA-tag-Fusion-Stamm in großem Maßstab zu löslichem Protein-Komplexen aus geernteten Zellen unter Verwendung des SPA Aufreinigungsprotokolls isolieren kultiviert. Der übersicht der Schritte in dem Reinigungsverfahren Affinitätsmarkierung involviert ist in 1B gezeigt. </li></ol> 2. Kultivierung und Beschallung <ol><li> Beimpfen 100 ul einer SPA-markierten E. coli Glycerin Lager in 50 ml Terrific Broth (TB) Flüssigmedium mit 50 ul von 25 ug / ml o ergänztf Kan Lösung in einem 250 ml Erlenmeyerkolben. Die Kultur über Nacht bei 32 ° C. Anmerkung: Da die Temperatur-induzierbare λ Red Kassette in Stamm DY330 steht unter der Kontrolle eines temperatursensitiven Repressors 10 wird die SPA-markierten E.coli-Stamm bei 32 ° C gezüchtet </li><li> Übertragen 10 ml der Übernacht-Kultur in 990 ml frischem TB mit 25 ug / ml Kan in einem 4-Liter-Kolben ergänzt. Die Kultur wird bei 32 ° C unter konstantem Schütteln bei 250 Upm für 5 bis 6 Stunden gezüchtet, bis die OD 600 erreicht auf ~ 2 bis 3 ist. </li><li> Übertragen Sie die 1 Liter E. coli SPA-tag Kultur einer Zentrifugierung Flaschen zu reinigen und Spin der Zellen bei 4 ° C im Beckman Zentrifuge J6-HC @ 3993 × g für 15 min. </li><li> Der Überstand wird von den Flaschen entfernt Zentrifugation. Resuspendieren E. coli-Zellpellets mit 25 ml Beschallungspuffer. Stellen Sie sicher, um die Zentrifugation Flaschen auf Eis zu allen Zeiten zu halten. </li><li> Die resuspendierten Pelletübertragen zu 50 ml Falcon-Röhrchen aus Polypropylen und mit flüssigem Stickstoff eingefroren. Die eingefrorenen Zellen werden bei -80 ° C für die langfristige Verwendung gelagert. </li><li> Vor Beschallung, tauen die gefrorenen Zellen vollständig, indem die Pellets auf Eis. Die aufgetauten Proben werden in ein steriles Edelstahlbecher auf Eis platziert Ultraschallbehandlung übertragen. Die Sonde wird in die Probe eingetaucht und für 3 min mit Ultraschall behandelt. Eine zusätzliche 2 Minuten läßt man die Probe vor Überhitzung zu kühlen. </li><li> Das beschallte Zellysat wird in die vorgekühlte sterile Zentrifugenröhrchen gegeben und einer Zentrifugation bei 4 ° C im Beckman Zentrifuge mit einem Rotor JA-17 @ 35.267 xg (16.000 UpM) 15 min zweimal. Hinweis: Im Falle der Membran Proteinreinigung, die beschallte Zelllysat nur einmal für 15 min zentrifugiert, weil man nicht weiß, in welcher Fraktion sich die Membranproteine ​​sind, das heißt, entweder im Pellet oder in der Überstandsfraktion. Um zu vermeiden, überschießende Verlust des memMembran-Proteine, drehen wir die Zellen für 15 min bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert und der Überstand wird anschließend zur Reinigung weiterverarbeitet (siehe nachstehend beschrieben), wenn 1% Detergens verwendet wird, um die Membranproteine ​​zu solubilisieren. </li><li> Der Überstand der Zentrifugation wird vorsichtig Röhre zu einem 50 ml Polypropylen-Falcon-Röhrchen überführt und mit flüssigem Stickstoff eingefroren. Die beschallte gefrorenen Zellextrakt wird höchstens für einen Zeitraum von 6 Monaten bei -80 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert werden. </li></ol> 3. Affinitätsreinigung <ol><li> Vor der Verwendung werden 100 ul Anti-Flag-M2-Kügelchen von 10 Volumen AFC-Puffer (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% Detergenz und 0,1-0,5 mM TCEP [Tris (2-carboxyethyl) phosphin gewaschen - Salzsäure]) ohne Reinigungsmittel und das Reduktionsmittel TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphin). </li><li> Der gefrorene, beschallte Zellextrakt wird, indem das Röhrchen in kaltem Wasser aufgetaut. Die aufgetauten Zellen Extrakt wird mit 3 ul von Benzo inkubiertnase Nuklease 30 Minuten bei 4 ° C. Zu dieser Mischung hinzuzufügen nichtionischen Detergens Triton X-100 (Endkonzentration des Detergens 0,1% betragen sollte) und 200 ul Suspensionen von Anti-Flag-M2-Agarose-Kügelchen. Anmerkung: Für alle löslichen Proteins Reinigungen, 0,1% Triton X-100 wird verwendet, um nicht-spezifische Adsorption, zu minimieren, wo als zur Reinigung eines Membranproteins, verschiedenen milden nicht-ionischen Detergenzien, wie etwa C12E8 (Octaethylenglykol dodecylether), DDM ( n-Dodecyl β-D-maltosid) und Maltose-Neopentylglykol (MNG) können bei einer 1% Detergens Konzentration eingesetzt werden, um die Solubilisierung zu verbessern. Da verschiedene Wasch variierenden haben Solubilisierung Effizienz der Membranproteine, ist es empfehlenswert, unabhängige Reinigungen Protein mit mehr als einem Detergens durchzuführen. </li><li> Der