Wir erkennen aus DTRA Mittel für die Unterstützung dieses Manuskripts und aus ONR, DTRA und NSF zur partiellen Unterstützung der zugrunde liegenden Forschung.

1. Alginat Elektrodeposition <ol><li> Schließen Sie eine Stromversorgung zu den individuell gefertigte Elektroden über Patchkabel mit Krokodilklemmen. Ein mit Indium-Zinn-Oxid (ITO) abgedeckt Objektträger wird als Anode wirken (Arbeitselektrode) und Platinfolie wird als Kathode (Gegenelektrode) dienen. Positionieren der Elektroden, so dass die ITO-Oberfläche funktionalisiert werden gegen die Gegenelektrode und entweder vertikal positioniert ist, um in eine Lösung oder horizontal, so daß die Abscheidung auf die Oberfläche enthalten eingetaucht werden. </li><li> Planen ein Alginat Abscheidungslösung durch Mischen von 1% Alginat und 0,5% CaCO 3 (nach Gewicht) in destilliertem Wasser und dann die Lösung Autoklavieren. Es wird empfohlen, ständig rühren die Lösung, wenn nicht in Gebrauch ist. </li><li> Tauchen beide Elektroden in der Abscheidungslösung. Das Alginat verwendet werden kann fluoreszierend mit FluoroSpheres (Invitrogen) tragen, nach Cheng et al. 14, um zu ermöglichen Fluoresce Abbildung des resultierenden Films. </li><li> Tragen Sie eine konstante Stromdichte (3 A / m 2) für 2 Minuten; Spannung wird im Bereich von 2-3 verschieben V. </li><li> Trennen Sie die Elektrode und entfernen Sie die Nicht-Lösung hinterlegt. Vorsichtig spülen Sie den Film mit NaCl (0,145 M) für überflüssig Alginat zu entfernen. </li><li> Inkubieren Sie den Film kurz (~ 1 min) in CaCl 2 (0,1 M), um das Gel zu stärken. Spülen Sie mit NaCl (0,145 M) und Inkubation in einer gewünschten Lösung mit CaCl 2 (1 mM) ergänzt. </li><li> Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop (1B). </li></ol> 2. Mitabscheidung Kommunikation Zellpopulationen in Alginat <ol><li> Ein Signal-Sender Zellkultur (W3110 Gew. E. coli), in LB-Medium gewachsen, und ein Signal-Empfänger Zellkultur (MDAI2 + pCT6-LSRR - amp r + pET-DsRed - kan r), in LB-Medium gezüchtet + 50 pg / mL jeweils Kanamycin und Ampicillin, müssen über Nacht ein angebaut werdenRunde für Wachstum auf eine optische Dichte (bei 600 nm) von 1 geimpft. Stellen optische Dichte des Empfängers Zellkultur 0,4-0,6 mit LB vor der Verwendung. </li><li> Vorbereiten einer Abscheidung Lösung von 2% Alginat und 1% CaCO 3 und mischen sich Zellkultur in einem Verhältnis von 1:1 bis zu einer Endkonzentration von 1% Alginat, 0,5% CaCO 3, wobei die Zellen verdünnt auf eine Dichte von etwa der Hälfte das Kultivieren Dichte. </li><li> Mit einem Glas-Objektträger mit zwei ITO-Elektroden durch eine Polydimethylsiloxan (PDMS) und (hergestellt nach Anspruch Sylgard Anweisungen und auf die gewünschte Größe geschnitten) und einer Platin-Gegenelektrode enthalten strukturiert. Schließen Sie das eine ITO-Elektrode an eine Stromversorgung mit dem Platin-wie in Verfahren 1 (Alginat Elektroabscheidung) beschrieben. </li><li> Die Elektroden in einer Lösung, die die Abscheidung Empfängerzellen. Stellen Sie die Stromversorgung auf einen konstanten Strom bei einer Dichte von 3 A / m 2, wobei die Oberfläche Dimension der einzelnen Elektrode definiert ist, auf dem Deposition auftreten wird. </li><li> Anwenden des aktuellen für 2 Minuten, um Co-Abscheidung der Zellen in der Alginat-Matrix zu ermöglichen. </li><li> Spülen der Folie wie in Schritt 1.5 beschrieben. </li><li> Schalten der anodischen Verbindung mit dem zweiten, benachbarten, ITO-Elektrode. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang Deposition (Schritte von 2,4 bis 2,7), aber dieses Mal die Einführung der Lösung, welche die Absender-Zellen. </li><li> Inkubieren Sie die 2-Elektroden-Chip mit abgeschieden Zellen und Calcium-Alginat über Nacht bei 37 ° C in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit 10% LB-Medium und 1 mM CaCl 2 ergänzt. </li><li> Nach der Inkubation Bildes unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskop (2B). </li></ol> 3. Chitosan Elektrodeposition <ol><li> Schließen Sie das Netzteil an den Elektroden über Krokodilklemmen. Eine Gold-beschichteten Silizium-Chip wird als Kathode (Arbeitselektrode) zu handeln und eine Platin-Folie wird als Anode (Gegenelektrode) dienen. Positionieren der Goldelektrode die Oberfläche so thbei er sich gegen die Gegenelektrode und beide entweder vertikal in eine Lösung oder horizontal, so dass die Abscheidungslösung auf der Oberfläche enthalten ist getaucht positioniert werden. </li><li> Bereiten Sie eine