Diese Arbeit wurde von der UWS Research Grant unterstützt.

Ein. Chitosan Klebstoffzubereitung <ol><li> Die Chitosanpulver ist löslich in Essigsäure-Lösung, zur Herstellung einer Stammlösung von Essigsäure (2% v / v), 10 ml Eisessig zu 490 ml deionisiertem Wasser (DI-H 2 O). </li><li> Zur Herstellung einer Stammlösung von Bengalrosa (RB) (0,01% w / v) in Essigsäure, 5 mg wiegen RB in einer Phiole mit Alufolie eingewickelt, um zu vermeiden Photobleichen. 0,5 ml DI-H 2 O, um das Pulver dann auflösen hinzuzufügen 49,5 ml der Essigsäure Stammlösung (beschrieben in Abschnitt 1.1). </li><li> Zur Herstellung von Chitosan-Lösung (1,7% w / v), wiegen 0,85 g Chitosan Pulver (mittlere MW, 85% Acetylierungsgrad) und in den 50 ml RB Essigsäurelösung. Die Kontrolle wurde durch Lösen des Chitosan in Essigsäure-Lösung ohne RB hergestellt. </li><li> Hinzufügen eines Magnetrührers dem Chitosan Mischung zugegeben und bei Raumtemperatur. Um eine vollständige Auflösung der Komponenten zu gewährleisten, rühren das Chitosanin Essigsäure + RB für zwei Wochen und dem Chitosan in Essigsäure für 5 Tage (Kontrolle). Wenn Chitosan gelöst wird, erhöht sich der pH der Lösung von 2,6 bis ~ ~ 3,9. Beachten Sie, dass RB schlecht löslich in sauren pH-Wert ist, und es erfordert eine Erhöhung des pH der Lösung und einer ausgefahrenen Rührzeit sich aufzulösen. </li><li> Zentrifugieren der Lösungen bei 3270 × g für 1 Stunde und den Überstand unter Verwendung von zum Beispiel eine sterile 10-ml-Spritze. Achten Sie darauf, um die Verunreinigung Pellet stören. Während dieses Schrittes wird die Lösung von makroskopischen Verunreinigungen und Unlösliches gereinigt. </li><li> Spritzen Sie die (zentrifugiert) Chitosanlösung auf einer ebenen Acrylglasstreifen Platte mit einer sterilen Spritze. Die Dicke des getrockneten Films hängt von dem Verhältnis zwischen der abgegebenen Menge der Lösung und der Oberfläche, über die die Lösung verteilt. Stellen Sie sicher, dass die Lösung frei von Luftblasen ist und gleichmäßig auf der Platte verteilt. Um dünne Filme mit ~ 13 um Dicke zu erhalten, injizieren ~ 1 ml Lösung über 12 cm 2 Fläche(Maße ~ 3x4 cm, Abb. 1A). </li><li> Decken Sie die Plexiglas Platte mit einem Bildschirm, der Aluminiumfolie zum Beispiel aus, um zu verhindern Ausbleichen der Lösung. Sicherzustellen, dass genügend Luft Belüftung gewährleistet ist, um die Lösung unter dem Bildschirm trocknen. </li><li> Lassen Sie die Lösung bei Raumtemperatur (25 ° C) und Druck (1 atm), bis der resultierende Film ist unlöslich in Wasser und nicht aufquellen makroskopisch trocken. Dies wird typischerweise in 2 Wochen erreicht. </li><li> Trennen der Folien vorsichtig mit einem dünnen und flachen Spatel: diese Folien können leicht vom Perspex Bramme werden ohne sie zu beschädigen abgeschält. </li><li> Die Dicke der Filme mit einem Mikrometer. </li><li> Schneiden Sie den Kleber in rechteckigen Streifen mit einem sauberen scharfen Schere und legen Sie sie zwischen sterilen Glasplättchen ihre flache Form zu bewahren. Wickeln Sie die Folien in Aluminiumfolie für Lichtabschirmung und speichern Sie sie bei Raumtemperatur. Beschriften Sie die Klebstoffe mit oder ohne RB als &quot;stieg Kleber&quot; oder &quot;Chitosan ADHESive &quot;bezeichnet. </li><li> Die erhöhte Klebefilme können sterilisiert unter Verwendung von Ethanol (90%) oder mit Gammastrahlung (0,1 kGy / h für 24 Std.) 4,5 ist. </li></ol> 2. Adhesive optische Dämpfung <ol><li> Befestigen Sie die Rose Klebstoff in einer Quarzküvette. </li><li> Aufzeichnen ihrer abgeschwächte Spektrum im Bereich von 400 - 800 nm unter Verwendung eines Zweistrahl-Spektralphotometer 4. </li><li> Unter der Annahme der Gültigkeit der Beerschen Gesetz berechnet die