Inhalt wird sanft durch Drehen des Rohres während 3 Stunden bei 4 ° C unter Verwendung eines LabQuake Schüttler gemischt. Nach 3 Stunden der Drehung ist das Rohr bei 1.700 xg für 6 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird dann rsorgfältig emoved so viel wie möglich, ohne die lose Perlen Pellet. </li><li> Das Pellet wird in dem verbleibenden Überstand resuspendiert und anschließend in einem 0,8 x 4 cm Bio-Rad Polypropylen prep Spalte. Sicherzustellen, um den Bodenauslaß Stopfen aus der Säule zu entfernen, damit sich die Eluate durch Schwerkraft abfließen. Die Säule wird 5 mal mit TEV-Spaltung Schritt. </li><li> Nach dem Ablassen der gewaschenen Eluate wird der untere Auslass der Säule geschlossen. Um die gleiche Spalte wird die Spaltung durch Zugabe ~ 5 bis 10 ul (50 Einheiten) von TEV-Protease und 400 ul 1X AFC-Puffer auf die Säule durchgeführt. Sicherzustellen, um den Kopf der Kolonne mit einer Kappe zu schließen. Die Spalte mit den Perlen vorsichtig gedreht Nacht bei 4 ° C über Nacht mit einem LabQuake Shaker. </li><li> Entfernen der Kappe auf der Oberseite und dem Auslass Stopfen am unteren Ende der Säule, und die Eluate nach dem Drain-TEV-Spaltung in eine frische Säule mit 200 ul Suspensionen von Calmodulin-Sepharose-Kügelchen, die um 10 gewaschen wird zurückgewonnenVolumina von Calmodulin Bindungspuffer. </li><li> Sowohl die Ober-und die Unterseite der Säule dicht befestigt, und der Inhalt in der Kolonne werden sanft durch Drehen für 3 Stunden bei 4 ° C unter Verwendung eines LabQuake Schüttler gemischt. </li><li> Nach 3 Stunden der Drehung wird das Eluat durch Entfernen der oberen Kappe und der unteren Stopfen der Säule abgelassen. Die Spalte wird viermal mit 200 ul 1X Calmodulin Bindungspuffer durch ein stringentes Waschen mit 400 ul Calmodulin Waschpuffer gewaschen. </li><li> Das gebundene Protein wird in vier Fraktionen von 50 ul in ein frisches Eppendorf-Röhrchen mit 1X Calmodulin Elutionspuffer eluiert. Die eluierte Fraktion wird in zwei saubere Eppendorf-Röhrchen in gleichen Volumina verteilt. Sowohl die Rohre anschließend getrocknet unter Verwendung einer Geschwindigkeit Vakuum. </li><li> Das getrocknete Eluat von einem Rohr für den Betrieb eines Silberfärbung Gel verwendet, während die andere in -80 ° C gelagert wird, vor der Verwendung der Massenspektrometrie. </li></ol> 4. Silberfärbung <ol><li> Für Silber staining, wird die Hälfte des Volumens von 3X SDS (Natriumdodecylsulfat) Probenpuffer auf 50 ul des getrockneten Eluat gegeben. Nach Kochen der Mischung für 5 min werden die Proben auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel geladen. </li><li> Nachdem das Gel ausgeführt wurde, wird es vorsichtig in Fixierlösung gelegt (50% Methanol und 10% Essigsäure) und vorsichtig auf einem Schüttler für 20 min gerührt. Das Gel wird dann in 20% Ethanol für 10 min gespült. </li><li> Die feste Gel wird zweimal gründlich mit 500 ml doppelt destilliertem Wasser für 10 Minuten gewaschen, um niedrige einheitlichen Hintergrund zu gewährleisten. </li><li> Das Gel wird dann vorsichtig in 500 ml Natrium-Thiosulfat für 1 min, gefolgt von zwei Waschschritten mit destilliertem Wasser für 20 Sekunden gefolgt gerührt. </li><li> Das Wasser wird verworfen, und das Gel wird in 200 ml 0,1% Silbernitratlösung für 30 min inkubiert. Nach dieser Zeit wird die Silbernitratlösung entfernt und das Gel mit destilliertem Wasser für 20 sec. gewaschen, um den Überschuss an Silbernitrat entfernen. </li><li> Das Gel wird schließlich in 75 ml Hand geschütteltder Entwicklungslösung. Wenn die gewünschte Intensität erreicht ist, wird die Entwicklungslösung verworfen und 80 ml Essigsäure wird zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Sicherzustellen, um das Gel in Essigsäure für mindestens 20 min für die richtige Darstellung der Gelbanden inkubieren. </li></ol> 5. Proteolyse und Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie <ol><li> Um der getrockneten Probe werden 50 ul der Verdauung Puffer und 0,9 ul 100 mM TCEP-HCl (Tris (2-Carboxyethyl) phosphin - Salzsäure) und inkubieren Sie die Mischung für 45 min bei Raumtemperatur für den Reduktionsschritt. Anschließend wird 1 ul 500 mM Iodacetamid zugegeben und in dunklen weitere 40 min zur Probe Alkylierung ermöglichen. </li><li> Nach der zweiten Runde der Inkubation geben 1 ug immobilisiertem Trypsin zu dem Gemisch und inkubieren entweder bei 37 ° C für 5 Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, um die Reaktion durch Zugabe von 1 ul Essigsäure stoppen. </li><li> Vornässen Millipore Zip-Tip Pipettenspitze durch Absaugen 10 ul der Benetzung und Äquilibrierungslösung. Verzichten die Lösung zu verschwenden. Anschließend absaugen 10 ul der Waschlösung und verzichten die Lösung zu verschwenden. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. </li><li> Für eine effiziente Bindung des Peptids Mischung bis zur Spitze, mischen Pipette die Peptidmischung 20 mal. Das Peptidgemisch, dass zur Spitze geklebt wird durch Ansaugen und Abgeben der Waschlösung gewaschen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal für eine effiziente Bindung des Peptid-Gemisch an der Spitze. </li><li> Mit der Spitze mit dem gebundenen Peptid absaugen 10 ul der Benetzung und Äquilibrierungslösung und verzichten in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Nach dem Trocknen der eluierten Proben in der Geschwindigkeit Vakuum kann die Proben sofort durch Massenspektrometrie analysiert oder bei -80 ° C vor der Verwendung. </li></ol> 6. Protein Identifizierung durch LTQ Orbitrap Velos Massenspektrometer The Polypeptid Komponenten der isolierten Komplexe werden anhand eines LTQ Orbitrap Velos Hybrid-Tandem-Massenspektrometer. Die Orbitrap hat außergewöhnliche Auflösungsvermögen (&gt; 60.000 Full Width Half Maximum oder FWHM) und Masse Genauigkeit (&lt;2 ppm), die MS / MS Probenahme von irrelevanten unspezifischen Hintergrund Verunreinigungen unter Kontrolle Reinigungen erkannt minimiert, während die High-Speed-Velos Ionenfalle Komponente erkennt und Fragment niedriger Häufigkeit Peptide unter Verwendung sowohl Elektronentransfer-Dissoziation und Kollisions-induzierte Dissoziation Modi. Hohes Vertrauen Spiele unter resultierenden MS / MS-Spektren mit Referenz E. kartiert coli Protein-Sequenzen mit Datenbank-Suchalgorithmus wie SEQUEST und jeder passenden Sequenz während einer Wahrscheinlichkeit Algorithmus wie STATQUEST 11 ausgewertet. Die gesamte Spektren Zahl Peptidsequenz Einzigartigkeit und gemeinsamen Hintergrund Kontaminanten in negative Kontrolle (dh. Mock) Reinigungen erkannt werden als eine geringe empirische falsch-dis zu erreichenErholung bewerten. Die folgenden Schritte sind für die Protein-Identifizierung durchgeführt: <ol><li> Die Mikro-Säulen sind mit ~ 10 cm von 3 um Luna-C 18-Harz gepackt sind und eine Schnittstelle mit einem Proxeon Nanoelektrospray Ionenquelle, die in Übereinstimmung mit dem Instrument Orbitrap platziert wird. </li><li> Eine nano Proxeon Strömung binäre HPLC-Pumpe wird verwendet, um eine stabile Spitze Flussrate von ~ 300 nl min -1 während der Peptidtrennungen liefern. </li><li> Um Peptid-Elution zu erreichen, wird eine organische Puffergradienten bis nach dem Muster der Komplexität gesetzt. Zum Beispiel wird die folgende Gradienten in der Regel bis zum E. eingestellt coli SPA Proben: Lösungsmittel B wird von 2% bis 6% in 1 min erhöht, um 24% in 38 min, bis 100% in den nächsten 4 min, bei 100% für 1 min gehalten, dann sank auf 2% in 1 min, und abschließende Halten bei 2% für 15 min. Die mobile Phase Lösungsmittel A hat 95% HPLC Gradient Wasser und 5% ACN mit 0,1% Ameisensäure, während Lösungsmittel B hat 5% HPLC Gradient Wasser und 95% ACN mit 0,1% Ameisensäure acid. Die Strömungsgeschwindigkeit an der Spitze der Nadel auf 300 nl min -1 für 60 min eingestellt. </li><li> Da die Massenspektrometer Zyklen durch einen vollen Scan Masse bei 60.000 Auflösungen ausführen, werden 10 gleichzeitige Tandem-Massenspektrum Abtastungen für die intensivsten Prekursorionen gesammelt. Dynamische Ausgrenzung, monoisotopische Masse Auswahl und Echtzeit-Daten-abhängigen Akquise-Instrument sind aktiviert. </li><li> Die Spektren werden mit Hilfe einer Datenbank gesucht Suchalgorithmus wie SEQUEST gegen eine Datenbank von E. coli-Protein-Sequenzen, und das Ergebnis wird statistisch filtriert unter Verwendung eines Wahrscheinlichkeitsmodells Algorithmus wie STAQUEST 11, um eine niedrige False Fündigkeitsquote gewährleisten. Nur hohes Vertrauen (99% Wahrscheinlichkeit) Kandidaten ausgewählt, während Spiele zeigen mehr als 10 ppm Masse Fehler im Vergleich zu den theoretischen peptide mass von der weiteren Betrachtung ausgeschlossen. </li></ol>