Chitosan-Lösung durch Mischen von Chitosan Flocken in Wasser und langsame Zugabe von 2 M HCl zu den Polysacchariden (End-pH 5,6) lösen und sicherstellen, das Verfahren von Meyer et al. 15 zu befolgen. </li><li> Platzieren Sie die Elektroden in eine Chitosan-Lösung (0,8%), Notlaufeigenschaften den gewünschten Bereich für die Abscheidung. Das Chitosan verwendet werden können fluoreszierend markiert werden mit 5 - (und-6)-Carboxyrhodamin 6G-succinimidylester (Invitrogen), nach Wu et al 8, ein Bild des elektrisch abgeschiedenen Films durch Fluoreszenzmikroskopie.. </li><li> Anwenden einer konstanten Stromdichte (4 A / m 2) für 2 Minuten. Die Spannung wird im Bereich von 2-3 zu verschieben V. Berechnen der Stromdichte als Funktion der Goldoberfläche der Arbeitselektrode Elektrode tritt in den Deposition Lösung. </li><li> Spülen Sie die Elektrode mit VE-Wasser für überflüssig Chitosan zu entfernen. Der Chip kann in Wasser oder PBS (10 mM, pH 7,0) gespeichert werden. </li><li> Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop (3C). </li></ol> 4. Elektrochemische Transduktion mit einem funktionalisierten Chitosanfolie <ol><li> Codeposit Chitosan und Glucose-Oxidase (GOx) aus einer Lösung (1% Chitosan, 680 U / ml GOx, pH 5,6) bei einer Stromdichte von 4 A / m 2 auf einer strukturierten Elektrode nach der Prozedur 3 (Chitosan Elektrotauchlackier). Ein Film in Chitosan GOx eingeschlossen erzeugt. </li><li> Befestigen des behandelten Elektrode mit einem Drei-Elektroden-System nach der Arbeitselektrode, einen Platindraht als Gegenelektrode und eine Ag / AgCl als Referenzelektrode, wie in 4A beschrieben. </li><li> Tauchen der Elektroden in einer Phosphat-Pufferlösung (0,1 M, pH 7,0), NaCl (0,1 M). </li><li> Elektrochemisch Konjugat des Proteins an den ChitosanFilm durch Anlegen einer konstanten Spannung (0,9 V) für 60 mit Chronoamperometrie 10. </li><li> Platzieren Sie den Chip in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0) waschen und für 10 Minuten auf einem Schüttler, um nicht umgesetztes NaCl und unkonjugiertes GOx entfernen. </li><li> Der Drei-Elektroden-System wieder befestigen, wie in Schritt 4.2 und Tauchen in eine Lösung von 5 mM Glucose beschrieben. Mit Cyclovoltammetrie, fegen das Potenzial in eine positive Richtung zu 0,7 V. Verwenden Sie eine Kontrolle, die kein Film Glucose-Oxidase als Vergleich für die Höhe der Oxidation in der Sweep gesehen (Abbildung 4B). </li><li> Die Elektroden aus der Glukose-Lösung und Spülen mit Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0), dann stellen die Elektroden in einen 10-ml-Becherglas mit 8 ml Phosphat-Puffer (0,1 M, pH 7,0). Bias des GOX-funktionalisierten Chip bis 0,6 V als Arbeitselektrode (4C) dienen. </li><li> In Aliquots von Glucose zu dem Puffer (jedes Aliquot erhöht die Glucosekonzentration durch4 mM). </li><li> Generieren einer Standardkurve zwischen dem stationären Strom und der Glukose-Konzentration für die GOx-funktionalisierten Chitosanfilm. </li></ol> 5. Protein-Funktionalisierung mit Enzymatische Vollversammlung <ol><li> Verwenden Sie einen Objektträger aus Glas mit einem benachbarten Gold-und ITO-Elektrode innerhalb eines PDMS gut enthielt gemustert. Bias der Goldelektrode mit einem kathodischen Potential, Chitosan elektrochemisch wie zuvor gezeigt. Spülen Film kurz in DI-Wasser und dann mit einer Pipette PBS. </li><li> Eine Lösung von 3 &amp;mgr; M blau fluoreszierend markierten &quot;AI-2-Synthase&quot; 16 (mit einem DyLight Labeling Kit) + 100 U / ml Tyrosinase in PBS. </li><li> Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur, dann spülen Sie den Film mit PBS. </li><li> Anwenden einer anodischen Potential der ITO-Elektrode, um eine Lösung mit Alginat-Deposition-Empfänger-Zellen (wie in den Schritten von 2,1 bis 2,2) hergestellten codeposit. Folgen Sie den Schritten von 2,3 bis 2,6 der Geschäftsordnung 2 (Mitabscheidung Zellpopulationen in Alginat). </li><li> So generierendas übertragene Signal (AI-2) enzymatisch nach dem Spülen die Filme eine Lösung von 500 pM S-Adenosyl-Homocystein (SAH) in PBS mit 10% LB-Medium und 1 mM CaCl 2 ergänzt. Decken Sie die Elektroden, um die Verdampfung der Lösung zu verhindern und über Nacht bei 37 ° C Dies wird für einen Empfänger Zell-Antwort durch Erzeugen eines rot fluoreszierendes Protein (DsRed) zu ermöglichen. </li><li> Aneinander angrenzende Elektroden können mit Fluoreszenzmikroskopie durch Anpassung der Filter können Sie die blaue Fluoreszenz der AI-2-Synthase