Wir sind dankbar, dass vier anonymen Gutachtern für die Verbesserung des Manuskripts und der National Science Foundation (Grant IOS-0546784) für Unterstützung.

Ein. Mess-Blatt Hydraulische Leitfähigkeit für Hydrated Leaves (K max) <ol><li> Sammle Triebe vorzugsweise am Abend oder in der Nacht, so dass Xylem Spannungen gering sind, schneiden in der Luft und in dunklen Plastiktüte mit nassen Papiertüchern gefüllt. Im Labor nachgeschnitten mindestens zwei Knoten von dem Ende jeder Aufnahme unter Wasser. Lassen Sie schießen rehydrieren Nacht in reinem Wasser oder einer anderen Lösung für K Blatt Messungen verwendet werden. Reinstwasser wird als Flow-Lösung empfohlen, wenn die Auswirkungen der verschiedenen Lösungen als Faktor untersucht werden sollen. </li><li> Schneiden Sie das Blatt aus dem Shooting mit einer frischen Rasierklinge unter teilweise entgaste Flow Lösung. Reinstwasser wird als Flow-Lösung empfohlen, wenn die Auswirkungen der verschiedenen Lösungen als Faktor untersucht werden sollen. Wir empfehlen Entgasen der Lösung über Nacht in einem Kolben unter Verwendung einer Vakuumpumpe, aber auch andere Verfahren können eingesetzt werden. </li><li> Wrap vorgereckt Parafilm um die petiole, um eine gute Abdichtung zwischen Blattstiel und Schläuche zu gewährleisten. Dieser Schritt ist besonders hilfreich für unrunde Blattstiele, als Umhüllung zusätzliche Parafilm helfen rund um die Blattstiel im Inneren des Schlauchs passen. Dental Paste kann der Blattstiel, bevor das Einwickeln der Parafilm Nuten in Blattstiele füllen angewendet werden. </li><li> Schließen Sie das Blatt zu Silikonschlauch unter Reinstwasser Luft zu verhindern in das System. Als das Blatt über der Quelle von Wasser angehoben wird, ist das Wasser in der Rohrleitung unter Unterdruck und damit die Dichtung ist gut, wenn keine Luft in den Schlauch während der Messung erstellt. Alternativ zur Abdichtung der Blattstiel direkt in Silikonschlauch, kann eine Klemmverschraubung mit Gummidichtung verwendet werden (zB (Omnifit A2227 Bohrung Adapter werden; Omnifit, Cambridge, UK); dieser Ansatz ist nützlich für Blattstiele mit besonders komplexen Formen oder Grashalme , die können um einen Glasstab gewickelt und versiegelt mit der Klemmverschraubung. Wenn möglich, Abdichtung der Blattstiel direkt in silicone Schläuche hat den Vorteil, dass eine schnelle und Zurücklassen eines Blattstiel-Tubing-Übergang, der transparent ist, so dass Luftblasen leichter gesehen. Der Schlauch verbindet das Blatt zu harten Rohre laufen zu einem Meßzylinder auf einer Waage (± 10 pg Auflösung), welcher Daten protokolliert alle 30 sec mit einem Computer (zB mit &quot;Balance Link&quot; Software; Mettler-Toledo GmbH, Greifensee, Schweiz) für die Berechnung der Fließgeschwindigkeit durch das Blatt. </li><li> Blätter sollten adaxial Oberfläche nach oben in Holzrahmen mit Angelschnur über einer großen Box-Fan und unter einer Lichtquelle (&gt; 1.000 mol • m 2 • s -1 photosynthetisch aktive Strahlung für High-Bestrahlungsstärke Messungen), leicht über dem Niveau des aufgereiht gehalten werden der Meniskus im Messzylinder. Das Blatt sollte über dem Wasser in dem graduierten Zylinder angeordnet werden, um sicherzustellen, daß Wasser in Bewegung zu dem Blatt durch Transpiration angetrieben wird, und nicht in das Blatt unter Druck aufgrund der Schwerkraft, ebenso wieder Fall, wenn das Blatt unterhalb des