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	<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli.">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li><li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins.">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li><li>Mak, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentiviral+functional+proteomics+approach+identifies+chromatin+remodeling+complexes+important+for+the+induction+of+pluripotency.">A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency.</a> Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).</li><li>Polanowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+immunoaffinity+purification+of+protein+complexes+from+Caenorhabditis+elegans.">Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans.</a> Biotechniques. 36, 778-782 (2004).</li><li>Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+complexes+in+Drosophila+with+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry.">Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).</li><li>Zeghouf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Peptide+Affinity+(SPA)+system+for+the+identification+of+mammalian+and+bacterial+protein+complexes.">Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes.</a> J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li><li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli.">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).</li><li>Kislinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRISM,+a+generic+large+scale+proteomic+investigation+strategy+for+mammals.">PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals.</a> Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).</li><li>Vlasblom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GenePro:+a+Cytoscape+plug-in+for+advanced+visualization+and+analysis+of+interaction+networks.">GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks.</a> Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).</li><li>de Berardinis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1.">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).</li><li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+peptide+affinity+purification+system+for+the+systematic+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+Escherichia+coli.">Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli.</a> Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Ein wichtiger Aspekt des SPA-basierte APMS hier beschriebene Ansatz ist, dass Tagging innerhalb der natürlichen chromosomalen Kontext durchgeführt wird, wodurch eine normale Genregulation wird beibehalten (dh Muttersprache. Köder Promoter erhalten, damit Expression nicht gestört wird) und native stabil-assoziierten Protein-Komplexe werden bei nahezu endogenen zurückgewonnen. Operon Polarität Probleme werden ebenfalls durch Einschließen eines nach außen gerichteten Promotor in der Selektionsmarker vermie...

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td>Vendor</td>
			<td>and Catalog Numbers</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>I. Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#KAN201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#AMP201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>2. Terrific-Broth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Tryptone</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#TRP 402</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#YEX 555</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#GLY 002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#PPM 302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#PPM 303</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>3. Bacterial Strain and Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DY330</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Yu et al. (2000)10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJL148</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Zeghouf et al. (2004)7</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4. PCR and Electrophoresis Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PCR buffer</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTPs</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mM MgCl2</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td># AGA002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>#B7021S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td># ETB444</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#28355</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#TRS001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#BOR001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># E6768</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>#N3232L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>5. Plasmid