und rote Fluoreszenz von den Zellen abgeschieden Empfänger (Abbildung 5B) zum Ausdruck zu erfassen abgebildet werden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Auferlegt elektrischen Signale können lokalisierten Mikroumgebungen (z. B. Felder und Gradienten) in der Nähe einer Elektrodenoberfläche und diese Stimuli können die Selbstorganisation der Polysaccharide wie Alginat und Chitosan als Hydrogel-Film auf der Elektrode abzuscheiden auszulösen. Weil tseine Sol-Gel-Übergang an der Elektrodenoberfläche, der resultierende Film wird electroaddressed, mit entsprechenden Geometrie der Elektrodenstruktur (1B, 3C). Biokompatible Filmen wie Alginat und Chitosan bereitzustellen Oberflächen, die mit biologischen Komponenten zu funktionalisieren. Durch Verwendung von Alginat, haben einzigartige Zellpopulationen an getrennten Adressen wurden abgeschieden. Beweise für ihre electroaddressment basiert auf der Interaktion zwischen Sender und Empfänger-Zell-Population beobachtet. Das Molekül Autoinduktions-2 (AI-2) diffundiert aus den Sender-Zellen und wird von den Zellen aufgenommen Empfänger, was zur Expression des dsRed rot fluoreszierendes Protein (2A). In 2B ist rote Fluoreszenz nur auf der Elektrode, wo Empfänger gerichtet beobachtet. Die Amin-Gruppen an Chitosan das sie in die pH-Ansprechverhalten für die elektrolytische Abscheidung sowie eine geeignete Oberfläche für eine Funktionalisierung erforderlich. Wirausgenutzt Diese einzigartigen Eigenschaften von elektrochemisch Konjugation des Biosensor-Enzym Glucose-Oxidase (GOx), um galvanisch Chitosanfilme. Dieses Enzym liefert dann die Fähigkeit zum Nachweis von Glukose durch eine enzymatische Reaktion (4A) Herstellung von Wasserstoffperoxid, die dann elektrochemisch oxidiert werden kann erzeugen einen Ausgangsstrom. Auf diese Weise kann ein chemisches Signal in elektrische. 4B zeigt, dass transduziert werden Filme, in denen GOx elektrochemisch konjugierten erzeugen ein starkes Signal anodischen in Gegenwart von Glucose, um die Filme, die keine GOx gegenüberliegenden war. Diese Ergebnisse zeigen, GOx auf einen abgeschiedenen Film Chitosan zusammengesetzt werden kann und die katalytische Aktivität beibehalten. Darüber hinaus zeigt 4C ein Schritt-Anstieg im anodischen Strom in Reaktion auf zunehmenden Glucosekonzentrationen hergestellt. Die Standardkurve auch in 4C zeigt, dass die Schritt-Erhöhungen in einer nahezu linearen fas ginghion abhängig von der Menge an Glucose zugegeben. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Enzym behält auch seine Empfindlichkeit zu erhöhen Glucosekonzentrationen nach Konjugation mit dem Chitosan-Film. Die untere Nachweisgrenze wurde hier nicht, wie es zuvor für dieses System in der Arbeit von Meyer et gekennzeichnet untersucht. al. Wir haben auch die kovalente Immobilisierung eines Enzyms von Interesse, entwickelt, um eine individuelle Penta-Tyrosin-Tag, zu Chitosan in einer enzymatisch gesteuert enthalten gezeigt. Insbesondere wird dieses Verfahren durch das Enzym Tyrosinase vermittelt. Wie durch die Regelung in 5A (obere), ein Enzym dargestellt, umfasst AI-2-Synthase ein Penta-Tyrosin-Tag. Tyrosinase wirkt auf die Tyrosin-Tag, Oxidieren der Rückstände &quot;Phenolgruppen zu o-Chinonen, die dann kovalent an das Chitosan Amine binden. Der Nachweis von Chitosan Film Funktionalisierung mit dem AI-2-Synthase durch Tyrosinase Montage ist in 5B beobachtet </strong&gt;, wo die AI-2-Synthase wurde fluoreszierend markiert wurde blau. Da AI-2-Synthase erzeugt AI-2 von dem Substrat S-Adenosyl-Homocystein (SAH) in der gleichen Weise wie die Sender Zellen, die Nähe zu abgeschieden Empfänger-Zellen in Gegenwart von SAH auch bewirkt, dass die Empfänger Zellen Fluoreszenz durch Expression dsRed reagieren (5A (niedriger)). Rot-Fluoreszenz der Empfänger-Zellen (5B) zeigt erneut Wechselwirkung zwischen Adressen aufgrund der Diffusion von AI-2 von einem zum anderen und gibt des Weiteren, dass die Enzyme zu Chitosan erhalten Aktivität einmal kovalent gebunden immobilisiert. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig1.jpg" /> Abbildung 1. Alginat Elektroabscheidung. (A) Mechanismus der Elektrotauchlackier Alginat: Als anodisch vorgespannt wird, tritt Wasserelektrolyse an seiner Oberfläche, Erzeugen eines lokalisierten niedrigen pH-Wert. Calciumcarbonat-Teilchen reagieren mit dem Überschussvon Protonen, der Freisetzung von Kalzium-Kationen als die Partikel zu lösen. In Gegenwart von Alginat Polymerketten werden die Ionen in einer &quot;Eierkarton&quot; Netzwerk chelatisierte Bildung eines vernetzten Hydrogels an der Elektrode. Da die Entfernung von der Elektrode zu, weist eine größere Tendenz Alginat in der Lösung aufgrund der reduzierten Gegenwart von Calciumionen bleiben. (B) eine L-förmige gemusterten ITO-Elektrode wurde galvanischen Alginat verwendet. Ein PDMS Vertiefung wurde mit der Elektrode befestigt, um eine grüne Fluoreszenz-markierten Alginat (1%) und CaCO 3 (0,5%) Abscheidungslösung enthalten. Nach galvanischen für 2 min. bei einer Stromdichte von 3 A / m 2 wurde die electroaddressed Alginat-Hydrogel durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig2.jpg" /> Abbildung 2. Mitabscheidung Zellpopulationen. (A) Schematische Darstellung Interaktion zwischen zwei E. coli-Stämme: Eine Population produziert Autoinduktions-2 (AI-2), Ein Signalmolekül wird und als &quot;AI-2 Absender.&quot; Die andere Population, als &quot;AI-2-Empfänger,&quot; ist ein Reporter von AI-2, nach Erhalt der AI-2 durch Diffusion aus dem Absender, so drückt es der rot fluoreszierenden Proteins DsRed. (B) Red Fluoreszenzbild Elektrodenpaar mit dem AI-2 Absender Bevölkerung abgeschieden mit Alginat auf der linken Elektrode und AI-2-Empfänger Bevölkerung abgeschieden mit Alginat auf der rechten Elektrode. Vergrößerte Ansicht zeigt die DsRed-Expression von nur den AI-2-Empfängern. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig3.jpg" /> Abbildung 3. Chitosan Elektroabscheidung. (A) Schematische Darstellung des pH-abhängigen Elektrotauchlackier Chitosan. Die Elektrolyse von Wasser bei einer kathodisch vorgespannt Elektrode verursacht eine lokalisierte hohen pH-Wert (dargestellt durch eine lokalisierte Farbänderung eines pH-Indikator-Farbstoff in der Nähe der Kathode in-Aufnahme), die die Sol-Gel-Übergangstemperatur von Chitosan stimuliert in diesem Bereich. (B) Die Amine präsentieren auf Chitosan geben it pH-responsive Eigenschaften. Oberhalb eines pH-Wert von 6,3 (pKa von Chitosan) die Amine deprotoniert sind, erleichtern den Übergang von seiner protonierten löslicher Form in seine unlösliche Gel-Form. (C) eine strukturierte Goldelektrode wurde galvanischen Chitosan. Die Elektrode kathodisch mit der Stromversorgung verbunden ist, wurde in eine grüne Fluoreszenz-markierten Chitosan (0,8%) Abscheidung getaucht. Nach galvanischen für 2 min. bei einer Stromdichte von 4 A / m 2 wurde die electroaddressed Chitosanfilm durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig4.jpg" /> 4. Elektrochemische Transduktion mit einem funktionalisierten Chitosanfilm. (A) Schematische Darstellung der Aufbau einer Drei-Elektroden-System. Funktionalisierte Chitosan-Film dient als Arbeitselektrode, einen Platindraht als Gegenelektrode und eine Ag / AgCl Referenzelektrode. Elektrochemische Transduktion von Glukose verläuft über the enzymatische und elektrochemische Reaktionen gezeigt, wo hergestellt Wasserstoffperoxid oxidiert und an der Arbeitselektrode detektiert werden. (B) cyclische voltammagram (CV) an der Elektrode mit einem Chitosan-Film, die elektrochemisch konjugierten Glucoseoxidase (GOx) zeigt eine starke anodische Signal in einem 5 mM Glucose-Lösung. Ein Film, der keine GOx diente als Kontrolle und angezeigt kein Signal in der gleichen Lösung. (C) eine Standardkurve zwischen der anodischen Strom und der Glucosekonzentration zeigt eine nahezu lineare Beziehung (jeweils Aliquote erhöhte die Glucose-Konzentration von 4 mM und erhöhte auch die Stromamplitude in der eingesetzten Grafik in einer stufenweise). <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig5.jpg" /> Abbildung 5. Protein-Funktionalisierung mit enzymatischen Montage. (A, oben) Schematische Darstellung Tyrosin-Tag &quot;AI-2-Synthase&quot; kovalent an ein Chitosan-Film durch die Tyrosinase Anordnung gebunden. Die Tyrosinreste geworden oxidMeerwasser mit einem O-Chinonen durch Tyrosinase verantwortlich und gegebenenfalls mit Amin-Gruppen auf dem Chitosan-Film zu reagieren, wobei eine kovalente Bindung. (A, unten) Das AI-2-Synthase erzeugt AI-2 von einem Substrat (SAH), die Empfängerzellen berichten die erzeugte KI-2 durch Fluoreszenz dsRed Expression. (B) Fluoreszenz-Bilder, die eine Chitosan-Film auf Gold, mit blau-markierten AI-2-Synthase funktionalisiert. Nebeneinander, werden AI-2-Empfänger-Zellen mit Alginat auf ITO abgeschieden. Nach Zugabe des enzymatischen Substrats zum Brunnen und Inkubation exprimieren die AI-2-Empfänger-Zellen dsRed.