Meniskus des Wassers im Zylinder platziert wurden. Kleincontainer mit nassen Papiertuch gefüllt sind im Inneren der Ausgleichskammer angeordnet, um sicherzustellen, dass die Luft im Gleichgewicht ist wassergesättigt, wodurch Verdampfung von der Wasserquelle zu der Atmosphäre im Gleichgewicht. Diese Möglichkeit kann durch Anhalten Strömung in dem Blatt unter Verwendung eines Vier-Wege-Absperrventil in dem Rohrstrang, und Überprüfen, dass die Masse des Wassers Zylinder auf der Waage nicht ablehnen überprüft werden. </li><li> Legen Sie eine klare Pyrex Behälter mit Wasser über das Blatt gefüllt, um die Hitze der Lampe absorbieren. </li><li> Pflegen Blatt Temperatur zwischen 23 ° C und 28 ° C während des gesamten Experiments, indem mehr kaltes Wasser an die Pyrex Container, so dass die Wärmelampe heizt nicht die Pyrex Behälter ausreichend, um die Luft um das Blatt unter erwärmen. </li><li> Lassen Sie das Blatt zu schwitzen auf dem Gerät für mindestens 30 min, also lange genug Zeit, um hohe Bestrahlungsstärke akklimatisieren und additional bis Flußrate stabilisiert haben, ohne Trend nach oben oder unten, und mit einem Variationskoeffizienten &lt;5% für mindestens 5-10 Messungen bei 30 sec Intervallen fließen. Es ist wesentlich für die Fließgeschwindigkeit einen stationären Zustand zu erreichen, da diese Methode setzt eine stabile Ψ Blatt. Frühere Studien fanden diese Kriterien als ausreichend zur Stabilisierung der Strömungsrate (E), Ψ Blatt und K Blatt; Tests mit längeren Messperioden nach stabile Strömung eingerichtet zeigte keine Beziehung K Blatt zu Meßzeit für jede der sieben Arten eines breiten Bereich von Blatt Kapazität 17,18. Stabilisierung dauert in der Regel 30 Minuten oder weniger, aber bei einigen Arten kann mehr als eine Stunde für einige Arten erfordern. </li></ol> Hinweis: Bei Durchflüssen sehr niedrig (&lt;8 ug s -1) ist, der Stabilität kann anhand der laufende Durchschnitt der letzten fünf 30 Sekunden-Intervallen werden. </p&gt; <ol start="9"><li> Verwerfen Messungen, wenn der Fluss plötzlich ändert, entweder durch plötzliche Stomata oder scheinbare Leckage der Dichtung oder Verstopfungen im System durch Partikel oder Luftblasen. </li><li> Wenn die Strömung stabilisiert, notieren Blatt Temperatur mit einem Thermoelement. </li><li> Schnelles Entfernen Sie das Blatt aus dem Schlauch, trocknen dab die Blattstiel und legen Sie das Blatt in einem verschließbaren Beutel das zuvor in der ausgeatmeten, um die Transpiration zu stoppen. </li><li> Lassen Sie das Blatt in seiner Tasche Gleichgewicht für mindestens 20 min. </li><li> Den Durchschnitt der letzten 10 Durchflussmessungen. Dies wird Ihre E Messung. </li><li> Wenn das Blatt äquilibriert ist, messen die endgültige Blattwasserpotentials (Ψ final) mit einer Druckkammer. </li><li> Messen Blattfläche mit einem Flachbettscanner und Bildverarbeitungs-Software oder mit einer Blattfläche Meter. </li><li> K Blatt wird als E /-ΔΨ Blatt (wo ΔΨ Blatt = Ψ endgültigen Berechnung </sub&gt; - 0 MPa) und weitere normalisierten von Blattfläche. Die Einheiten sind in mmol m -2 s -1 MPa -1. Da das Blatt gerade über dem Niveau des Wassers in dem graduierten Zylinder positioniert wird, würde die Wirkung der Schwerkraft bei der Verringerung des Drucks von Wasser ein, das Blatt vernachlässigbar, insbesondere relativ zu der endgültigen Ψ, der immer&gt; -0,1 MPa. </li><li> Um Änderungen in K