isolation and Clean-up Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Midi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#12143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#28104</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>6. PCR and Transformation Equipments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>iCycler</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>GenePulser II</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 cm electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>42 &deg;C water bath shaker</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Innova 3100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter TJ-25 centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TS-5.1-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 &deg;C Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 &deg;C large Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 &deg;C plate incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>7. Electrophoresis and Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#161-0125</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td># AMP001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># B7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#TEM001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>#09-806A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean 3 cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#165-3301</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot gel transfer device</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#IB1001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#162-0115</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F3165</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>#NA931V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-stained protein molecular weight standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#161-0363</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence reagent</td>
			<td>PIERCE</td>
			<td>#1856136</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>Clonex Corp</td>
			<td>#CLEC810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Draw blotting paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7796</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2 platform rocking shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>8. Sonication Equipment and Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson Ultrasonic</td>
			<td>#23395</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#SOD001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#800-363-5887</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mM TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#20490</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>9. Affinity Purification Reagents and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#732-6008</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>#70746</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FLAG M2 agarose beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#A2220</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin-sepharose beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#17-0529-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV protease</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#12575-015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T9284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C2661</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E3889</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabQuake Shaker</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>#59558</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>10. Silver Staining Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#MET302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>t#ACE222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-thiosulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S-7143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>#S181-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#FOR201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#SOC512</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>11. Reagents and Equipment for Protein Identification </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td># V5280</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM NH4HCO3</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#AMC555</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM CaCl2</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#CCL302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#A998-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F0507</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#95304</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#16125</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Zip-Tip</td>