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M., Elibol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+as+an+immobilization+material+for+MAb+production+via+encapsulated+hybridoma+cells.">Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells.</a> Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).</li><li>Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gentle+cell+trapping+and+release+on+a+microfluidic+chip+by+in+situ+alginate+hydrogel+formation.">Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation.</a> Lab Chip. 5, 553-559 (2005).</li><li>Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Film+Bioprocessing+and+Immunoanalysis+with+Electroaddressable+Stimuli-Responsive+Polysaccharides.">In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides.</a> Adv. 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Produktion und freien Zugang zu diesem Artikel wird von der United States Defense Threat Reduction Agency gefördert.

Unsere Verfahren demonstrieren die galvanische Abscheidung und Funktionalisierung von Biopolymer-Filme, ein Prozess, den wir biofabrication Begriff. Durch Funktionalisierung mit Zellen und Biomolekülen schaffen wir biologischen Oberflächen, die miteinander interagieren und der Elektrode Adresse, die sie auf zusammengesetzt werden. Der erste Schritt, Elektroabscheidung, erfolgt durch die ausgelöst Selbstorganisation von Biopolymeren, Alginat und Chitosan in unseren Studien, in Reaktion auf ein elektrisches Signal. Wie bereits erwähnt ein pH-Gradient erzeugt wird, welches durch die Stromdichte und Abscheidung gesteuert werden, eine zusätzliche Kontrolle über die Folie Abmessungen und Eigenschaften 6,17. Wir haben gefunden, dass eine Vielzahl von Stromdichte und Abscheidung Zeit-Kombinationen für die Elektroden in Tabelle 1 angegeben verwendet werden. Obwohl die Verwendung von anderen Elektroden möglich ist, damit eine Angleichung des Verfahrens erforderlich sein. Im Vergleich mit anderen Techniken der Filmbildung der Prozess der electrodeposition ist einfach, schnell und ohne Reagenz. Es gibt keine Notwendigkeit für eine umfangreiche Repertoire von teurer Ausrüstung und mühsam Zubereitungen. Wichtig ist, dass der Prozess standhalten geringfügige Abweichungen experimentellen und kann einfach gestartet werden, falls ein Problem auftritt. Chitosan ist der Lage, auf einem hohen kathodischen pH-Gradienten durch wichtige funktionelle Eigenschaften verliehen, um es durch einen hohen Gehalt an primären Aminen. Bei hohen pH-Wert (größer als ihre pKa-Wert von ~ 6,3) die Amine deprotoniert und Chitosan wird unlöslich, so dass für die Filmbildung. Nach der Abscheidung wird die Filme bleiben an der Elektrode. Es besteht jedoch die Möglichkeit, sie zu delaminieren, falls gewünscht. Die Filme werden bleiben, solange der pH-Wert der Lösung nicht unterhalb des pKa-Drop stabil. Saure Lösungen protonieren die Amine und die anschließende elektrostatische Abstoßung schwellen des Gels bis 18 löst sich auf. Das heißt, ist die Montage / Demontage Prozeß reversibel on-Demand und allows zum Entfernen der abgeschiedenen Filme und Wiederverwendung von Elektroden. Zweckmäßigerweise ist der pH-Bereich mit dem das Sol-Gel-Übergang erfolgt in der Nähe, in dem die meisten biologischen Komponenten optimal funktionieren. Dies macht das Verfahren ideal für die Beibehaltung der Funktionalität bei der Montage 6. Alginat Filmbildung durch die anodische Elektrolyse von Wasser sowie die Gegenwart von Calciumcarbonat 7 erleichtert. Die lokalisierte niedrigen pH-Wert an der Anode löst das Calciumcarbonat, die zur Freilassung Calciumkationen. Diese Ionen werden von Alginat Chelat bilden ein vernetztes Netzwerk auf der Elektrodenoberfläche. Alginat Filme sind insbesondere reversibel Wettbewerb für Calciumionen aus anderen Chelatbildner wie Citrat oder EDTA, die verwendet werden, um die Filme gelöst werden kann, so dass für die Weiterverwendung der zugrunde liegenden Elektroden. So sind Alginat-Filme relativ zerbrechlich, wenn sie physiologischen Bedingungen ausgesetzt, da Calcium-Ionen sind leicht scavenged aus der Gelmatrix, schwächt seine Struktur und die Förderung der Film Delamination oder Wiederauflösung. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir einen Inkubationsschritt für den Film in 1 M CaCl 2, um das Gel zu verstärken enthalten. Darüber hinaus empfehlen wir, dass der Film Inkubationslösung (Zelle Medien, etc.) mit CaCl 2 in einer Konzentration von 500 uM-3 mM ergänzt werden. Die zweite wichtige Verfahren ist die Funktionalisierung des abgeschiedenen Films mit relevanten biologischen Komponenten. Dies kann auf zwei Arten, wobei die erste elektrochemische Konjugation, eine Strategie, die für eine schnelle, reagenzienfreien Zusammenbau von Proteinen mit außergewöhnlichen räumlichen Steuerung 10 ermöglicht erzielt werden. Jedoch ist Funktionalisierung auf diese Weise durch die Diffusion von Cl beschränkt - Ionen durch den Film an die Elektrode als auch die Diffusion von HOCl das erzeugte reaktive Zwischenprodukt, zurück in die Lösung. Die Fähigkeit des elektrochemisch aktiven Moleküle passierendurch den Film ermöglicht die Transduktion von chemischen und biologischen Signale in leicht zu lesen elektrische Signale 15. Wir haben Tyrosinase-vermittelte Kupplung als zweite Strategie für die Enzym-Funktionalisierung zu Chitosan gezeigt, nachgewiesen durch kovalente Bindung AI-2-Synthase. Diese Strategie ermöglicht die Funktionalisierung Prozess zu sein kontrollierten und selektiven - abhängig von einer spezifischen Reagenz, Tyrosinase, die discriminately wirkt auf Proteine, die eine Tyrosin-Tag 9. Wir zeigen die Nützlichkeit und die Biokompatibilität von Multi-Adresse Systeme durch die Replikation natürliche Wege auf einem Chip. Zuerst organisierten wir zwei Zellpopulationen (dh &quot;Absender&quot; und &quot;Empfänger&quot;) an unterschiedliche Adressen, und zeigten, dass sie über benachbarte Elektroden interagiert, um AI-2 liefern und erzeugen eine Fluoreszenz-Antwort. Dieses Konzept wurde auch von Cheng et al nachgewiesen. in einem mikrofluidischen Chip 14. Wir haben auch die Interaktion nachgeahmt, sondern verwendetein Enzym, um AI-2 für die Lieferung zu synthetisieren. Auf diese Weise wurde ein synthetisches intrazellulären Weg, AI-2-Synthese durch biofabrication repliziert und funktioniert gut wie wäre es in Lösung. In beiden Fällen zeigt Anordnung einer Vielzahl Adressen der Herausforderung Vermeidung nicht-spezifische Bindung zwischen den Adressen, da jede Abscheidungslösung auf die gesamte Elektrodenanordnung eingeführt werden muss, obwohl Elektrotauchlackier nur an einer Adresse bestimmt. Sanfte und doch gründliches Waschen entfernen