mittlere freie Weglänge des Klebstoffs wie folgt: I = I 0 e-Ax wobei I 0 die Intensität einfallenden Strahls, 1 / A ist die mittlere freie Weglänge, und x ist die Filmdicke. </li><li> Wiederholen Schritte 2.1 bis 2.3 für den Klebstoff auf Chitosan als Kontrolle zu dienen. </li></ol> 3 In-Vitro-Anwendung:. Laser Tissue Bonding am Darm <ol><li> Ernte Kälberdarm unmittelbar nach Tier Euthanasie und bei -80 ° C. </li><li> Vor Gebrauch auftauen und Hydrat der tissue durch Eintauchen in DI-H 2 O für 10 min. </li><li> Halbieren des Gewebes in Abschnitte (2 x 1 cm) unter Verwendung eines # 10 Klinge unter einem Operationsmikroskop (x10). Halten Sie die Abschnitte feuchte mit DI-H 2 O. </li><li> Bringen Sie die Inzision Baumstümpfe nahe beieinander (Ende zu Ende). Wischen Sie überschüssiges Wasser von der Oberfläche mit Wattestäbchen. </li><li> Legen Sie eine Rose Klebestreifen (10 x 6 mm) über dem Einschnitt auf der Serosa Schicht mit Mikropinzetten Gewährleistung der vollen Kontakt mit dem Darm (Abbildung 2). </li><li> Die Gewebeklebung der Rose Kleber wird von einem diodengepumpten Festkörperlaser, die zu einer optischen Mehrmodenfaser (Kerndurchmesser 200 um) 4 gekoppelt wird aktiviert. </li><li> Setzen des Leistungspegels des Lasers bis 180 mW und bestrahlen den Klebstoff für ~ 6 min mit einer Strahlpunktgröße ~ 5 mm, über die Parameter in Tabelle 1 aufgelistet. Auftropfen bestrahlen der Kleber sichergestellt wird, dass jeder Punkt für ~ 5 Sekunden vor dem Bewegen des Strahls mit dem benachbarten Fleck bestrahlt. TVerfahren garantiert sein, dass der Laserstrahl die gesamte Oberfläche der Klebstoff mehrere Male scannt. </li><li> Um das Gewebe Bindungsfestigkeit beurteilen, Verriegeln einer Probe auf einem kalibrierten Einzelsäule Tensiometer (Instron, MA, USA) unter Verwendung von mechanischen Griffe. Bewegen Sie die Griffe bei 22 mm / min bis die beiden Gewebe Baumstümpfe separate 4. </li><li> Legen Sie eine Rose Kleber auf das Gewebe, wie in Schritt 3.5 beschrieben. Nicht bestrahlen die Probe und messen Sie das Gewebe Haftfestigkeit wie in Schritt 3.8 beschrieben. Dieses Beispiel dient als Kontrolle. </li></ol> 4 In Vivo Anwendung:. Nervus tibialis Anastomose <ol><li> Sedate der Wistar-Ratte mit Isofluran / O 2-Gemisch (4% während der Induktion, 2% danach) 5. Subkutan injizieren Buprenex (0,03 mg / kg), um intra-operative analgetische Wirkung bereitzustellen und zu lindern mögliche Schmerzen oder Unbehagen. </li><li> Das folgende operative Verfahren sollte unter einem Operationsmikroskop (x10) durchgeführt werden. Stellen Sie eine schräge HautSchnitt etwa 3 cm lang in der dorso-lateralen Teil des rechten Oberschenkels und setzen die tibialis mit einem Muskel-Splitting Ansatz durch die Gesäßmuskulatur 2. </li><li> Teilweise sezieren und schneiden Sie die Adventitia des Nervus tibialis mit geraden Mikro-Schere und absorbieren überschüssiges Wasser mit einer sterilen Gaze oder Wattestäbchen. </li><li> Schneiden Sie den Nervus tibialis mit Mikro-Schere. </li><li> Positionieren Sie eine sterile Chitosan Streifen (Abmessungen 5 x 4 mm) unterhalb des Nervus tibialis mit Mikro-Pinzette. </li><li> Angleichung der Nervenstümpfe end-to-end mit Mikro-Pinzette über die Rose Klebestreifen. </li><li> Der Streifen vollständig haftet an dem Nerv Ausbilden einer Manschette, die mit der Drehung des Nervs während der Laserbestrahlung des Bandes unterstützen. </li><li> Aktivieren der Rose Klebstoff mit dem Laser wie in den Schritten 3.6 beschrieben) und 3.7). </li><li> Schneiden Sie die redundante stieg Kleber aus dem Kragen des operierten Nerven. </li><li> Schließen Sie die Muskeln und die Haut mit fünf 3-0 Nähte 5. </li&gt; <li> Post-operative Beitreibungsverfahren sollten einschließlich der täglichen Inspektion für Dehiszenz oder Eiterbildung und analgetische Verwaltung gefolgt werden, falls erforderlich. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Die Folien, die erhalten sind hell stieg in Farbe, dünn und haben eine glatte Oberfläche (Abbildung 1). Sie sind auch flexibel und kann in Röhren mit geringem Durchmesser ohne daß Risse oder sonstige Beschädigungen scheinbaren (1B) gerollt werden. Die Rosette Klebstoff hat zwei Absorptionsspitzen bei 530 und 562 nm; der grüne Laser ist also stark von dem Klebstoff und dem entsprechenden Dämpfung Länge bei 532 nm absorbiert ist ~ 12 um (Abb. 3). Dagegen dämpft Chitosanfilme ohne RB schwach des Lasers (1 / A ~ 162 Mikrometer), wahrscheinlich aufgrund von Streuung. Es scheint aus den Spektren Grundstück, dass keine signifikante Aggregation von RB in den Filmen auftritt. Die Rose Klebeverbindungen festin den Darm auf Laserbestrahlung (Abbildung 2) erreicht einen typischen maximalen Last bei Ausfall von 0,9 ± 0,4 N (n = 30). Die Haftfestigkeit wurde als die maximale Last durch die Klebefläche, nämlich ± 6 15 unterteilt kPa (n = 30) geschätzt. Die nicht bestrahlten Rose Klebstoff erheblich weniger an Gewebe gebunden (2 ± 2 kPa, n = 30, ungepaarten t-Test p &lt;10 6). Das in-vivo Anastomose der tibialis wurde erfolgreich nach dem Aufbringen und Verbinden der Rose Klebstoff in Verbindung mit dem grünen Laser erreicht. Eine Woche nach der Operation war die betätigte Nerv in Kontinuität und Festigkeit der Reparatur betrug 17 ± 9 kPa (n = 10). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4158/4158fig1.jpg" /> Abbildung 1. A) Der RB-Chitosan-Lösung wird auf einer flachen Plexiglas Platte (Deckenstärke ~ 5 mm) gegossen. Graph Papier unter der Decke platziert, um die dry-Besetzung Schritt zu erleichtern. Das wasserunlösliche film wird zwei Wochen nach dem Gießen erhalten. B) Die Rose Klebstoff ist flexibel und kann in einem kleinen Zylinder gerollt werden. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4158/4158fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Rose Klebstoff wird auf Kälberdarm nach Laserbestrahlung gebunden. Gleichmäßige Bestrahlung erfolgt auf der RB Klebstoff während gewebespezifischen Bonden aufgebracht, doch ausgewählten Flecken sind in dieser Abbildung gezeigt, um die Photo-Bleichwirkung des Lasers auf dem Klebstoff zeigen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4158/4158fig3.jpg" /> Abbildung 3. Das Absorptionsspektrum (in willkürlichen Einheiten) der Rose Klebstoff zeigt zwei Peaks bei 530 und 562 nm liegt. Der grüne Laser (λ = 532 nm) ist daher stark durch den Klebstoff während der Laserbelichtung absorbiert. Das Chitosan Klebstoff ohne RB absorbiert schlecht des Laserstrahls. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> n </td><td><sTrong&gt; Area (mm 2) </td><td> Leistung (W) </td><td> Zeit (s) </td><td> Fluenz (J / cm 2) </td><td> I (W / cm 2) </td><td> Max Load / Area (kPa) </td></tr><tr><td> Adhesive + Laser </td><td> 30 </td><td> 60 ± 10 </td><td> 0,18 ± 0,03 </td><td> 365 ± 5 </td><td> ~ 110 </td><td> ~ 0,9 </td><td> 15 ± 1 </td></tr><tr><td> Klebstoff </td><td> 30 </td><td> 60 ± 10 </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 2 ± 2 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Legend. n, Probennummer; Gebiet, eine Oberfläche von der Rose Klebstoff (Mittelwert ± maximalen Fehler), Power, Laserleistung (Mittelwert ± maximalen Fehler); Zeit, Bestrahlungszeit (Mittelwert ± maximalen Fehler); Fluence, durchschnittlich Laserfluenz; I, geschätzten irradiance; Zuladung / Gebiet, maximaler Last bei Ausfall des reparierten Gewebe durch die Klebefläche unterteilt, (Mittelwert ± SE).