			<td>Millipore</td>
			<td># ZTC18M960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>~10 cm of 3 &mu;m Luna-C18 resin</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proxeon nano HPLC pump</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>12. Labware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 liter conical flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#89000-372</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml polypropylene falcon tubes</td>
			<td>Any Vendor</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Any Vendor</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml conical flaks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#29140-045</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml sterile culture tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#366052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#479-3221</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &deg;C freezer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#13-990-14</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed vacuum system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>
			Buffers and Solutions
			1. 1 liter Terrific Broth (TB) media
			11 g Bio-Tryptone 
			22 g Yeast Extract 
			2% Glycerol 
			50 ml potassium salt stock solution
			2. Potassium Salt Stock Solution
			1.5 M K2HPO4 
			0.35 M KH2PO4
			3. Sonication Buffer
			20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			0.2 mM EDTA 
			10% Glycerol 
			Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP
			4. AFC buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			0.1% detergent 
			Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP
			5. TEV cleavage buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			0.2 mM EDTA 
			0.1% detergent 
			Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP
			6. Calmodulin binding buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			2 mM CaCl2 
			0.1% detergent 
			Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP
			7. Calmodulin wash buffer
			30 mM Tris-HCl pH 7.9 
			150 mM NaCl 
			2 mM CaCl2 
			0.1-0.5 mM TCEP
			8. Calmodulin elution buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			100 mM NaCl 
			10 mM EGTA 
			0.1-0.5 mM TCEP
			9. Developing solution (1L)
			37% Formaldehyde 
			30 g sodium carbonate 
			1000 ml distilled water
			10. Digestion buffer
			50 mM NH4HCO3 
			1 mM CaCl2
			11. Wetting and Equilibration solution
			70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid
			12. Washing solution
			100% H2O in 0.1% formic acid</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of protein complexes in escherichia coli using sequential peptide affinity purification in combination with tandem mass spectrometry

Da die meisten zellulären Prozesse werden von makromolekularen Anordnungen, die systematische Identifikation von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) und die Identifizierung der Untereinheitzusammensetzung von Multi-Protein-Komplexen Einblick in Genfunktion Verfügung stellen können und besseren Verständnis der biologischen Systeme 1, 2 vermittelt wird. Physikalische Wechselwirkungen können mit hoher Konfidenz vialarge angelegte Isolierung und Charakterisierung von endogenen Proteinkomplexe unter nahezu physiologischen Bedingungen auf Affinitätsreinigung chromosomal-markierte Proteine ​​in Kombination mit Massenspektrometrie (APMS) basierend abgebildet werden. Dieser Ansatz ist erfolgreich in evolutionär diversen Organismen, einschließlich Hefe, Fliegen, Würmern, Säugetierzellen, Bakterien und 1-6 aufgebracht. Insbesondere haben wir eine Carboxy-terminale Peptid Sequentielle Affinity (SPA) dualen Markierungssystem für Affinitäts-Reinigungskatalysator native Protein-Komplexen aus kultivierten gramnegativen Escherichia coli erzeugt wird, unter Verwendung genetically Spann Gastlabor Stämme, die für genomweite Untersuchungen der grundlegenden Biologie und konservierte Prozesse der Prokaryoten 1, 2, 7 gut geeignet. Unsere