können den Großteil der verbleibenden Lösung aus Nicht-lastigen Elektroden, die Verwendung von Strömung in mikrofluidischen Kanälen kann weiter zu minimieren Nicht-Spezifität. Insbesondere für die benachbarten biofabrication von Chitosan und Alginat-Adressen, empfehlen wir Abscheiden der Chitosan-Film zuerst im Anschluß daran mit Biofunktionalisierung Schritte, und danach, galvanisches Alginat. Obwohl wir nicht getan haben, hier haben wir festgestellt, dass die Blockierung der Chitosan-Film mit inerten Proteinen (z. B. milk, BSA, etc.) stark vermindert nicht-spezifische Bindung von unerwünschten Molekülen aminiert Oberfläche der Chitosan. Wir haben bei der Einrichtung Dienstprogramm gemusterten Elektroden, die oft in bioMEMS Geräte gefunden, als die &quot;Blaupausen&quot; für eine komplexe Anordnung von Zellen und Biomolekülen gefunden. Die Verwendung von Chitosan in galvanisch bioMEMS Geräte können weit über die hier genannten Beispiele gehen 19. Wie in Mikrokanälen und auf nicht-planaren Oberflächen 20,15 - Chitosan kann auf verschiedenen Geometrien Mikromaßstab abgeschieden werden. Die Filme können auch mit anderen Polymeren und einer Vielzahl von Proteinen, DNA, Nanopartikel und Redox-aktive Moleküle für neuartige Eigenschaften 21,22,23 modifiziert werden. In bioMEMS Geräte haben Chitosanfilme für Drug-Delivery-, Redox-und Small Molecule-Erkennung, Biokatalyse und Zell-Studien 20,23,24,25 verwendet worden. In ähnlicher Weise wird allgemein als Alginat Zell-Matrix verwendet, das Einfangen für reversible fluidischen Eindämmung erforschtZellpopulationen und in Film-Immunoanalyse 26,27,28. Verbundfolien für das Tissue Engineering-Anwendungen wurden unter Verwendung von Alginat Elektroabscheidung, mit Komponenten wie mit Hydroxyapatit für orthopädische Implantate 29. In unseren Demonstrationen der biofabrication haben wir gezeigt, sowohl die Wechselwirkungen zwischen biologischen Komponenten und über die bio-elektronische Schnittstelle zu sein, in gleicher Weise anwendbar, dies bringt in erreichen die Aussicht auf die Integration aller Arten von Interaktionen für anspruchsvolle Leistung in On-Chip-Signalübertragung. Dementsprechend kann biofabrication die Herstellung von Bauelementen mit reduzierter &quot;minimalen Strukturgrößen&quot;, wie erleichtert der direkte Nachfolger auf die rasante Entwicklung in der Mikrofertigung, wie oft von Unterhaltungselektronik motiviert. Das heißt, sie könnten neben Geräten der nächsten Generation, gehören tatsächlich labilen biologischen Komponenten, die Natur zu exquisiten Montage und Anerkennung Fähigkeiten bei noch kleineren Länge SCA bietenles als Menschen verursachten Systeme. Wir sehen in naher Zukunft Anwendungen in der instrumentellen Analytik, Umwelt-Sensoren, und sogar biokompatiblen Implantaten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name der Komponente </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Power Supply </td><td> Keithley </td><td> SourceMeter 2400 </td></tr><tr><td> Drei Elektrode Potentiostaten </td><td> CH Instruments </td><td> Potentiostat / Galvanostat 600D </td></tr><tr><td> RE-5B Ag / AgCl-Referenzelektrode mit Flexible Anschluss </td><td> BASI </td><td> MF-2052 </td></tr><tr><td> Gold-beschichteten Silizium-Wafer, 500um Si, Cr 12nm, 120nm Au, SiO 2 zur Isolierung </td><td> individuell gefertigter </td><td></td></tr><tr><td> Indium-Zinn-Oxid beschichteten Objektträger, rechteckig, 8-12 Ohm Widerstand </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 578274 </td></tr><tr><td> Platinum Blatt / Folie (0,002 in) </td><td> Surepure Chemetals </td><td> 1897 </td></tr><tr><td> Slim Line 2 &quot;Krokodilklemmen </td><td> RadioShack </td><td> 270-346 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Multi-Stacking Banana Plug Patch Cord </td><td> TSElectronic </td><td> B-36-02 B-24-02 </td></tr><tr><td> SYLGARD 184 Siliconelastomer Kit </td><td> Dow Corning </td><td> NC9020938 Von Fischer </td></tr><tr><td> Fluorescecence Stereomikroskop </td><td> Olymp </td><td> MVX10 MacroView </td></tr><tr><td> CEllSens Norm </td><td> Olymp </td><td> Version 1.3 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Elektrochemische Abscheidung und Fluoreszenz Visualisierung Ausrüstung. <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Chitosan mit mittlerem Molekulargewicht </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448877 </td></tr><tr><td> Salzsäure, ARISTAR. ACS, NF, FCC-Qualität </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td></tr><tr><td> Natriumhydroxidlösung. 10.00N </td><td>VWR </td><td> VW3247 </td></tr><tr><td> Alginsäure, Natriumsalz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 180947 </td></tr><tr><td> Multifex-MM Gefällte Calciumcarbonat, 70-nm-Partikel </td><td> Speciality Minerals Inc. </td><td> 100-3630-3 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Chitosan und Alginat-Lösung Reagenzien. <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Calciumchlorid-Dihydrat </td><td> JT Baker </td><td> 0504 </td></tr><tr><td> Natriumchlorid, Certified ACS kristallinen </td><td> Fischer Wissenschaftlich </td><td> S271 </td></tr><tr><td> Einbasischem Kaliumphosphat, wasserfrei </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> Dibasisches Kaliumphosphat, wasserfrei </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3786 </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> Sigma- Aldrich </td><td> P4417 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Andere Lösungskomponenten und Puffer-Reagenzien. <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Unternehmen / Quelle </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Glucose-Oxidase aus Aspergillus niger </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2133 </td></tr><tr><td> Tyrosinase aus Pilzen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3824 </td></tr><tr><td> LB-Brühe, Miller (granuliert) </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP9723-2 </td></tr><tr><td> &quot;AI2-Synthase&quot; (HGLPT) </td><td> Lab Lager 16 </td><td></td></tr><tr><td> W3110 Wildtyp-Zellen </td><td> Lab Lager 30 </td><td></td></tr><tr><td> MDAI2 + pCT6-LSRR - amp r + pET- <em&gt; dsRed - kan r Zellen </td><td> Lab Lager 30 </td><td></td></tr><tr><td> FluoroSpheres: 1 &amp;mgr; Durchmesser, Ex / Em: 505/515 </td><td> Invitrogen </td><td> F8765 </td></tr><tr><td> 5 - (und-6)-Carboxyrhodamin 6G-succinimidylester, Ex / Em: 525/560 </td><td> Invitrogen </td><td> C-6157 </td></tr><tr><td> DyLight Antikörpermarkierung Kit, 405 </td><td> Thermo Scientific </td><td> PI-53.020 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Enzyme, Zellen und anderen Reagenzien Funktionalisierung.