<ol>
	<li>O'Neill, A. C., Winograd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anastomosis+using+a+photochemical+tissue+bonding+technique.">Microvascular anastomosis using a photochemical tissue bonding technique.</a> Lasers Surg. Med. 39, 716-722 (2007).</li><li>Yao, M., Yaroslavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+is+not+associated+with+photochemical+tissue+bonding+of+skin.">Phototoxicity is not associated with photochemical tissue bonding of skin.</a> Lasers Surg. Med. 42, 123-131 (2010).</li><li>Lauto, A., Mawad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+Tissue+Bonding+with+Chitosan+Adhesive+Films.">Photochemical Tissue Bonding with Chitosan Adhesive Films.</a> Biomedical Engineering OnLine. 9, 47 (2010).</li><li>Chan, B. P., Kochevar, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+porcine+skin+graft+adherence+using+a+light-activated+process.">Enhancement of porcine skin graft adherence using a light-activated process.</a> J. Surg. Res. 108, 77-84 (2002).</li><li>Lauto, A., Faster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sutureless+nerve+repair+with+laser-activated+chitosan+adhesive:+a+pilot+in+vivo+study.">Sutureless nerve repair with laser-activated chitosan adhesive: a pilot in vivo study.</a> Photomed. Laser Surg. 26, 227-234 (2008).</li><li>Lauto, A., Hook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan+adhesive+for+laser+tissue+repair:+in+vitro+characterization.">Chitosan adhesive for laser tissue repair: in vitro characterization.</a> Lasers Surg. Med. 36, 193-201 (2005).</li><li>Au, V., Madison, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+singlet+oxygen+on+the+extracellular+matrix+protein+collagen:+oxidation+of+the+collagen+crosslink+histidinohydroxylysinonorleucine+and+histidine.">Effects of singlet oxygen on the extracellular matrix protein collagen: oxidation of the collagen crosslink histidinohydroxylysinonorleucine and histidine.</a> Arch. Biochem. Biophys. 384, 133-142 (2000).</li><li>Encinas, M. V., Rufs, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthene+dyes/amine+as+photoinitiators+of+radical+polymerization:+A+comparative+and+photochemical+study+in+aqueous+medium.">Xanthene dyes/amine as photoinitiators of radical polymerization: A comparative and photochemical study in aqueous medium.</a> Polymer. 13, 2762-2767 (2009).</li><li>Pini, R., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+the+closure+of+the+lens+capsule+by+laser+welding.">A new technique for the closure of the lens capsule by laser welding.</a> Ophtalmic Surgery Lasers &#38; Imaging. 39, 260-2626 (2008).</li><li>Wieken, K., Angioi-Duprez, K., Lim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+anastomosis+with+glue:+comparative+histologic+study+of+fibrin+and+cyanoacrylate+glue.">Nerve anastomosis with glue: comparative histologic study of fibrin and cyanoacrylate glue.</a> J. Reconstr. Microsurg. 19, 17-20 (2003).</li><li>Menovsky, T., Beek, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser,+fibrin+glue,+or+suture+repair+of+peripheral+nerves:+a+comparative+functional,+histological,+and+morphometric+study+in+the+rat+sciatic+nerve.">Laser, fibrin glue, or suture repair of peripheral nerves: a comparative functional, histological, and morphometric study in the rat sciatic nerve.</a> J. Neurosurg. 95, 694-699 (2001).</li><li>Garc&#237;a, P., Jorge, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+mechanical+behavior+of+a+cyanoacrylate+and+a+bioadhesive.">Comparative study of the mechanical behavior of a cyanoacrylate and a bioadhesive.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 15, 109-115 (2004).</li><li>Lauto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+extracellular+matrix+with+chitosan+adhesive+film+for+sutureless+tissue+fixation.">Integration of extracellular matrix with chitosan adhesive film for sutureless tissue fixation.</a> Lasers Surg. Med. 41, 366-371 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Klebstoff stieg Fertigung auf einfache chemische Gießverfahren basiert, wenn die Auflösung der RB in sauren pH erfordert verlängert Rühren der Chitosanlösung. Es ist wichtig, damit die Lösung trocknet, bis es einen wasserunlöslichen Film wird. Dies geschieht, wenn das Gewicht Wassergehalt beträgt ~ 10% im getrockneten Films 6. Unlösliche Filme sind in der Regel 2 Wochen nach Trocken-Casting bei Standardbedingungen von Temperatur und Druck (~ 25 ° C und ca. 1 atm) erhalten. Der Mechanismus von Ge...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Rose Bengal </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 632-69-9 </td><td></td></tr><tr><td> Chitosan (medium MW) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 10318AJ </td><td></td></tr><tr><td> Eisessig </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 08050051 </td><td> 2% v / v in DI-Wasser </td></tr><tr><td> Magnetrührer </td><td> Heidolph </td><td> MR Hei-Mix S </td><td></td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-12R </td><td></td></tr><tr><td> Spektrophotometer </td><td> Varian </td><td> Cary 4000 UV-Visible </td><td></td></tr><tr><td> Laser </td><td> CNI Laser </td><td> MGL-532 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrometer </td><td> Mitutoyo </td><td> Serie 227 </td><td></td></tr><tr><td> Operationsmikroskop </td><td> Zeiss </td><td> OPMI </td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication and application of rose bengal-chitosan films in laser tissue repair