SPA-Kennzeichnungssystem ist analog zu dem Tandem Affinitätsreinigung Methode ursprünglich für Hefe 8, 9 entwickelt, und besteht aus einem Calmodulin-Bindungspeptid (CBP) durch die Spaltstelle für die hochspezifische Tobacco Etch Virus (TEV)-Protease gefolgt und drei Kopien des FLAG-Epitop (3X FLAG), so dass für zwei aufeinanderfolgende Runden von Affinitätsanreicherung. Nach Kassette Amplifikation werden sequenzspezifische lineare PCR-Produkte Codieren des SPA-tag und einen selektierbaren Marker integriert und ausgedrückt in Rahmen als carboxyterminale Fusionen in einem Hintergrund, der DY330 veranlaßt transient exprimieren ein hocheffizientes heterologe Bakteriophagen Lambda Rekombinationssystem 10 ist. Nachfolgende Dual-Schritt-Reinigung mit Calmodulin und anti-FLAG Affinitätsbeads ermöglicht die hochselektiveund effizienten Beitreibung sogar geringer Menge Protein-Komplexe von großen Kulturen. Tandem-Massenspektrometrie wird dann verwendet, um die stabil co-reinigenden Proteine ​​mit hoher Empfindlichkeit (niedrige Nachweisgrenzen Nanogramm) zu identifizieren. Hier beschreiben wir detaillierte Schritt-für-Schritt-Verfahren, die wir üblicherweise für die systematische Protein-Tagging, Reinigung und Massenspektrometrie-basierte Analyse von löslichem Protein-Komplexen aus E. verwenden coli, die bis skaliert werden und kann potenziell auf andere Bakterienarten, einschließlich bestimmter opportunistischer Krankheitserreger, die zugänglich Recombineering zugeschnitten sind. Die resultierenden physikalischen Wechselwirkungen zeigen oft interessante unerwartete Komponenten und Verbindungen hindeutet neuartige mechanistische Links. Integration der PPI-Daten mit alternativen molekulare Assoziation Daten wie genetische (Gen-Gen-) Wechselwirkungen und genomische-Kontext (GC) Prognosen Aufklärung der globalen molekulare Organisation von Multi-Protein-Komplexe in bi erleichtern kanngische Wege. Die Netzwerke für E. erzeugten coli können verwendet werden, um einen Einblick in die funktionelle Architektur von orthologen Genprodukte in anderen Mikroben für die funktionelle Annotationen derzeit fehlen gewinnen.

Once tagged bait proteins, which are expressed at endogenous levels are affinity-purified from logarithmic phase cultures the samples were run on a silver-stain gel to visualize the individual polypeptide components of the isolated stable complexes. We also subjected a second portion of the affinity-purified protein samples to gel-free tandem mass spectrometry (LCMS) to identify the corresponding polypeptide sequences. The effectiveness of this APMS procedure is shown with a representative SDS-PAGE analysis of the compon...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.co

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinitätsreinigung von markierten Proteinen in Kombination mit der Massenspektrometrie (APMS) ist eine leistungsfähige Methode für die systematische Kartierung von Protein-Wechselwirkung Netzwerken und zur Untersuchung der mechanistischen Grundlagen von biologischen Prozessen. Hier beschreiben wir eine optimierte sequentielle Peptid Affinität (SPA) APMS Verfahren für das Bakterium entwickelt<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Das verwendet werden kann, zu isolieren und zu charakterisieren stabilen Multi-Protein-Komplexen zur Homogenität, auch ausgehend von einer geringen Kopienzahl pro Zelle ist.

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

identification-protein-complexes-escherichia-coli-using-sequential

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

48.2K Aufrufe.  University of Toronto. Affinitätsreinigung von markierten Proteinen in Kombination mit der Massenspektrometrie (APMS) ist eine leistungsfähige Methode für die systematische Kartierung von Protein-Wechselwirkung Netzwerken und zur Untersuchung der mechanistischen Grundlagen von biologischen Prozessen. Hier beschreiben wir eine optimierte sequentielle Peptid Affinität (SPA) APMS Verfahren für das Bakterium entwickelt Escherichia coli Das verwendet werden kann, zu isolieren und...

Serie: Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Forschung

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Analyse großer Proteinkomplexe von Structural-Massenspektrometrie

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads von Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Die vielfältigen Vorteile von Protein Co-expression in<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...