bridging the bio-electronic interface with biofabrication

Fortschritte in der Lab-on-a-Chip-Technologie versprechen, um sowohl Forschung und Medizin durch niedrigere Kosten, bessere Empfindlichkeit, Portabilität und einen höheren Durchsatz zu revolutionieren. Die Einbeziehung der biologischen Komponenten auf biologische mikro-elektromechanische Systeme (bioMEMS) hat ein großes Potenzial für die Erreichung dieser Ziele dargestellt. Mikrofabrizierte elektronische Chips ermöglichen eine Mikrometer-Skala Features sowie eine elektrische Verbindung für Sensoren und Schaltfunktionen. Funktionelle biologischen Komponenten geben dem System die Fähigkeit zum spezifischen Nachweis von Analyten, enzymatischen Funktionen und Whole-Cell-Funktionen. Standard-Mikrofabrikation Prozesse und bio-analytische Techniken haben seit Jahrzehnten erfolgreich in den Computer und biologische Industrie genutzt, beziehungsweise. Deren Kombination und Schnittstellen in einem Lab-on-a-Chip-Umgebung, jedoch bringt neue Herausforderungen. Es ist ein Aufruf für Techniken, die eine Schnittstelle zwischen der Elektrode und biologischen Kompo aufbauen könnenHNO, der mild ist und leicht herzustellen und Muster. Biofabrication, hier beschriebene, ist ein solcher Ansatz, der viel versprechend für seine einfach zu montieren Einbeziehung von biologischen Komponenten mit Vielseitigkeit in den On-Chip-Funktionen, die aktiviert sind gezeigt hat. Biofabrication nutzt biologische Materialien und biologischen Mechanismen (self-assembly, enzymatische Montage) für Bottom-up-hierarchischen Aufbau. Während unseren Labors, diese Konzepte in vielen Formaten 1,2,3 unter Beweis gestellt haben, hier zeigen wir die Montage auf Elektroabscheidung von mehreren Anwendungen des Signal-basierten Interaktionen gefolgt basiert. Die Anordnung besteht aus der elektrolytischen Abscheidung von biokompatiblen stimulierbaren Polymerfilmen auf Elektroden und ihre anschließende Funktionalisierung mit biologischen Komponenten wie DNA, Enzymen oder lebenden Zellen 4,5. Elektrochemische nutzt die pH-Gradienten an der Oberfläche eines vorgespannten Elektrode aus der Elektrolyse erzeugtWasser 6,7,. Chitosan und Alginat sind auf äußere Reize reagieren biologischen Polymeren, die in Hydrogelfilme Selbstorganisation als Reaktion auf elektrische Signale auferlegten 8 ausgelöst werden können. Die Dicke dieser Hydrogele durch den Umfang, in dem der pH-Gradient erstreckt sich von der Elektrode bestimmt. Diese lassen sich über unterschiedliche Stromdichten und Ablagerung mal 6,7 sein. Dieses Protokoll wird beschrieben, wie Chitosanfilme abgelegt werden und die kovalente Bindung biologischen Komponenten des starken primären Aminogruppen auf dem Film entweder durch enzymatische oder elektrochemische Methoden 9,10 funktionalisiert. Alginat-Filme und deren Einschluss von lebenden Zellen wird auch 11 angesprochen werden. Schließlich ist die Anwendbarkeit biofabrication anhand von Beispielen der Signal-Interaktion, einschließlich chemischer Elektrisch-, Zell-Zell-, sowie Enzym-zu-Zell-Signalübertragung gezeigt. Sowohl das galvanischeund Funktionalisierung kann unter nahezu physiologischen Bedingungen ohne Reagenzien durchgeführt werden und somit ersparen labilen biologischen Komponenten aus rauen Bedingungen. Darüber hinaus haben beide Chitosan und Alginat lange für biologisch-relevante Zwecke 12,13 benutzt worden. Insgesamt kann biofabrication, ein schnelles Verfahren, die einfach auf einem Tischgerät durchgeführt werden kann, zum Erstellen Mikrometerbereich Muster der funktionellen biologischen Komponenten auf Elektroden verwendet werden und kann für eine Vielzahl von Lab-on-a-Chip eingesetzt werden.

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Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Dieser Artikel beschreibt eine biofabrication Ansatz: Abscheidung von stimulierbaren Polysacchariden in Gegenwart des vorgespannt Elektroden, biokompatible Folien, die mit Zellen oder Proteine ​​funktionalisiert werden können, zu schaffen. Wir zeigen eine Tisch-Strategie für die Generation der Filme sowie ihre grundlegenden Verwendungen für die Erstellung interaktiver Oberflächen biofunktionalisierten für Lab-on-a-Chip-Anwendungen.

Bridging the Bio-elektronische Schnittstelle mit Biofabrication

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and ...

bridging-the-bio-electronic-interface-with-biofabrication

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.7K Aufrufe.  University of Maryland. Dieser Artikel beschreibt eine biofabrication Ansatz: Abscheidung von stimulierbaren Polysacchariden in Gegenwart des vorgespannt Elektroden, biokompatible Folien, die mit Zellen oder Proteine ​​funktionalisiert werden können, zu schaffen. Wir zeigen eine Tisch-Strategie für die Generation der Filme sowie ihre grundlegenden Verwendungen für die Erstellung interaktiver Oberflächen biofunktionalisierten für Lab-on-a-Chip-Anwendungen.

Serie: Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Forschung

Biotechnik

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Gold Nanostar Synthesis mit einem Silver Seed vermitteltes Wachstum Methode

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or erosion. Amelogenin has been proven to be a critical protein for controlling the organized growth of apatite crystals. In this paper, we present a detailed protocol for superficial enamel reconstruction by using a novel amelogenin-chitosan hydrogel. Compared to other conventional treatments, such as topical fluoride and mouthwash, this method not only has the potential to prevent the development of dental caries but also promotes significant and durable enamel restoration. The organized enamel-like microstructure regulated by amelogenin assemblies can significantly improve the mechanical properties of etched enamel, while the dense enamel-restoration interface formed by an in situ regrowth of apatite crystals can improve the effectiveness and durability of restorations. Furthermore, chitosan hydrogel is easy to use and can suppress bacterial infection, which is the major risk factor for the occurrence of dental caries. Therefore, this biocompatible and biodegradable amelogenin-chitosan hydrogel shows promise as a biomaterial for the prevention, restoration, and treatment of defective enamel.

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

In this article, we describe a protocol for fabricating an amelogenin-chitosan hydrogel for superficial enamel reconstruction. Organized in situ growth of apatite crystals in the hydrogel formed a dense enamel-restoration interface, which will improve the effectiveness and durability of restorations.