Photochemischen Gewebe Bonden (PTB) eine Technik zum nahtlosen Gewebereparatur, die durch Aufbringen einer Lösung von Bengalrosa (RB) zwischen zwei Gewebekanten 1,2 erreicht wird. Diese werden dann durch einen Laser, der selektiv von der RB absorbiert bestrahlt. Die daraus resultierenden photochemische Reaktionen vermeintlich vernetzen die Kollagenfasern im Gewebe mit minimalen Wärmeerzeugung 3. In diesem Bericht hat RB in dünnen Chitosanfilme eingebaut worden, um einen Roman Gewebekleber, die Laser-aktiviert ist herzustellen. Klebschichten auf Chitosan und enthaltend ~ 0,1 Gew.% bezogen RB, hergestellt sind und mit diesen verbunden Kälberdarm und Ratte tibialis von einem Festkörperlaser (λ = 532 nm, Fluence ~ 110 J / cm 2, Spotgröße ~ 0,5 cm) . Eine einzelne Spalten Tensiometer, eine Schnittstelle mit einem Personal-Computer verwendet wird, um die Bindungsstärke zu testen. Die RB-Chitosan Klebeverbindungen fest mit dem Darm mit einer Stärke von 15 ± 6 kPa, (n = 30). Die Haftfestigkeit fällt nach 2 &amp;plusmn; 2 kPa (n = 30), wenn der Laser nicht auf den Klebstoff aufgetragen. Die Anastomose tibialis kann auch ohne die Verwendung von Nähten abgeschlossen sein. Eine neuartige Chitosan Kleber hergestellt worden ist, dass photochemisch Bindungen an Gewebe und erfordert keine Nähte.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Application of Rose Bengal-chitosan Films in Laser Tissue Repair at JoVE.com