Blatt durch Temperaturabhängigkeit Wasserviskosität 15,19,20 induziert korrigieren, zu standardisieren K Blattwerte bis 25 ° C unter Verwendung der folgenden Gleichung: </li></ol><img alt="Gleichung 1" fo:content-width="3.863in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq1.jpg" /><ol start="18"><li> Stomatäre Leitfähigkeit (g n) bestimmt als E durch die Blatt-Luft-Dampf-Druckdifferenz, äquivalent zu dem Dampf pressu einteilenre Defizit (VPD), bestimmt mit einem Temperatur und relativer Feuchte-Sensor benachbart zu dem Blatt. VPD wird anhand der folgenden Gleichung 21 </li></ol><img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq2.jpg" fo:content-width="1.67in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq2highres.jpg" /> wobei RH die relative Luftfeuchtigkeit ist, VP der Sättigungsdampfdruck der Luft (in kPa, eine Funktion der Temperatur gemäß der Gleichung Arden Buck 22) und AP der atmosphärische Druck (in kPa). 2. Mess-Blatt Hydraulische Leitfähigkeit für Dehydrated Leaves <ol><li> Sammle Triebe vorzugsweise am Abend oder in der Nacht, so dass Xylem Spannungen gering sind, schneiden in der Luft und in dunklen Plastiktüten mit nassen Papiertüchern gefüllt. Im Labor nachgeschnitten mindestens zwei Knoten von dem Ende jeder Aufnahme unter Wasser. Lassen Sie schießen rehydrieren Nacht in reinem Wasser oder einer anderen Lösung für K le verwendet werdenaf Messungen. Reinstwasser wird als Flow-Lösung empfohlen, wenn die Auswirkungen der verschiedenen Lösungen als Faktor untersucht werden sollen. </li><li> Triebe in Segmente geschnitten mit mindestens drei Blättern unter Reinstwasser und dehydratisieren Triebe mit einem Gebläse für unterschiedliche Zeiträume auf einen Bereich von Ψ Blattwerte. </li><li> Sobald Triebe dehydriert sind, legen verschließbaren Beutel (Whirl-Pak; Nasco, Fort Atkinson, WI, USA), die zuvor in der ausgeatmeten) um jedes Blatt des Drehs, und legen Sie dann das ganze Shooting in einem großen Beutel mit nassem Papier Handtuch. </li><li> Lassen Sie das Shooting für mindestens 30 min (für stark dehydriert Triebe mehr Äquilibrierungszeiten kann notwendig sein) ausgleichen. </li><li> Nach der Äquilibrierung verbrauchsteuerpflichtigen die obere und untere Blatt und Maßnahme anfänglichen Ψ Flügels (= Ψ o) unter Verwendung einer Druckkammer. </li><li> Verwerfen der Aufnahmen, wenn die Differenz in der Ψ blatt dieser beiden Blätter größer als 0,1 MPa (für strongly dehydrierten Blättern, kann dieser Bereich bis 0,3 MPa verlängert werden). </li><li> Das dritte Blatt wird dann verwendet, um K Blatt und g s mit dem EFM zu bestimmen, folgende Schritte 1,2 -1,18 oben. Insbesondere kann steady state E auch für Blätter, die stark dehydriert Blätter haben, wie Spaltöffnungen noch öffnen und erzeugen g s-Werte deutlich höher als Kutikula Leitwert 17 erhalten werden. </li><li> Um hydraulische Anfälligkeit Kurven konstruieren, berechnen K Blatt unter Verwendung des endgültigen Ψ wie in Schritt 1.16, und dann K Plot Blattwerte gegen je nachdem, welcher am niedrigsten ist, Ψ o oder Ψ endgültige, dh die stärkste Dehydratisierung durch das Blatt während des Experiments erlebt (= Ψ niedrigste). Ebenso kann der Rückgang der g s in Reaktion auf Blatt Dehydratisierung durch Plotten g s gegen Ψ niedrigsten bestimmt werden. Frühere Arbeiten haben sh<html> Eigene dass Dehydration induziert zumindest teilweise irreversible