Entwicklung von Amelogenin-Chitosan-Hydrogel für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Emaille Nachwachsen mit einem dichten Schnittstelle

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

Methoden zur Selbst Integration von Megamolecular Biopolymere auf der Trocknungsluft-LC-Schnittstelle

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

Unter Verwendung der synthetischen Biologie lebenden Zellen zu entwickeln, die Schnittstelle mit programmierbarer Materialien

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Fabrication of the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) in the Adult Rat

Recent advances in neuroprosthetics have enabled those living with extremity loss to reproduce many functions native to the absent extremity, and this is often accomplished through integration with the peripheral nervous system. Unfortunately, methods currently employed are often associated with significant tissue damage which prevents prolonged use. Additionally, these devices often lack any meaningful degree of sensory feedback as their complex construction dampens any vibrations or other sensations a user may have previously depended on when using more simple prosthetics. The composite regenerative peripheral nerve interface (C-RPNI) was developed as a stable, biologic construct with the ability to amplify efferent motor nerve signals while providing simultaneous afferent sensory feedback. The C-RPNI consists of a segment of free dermal and muscle graft secured around a target mixed sensorimotor nerve, with preferential motor nerve reinnervation of the muscle graft and sensory nerve reinnervation of the dermal graft. In rats, this construct has demonstrated the generation of compound muscle action potentials (CMAPs), amplifying the target nerve&#39;s signal from the micro- to milli-volt level, with signal to noise ratios averaging approximately 30-50. Stimulation of the dermal component of the construct generates compound sensory nerve action potentials (CSNAPs) at the proximal nerve. As such, this construct has promising future utility towards the realization of the ideal, intuitive prosthetic.

Fabrication of the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface C-RPNI in the Adult Rat

The following manuscript describes a novel method for developing a biologic, closed loop neural feedback system termed the composite regenerative peripheral nerve interface (C-RPNI). This construct has the ability to integrate with peripheral nerves to amplify efferent motor signals while simultaneously providing afferent sensory feedback.

Herstellung der Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) in der Erwachsenenratte

Recent advances in neuroprosthetics have enabled those living with extremity loss to reproduce many functions native to the absent extremity, and this is ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

Blutfluss-Bildgebung mit ultraschnellem Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits versus other methods: DIBs are stable and often long-lasting, bilayer area can be reversibly tuned, leaflet asymmetry is readily controlled via droplet compositions, and tissue-like networks of bilayers can be obtained by adjoining many droplets. Forming DIBs requires spontaneous assembly of lipids into high density lipid monolayers at the surfaces of the droplets. While this occurs readily at room temperature for common synthetic lipids, a sufficient monolayer or stable bilayer fails to form at similar conditions for lipids with melting points above room temperature, including some cellular lipid extracts. This behavior has likely limited the compositions&#8212;and perhaps the biological relevance&#8212;of DIBs in model membrane studies. To address this problem, an experimental protocol is presented to carefully heat the oil reservoir hosting DIB droplets and characterize the effects of temperature on the lipid membrane. Specifically, this protocol shows how to use a thermally conductive aluminum fixture and resistive heating elements controlled by a feedback loop to prescribe elevated temperatures, which improves monolayer assembly and bilayer formation for a wider set of lipid types. Structural characteristics of the membrane, as well as the thermotropic phase transitions of the lipids comprising the bilayer, are quantified by measuring the changes in electrical capacitance of the DIB. Together, this procedure can aid in evaluating biophysical phenomena in model membranes over various temperatures, including determining an effective melting temperature (TM) for multi-component lipid mixtures. This capability will thus allow for closer replication of natural phase transitions in model membranes and encourage the formation and use of model membranes from a wider swath of membrane constituents, including those that better capture the heterogeneity of their cellular counterparts.

This protocol details the use of a feedback temperature-controlled heating system to promote lipid monolayer assembly and droplet interface bilayer formation for lipids with elevated melting temperatures, and capacitance measurements to characterize temperature-driven changes in the membrane.

Temperaturgesteuerte Montage und Charakterisierung eines Droplet Interface Bilayers

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits ...

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is accompanied by high manufacturing costs, which has brought about an interest in using alternative methods for gene delivery. Electroporation is an electro-physical, non-viral approach for the intracellular delivery of genes and other exogenous materials. Upon the application of an electric field, the cell membrane temporarily allows molecular delivery into the cell. Typically, electroporation is performed on the macroscale to process large numbers of cells. However, this approach requires extensive empirical protocol development, which is costly when working with primary and difficult-to-transfect cell types. Lengthy protocol development, coupled with the requirement of large voltages to achieve sufficient electric-field strengths to permeabilize the cells, has led to the development of micro-scale electroporation devices. These micro-electroporation devices are manufactured using common microfabrication techniques and allow for greater experimental control with the potential to maintain high throughput capabilities. This work builds off a microfluidic-electroporation technology capable of detecting the level of cell membrane permeabilization at a single-cell level under continuous flow. However, this technology was limited to 4 cells processed per second, and thus a new approach for increasing the system throughput is proposed and presented here. This new technique, denoted as cell-population-based feedback control, considers the cell permeabilization response to a variety of electroporation pulsing conditions and determines the best-suited electroporation pulse conditions for the cell type under test. A higher-throughput mode is then used, where this 'optimal' pulse is applied to the cell suspension in transit. The steps for fabricating the device, setting up and running the microfluidic experiments, and analyzing the results are presented in detail. Finally, this micro-electroporation technology is demonstrated by delivering a DNA plasmid encoding for green fluorescent protein (GFP) into HEK293 cells.

This protocol describes the microfabrication techniques required to build a lab-on-a-chip, microfluidic electroporation device. The experimental setup performs controlled, single-cell-level transfections in a continuous flow and can be extended to higher throughputs with population-based control. An analysis is provided showcasing the ability to electrically monitor the degree of cell membrane permeabilization in real-time.

Herstellung und Betrieb eines kontinuierlichen Durchfluss-Mikroelektroporationssystems mit Permeabilisierungsdetektion

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...