Fabrication and Application of Rose Bengal-chitosan Films in Laser Tissue Repair

Die Fäden werden in der Regel erforderlich, um Gewebe während chirurgischer Eingriffe zu reparieren. Jedoch kann ihre Anwendung als problematisch, da sie invasiv sind und kann Gewebe beschädigen. Die Herstellung und Anwendung Methoden einer neuartigen Gewebekleber werden hier berichtet. Diese Klebefolie wird lasersensitiven aktiviert und erfordert nicht die Verwendung von Nähten.

Herstellung und Anwendung von Rose Bengal-Chitosan-Films in Laser Tissue Repair

Photochemical tissue bonding (PTB) is a sutureless technique for tissue repair, which is achieved by applying a solution of rose bengal (RB) between two ...

fabrication-application-rose-bengal-chitosan-films-laser-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.1K Aufrufe.  University of Western Sydney, NSW Australia. Die Fäden werden in der Regel erforderlich, um Gewebe während chirurgischer Eingriffe zu reparieren. Jedoch kann ihre Anwendung als problematisch, da sie invasiv sind und kann Gewebe beschädigen. Die Herstellung und Anwendung Methoden einer neuartigen Gewebekleber werden hier berichtet. Diese Klebefolie wird lasersensitiven aktiviert und erfordert nicht die Verwendung von Nähten.

Serie: Fabrication and Application of Rose Bengal-chitosan Films in Laser Tissue Repair

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

Herstellung von biologisch abgeleiteten Injizierbare Materialien für Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Forschung

Biotechnik

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

Electric Field-gesteuerte gerichtete Wanderung von neuralen Vorläuferzellen in 2D-und 3D-Umgebungen

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

Engineering Skeletal Muscle Gewebe von Murine Myoblast Progenitor Cells und Anwendung von Elektrostimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Menschliches Knorpelgewebe Herstellung unter Verwendung von dreidimensionalen Inkjet-Drucktechnologie

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Anpassung der Elektrospinnverfahren für einen Dreischicht stellen drei einzigartige Umgebungen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Atemwegswand

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Tissue engineering often includes in vitro expansion in order to create autografts for tissue regeneration. In this study a method for tissue expansion, regeneration, and reconstruction in vivo was developed in order to minimize the processing of cells and biological materials outside the body.

Zerkleinerte Gewebe in komprimierter Collagen: Ein zellhaltigen Biotransplant für einstufige rekonstruktive Reparatur

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

Bildgestützte, laserbasierte Herstellung von Mikrofluidik-Networks-Vascular abgeleitet

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By replicating the imaging environment, costly animal experiments to validate a technique may be circumvented. Predicting and optimizing the performance of in vivo and ex vivo imaging techniques requires testing on samples that are optically similar to tissues of interest. Tissue-mimicking optical phantoms provide a standard for evaluation, characterization, or calibration of an optical system. Homogenous polymer optical tissue phantoms are widely used to mimic the optical properties of a specific tissue type within a narrow spectral range. Layered tissues, such as the epidermis and dermis, can be mimicked by simply stacking these homogenous slab phantoms. However, many in vivo imaging techniques are applied to more spatially complex tissue where three dimensional structures, such as blood vessels, airways, or tissue defects, can affect the performance of the imaging system. 
This protocol describes the fabrication of a tissue-mimicking phantom that incorporates three-dimensional structural complexity using material with optical properties of tissue. Look-up tables provide India ink and titanium dioxide recipes for optical absorption and scattering targets. Methods to characterize and tune the material optical properties are described. The phantom fabrication detailed in this article has an internal branching mock airway void; however, the technique can be broadly applied to other tissue or organ structures.

Optical tissue phantoms are essential tools for calibration and characterization of optical imaging systems and validation of theoretical models. This article details a method for phantom fabrication that includes replication of tissue optical properties and three-dimensional tissue structure.

Herstellung und Charakterisierung von optischen Gewebe Phantome, die Makrostruktur enthalten

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great potential for application in the imageology of small animals. The wide-field photoacoustic imaging of small animals can provide images with high spatiotemporal resolution, deep penetration, and multiple contrasts. Also, the real-time photoacoustic imaging system is desirable to observe the hemodynamic activities of small-animal vasculature, which can be used to research the dynamic monitoring of small-animal physiological features. Here, a dual-raster-scanning photoacoustic imager is presented, featuring a switchable double-mode imaging function. The wide-field imaging is driven by a two-dimensional motorized translation stage, while the real-time imaging is realized with galvanometers. By setting different parameters and imaging modes, in vivo visualization of small-animal vascular network can be performed. The real-time imaging can be used to observe pulse change and blood flow change of drug-induced, etc. The wide-field imaging can be used to track the growth change of tumor vasculature. These are easy to be adopted in various areas of basic biomedicine research.

A dual raster-scanning photoacoustic imager was designed, which integrated wide-field imaging and real-time imaging.

Dual Raster-Scanning Photoakustischer Kleintier-Imager für Vaskuläre Visualisierung

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...