Rückgänge in K Blatt und g s 14,16. </li><li> Wir empfehlen den Erhalt mindestens 6 K Blattwerte pro 0,5 MPa Intervall von Ψ niedrigsten (dieses Intervall kann bis 0,25 MPa reduziert werden, wenn die Spezies mit dem Sie arbeiten ist wirklich anfällig für Dehydration). </li><li> Führen Dixon Ausreißer-Test auf K Blatt Werte für jede 0,5 MPa Wasser potenziellen Intervall von Ψ niedrigsten Ausreißer aus Ihrem Schwachstelle Kurve 23 zu entfernen. </li><li> Weil Arten in ihren Antworten von K Blatt und g s unterscheiden, um eine Dehydratation 14,16 passen unterschiedliche Funktionen für jede Art und wählen Sie den Maximum-Likelihood (niedrigste AIC-Wert, siehe 14 für Details). Wir empfehlen passende mindestens vier Funktionen, die zuvor in der Literatur verwendet: linear (pg &quot;fo: content-width =&quot; 1.4in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/4179/4179eq3highres.jpg &quot;/&gt;), sigmoidal ( <img alt="Gleichung 4" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq4.jpg" fo:content-width="1.483in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq4highres.jpg"/> ), Logistik ( <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq5.jpg" fo:content-width="1.7in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq5highres.jpg"/> ) Und exponentielle ( <img alt="Gleichung 6" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq6.jpg" fo:content-width="1.583in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq6highres.jpg"/> ). </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Der Rückgang des Blattes hydraulische Leitfähigkeit mit Dehydratation variiert stark in Arten (Abb. 1). Dürre empfindliche Arten erleben einen stärkeren Rückgang bei weniger negativen Wasser Potentiale als Trockenheit tolerante Arten, wenn sie unter hohen Bestrahlungsstärke gemessen (PAR&gt; 1.000 mol • m -2 • s -1). Das WasserPotenzial bei 80% Verlust der hydraulischen Leitfähigkeit (P 80) für mesic Kraut Helianthus annuus war 3 MPa weniger negativ als die Heteromeles arbutifolia, native nach Kalifornien chaparral. Heteromeles arbutifolia reagiert linear auf die Verschlechterung der Wasserqualität Potenzial, während Helianthus annuus zeigten eine nicht linearen Rückgang. Beide stomatäre Leitfähigkeit (g s) und Blatt hydraulische Leitfähigkeit (K Blatt) können ebenfalls dramatisch zu reagieren Bestrahlungsstärke (Abb. 2). Für Raphiolepis indica, sank die stomatäre Leitfähigkeit stark mit Dehydration für Blätter unter hohen Bestrahlungsstärke gemessen (PAR&gt; 1.000 mol • m -2 • s -1) und unter Laborbedingungen leicht (PAR &lt;6 mmol • m -2 • s -1). Unter hoher Bestrahlungsstärke, Blätter mit dem EFM, die entwässerte dem Wasser Potenzial, das typisch für gut beleuchtete lea ist gemessen hattenves an intakten Pflanzen am Mittag zeigten ähnliche g s für Blätter auf intakte Anlagen mit einer Porometer (Stern in Abb. 2) gemessen. Insbesondere für Blätter am maximale Hydratation, war K Blatt vierfach höher für Blätter, die hohen als geringer Einstrahlung (11 vs 2,8 mmol m -2 s -1 MPa -1), und daher K Blatt zeigte eine stärkere Reaktion Licht in gut hydratisiert Blätter als g s. Ferner wurde unter hoher Bestrahlungsstärke sank K Blatt stärker mit Austrocknung. Die P 80 war 0,93 MPa weniger negativ unter hohem als geringer Einstrahlung. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4179/4179fig1.jpg" /> Abbildung 1. Blatt hydraulische Verwundbarkeit Kurven für eine Dürre sensitive (oben) und einer Dürre tolerant (unten) Arten (von 14,24). Jeder Punkt repräsentiert eine Sündegle Messung des Blattes hydraulische Leitfähigkeit (K Blatt) auf einem detached leaf mit der Verdunstungskühlung Flux-Methode (EFM). Die vertikalen Balken stellen das Wasser Potential, bei dem die Spezies verloren 80% der ursprünglichen Blatt hydraulische Leitfähigkeit (P 80). Best fit Funktionen mit maximaler Wahrscheinlichkeit für beide Arten aufgetragen. <img alt="Gleichung 7" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq7.jpg" fo:content-width="3.293in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq7highres.jpg"/><img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4179/4179fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Reaktion der Stomata Leitwert (g s) und des Blattes hydraulische Leitfähigkeit (K Blatt) zu sinkenden Blattwasserpotential für Raphiolepis indica unter hohem vs geringer Einstrahlung (ab 16) gemessen. (PAR&gt; 1.000 und &lt;6 mmol • m -2 • s-1). Jeder Punkt stellt eine einzelne Messung an einem detached leaf mit der Verdunstungskühlung Flux-Methode (EFM), mit weißen und schwarzen Punkten repräsentiert Blätter unter hohen und niedrigen Bestrahlungsstärke gemessen sind. Gleichungen für stomatäre Leitfähigkeit Kurven in hohem vs geringer Einstrahlung: <img alt="Gleichung 8" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq8.jpg" fo:content-width="4.727in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq8highres.jpg" /> und <img alt="Gleichung 9" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq9.jpg" fo:content-width="2.26in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq9highres.jpg"/> . Gleichungen für Sicherheitslücke Kurven in hohem vs geringer Einstrahlung: <img alt="Gleichung 10" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq10.jpg" fo:content-width="2.7in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq10highres.jpg"/> und <img alt="Gleichung 11" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq11.jpg" fo:content-width="1.8in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq11highres.jpg"/> . Der graue Star in der oberen Platte stellt den Mittelwert ± standard Fehler für g s und Blattwasserpotential auf Blättern intakter Pflanzen in der Mitte der Tag mit einem Porometer gemessen. Graue und schwarze senkrechte Balken in der unteren Platte stellen die Wasser Potential, bei dem die Spezies verloren 80% der ursprünglichen Blatt hydraulische Leitfähigkeit (P 80) unter hohen und niedrigen Bestrahlungsstärke sind.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+measures+of+leaf+capacitance:+insights+into+the+water+transport+pathway+and+hydraulic+conductance+in+leaves.">Two measures of leaf capacitance: insights into the water transport pathway and hydraulic conductance in leaves.</a> Funct. Plant Biol. 38, 118-126 (2011).</li><li>Nardini, A., Raimondo, F., Lo Gullo, M. A., Salleo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leafminers+help+us+understand+leaf+hydraulic+design.">Leafminers help us understand leaf hydraulic design.</a> Plant Cell Environ. 33, 1091-1100 (2010).</li><li>Sheriff, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaporation+sites+and+distillation+in+leaves.">Evaporation sites and distillation in leaves.</a> Ann. Bot. 41, 1081-1082 (1977).</li><li>Canny, M. J., Huang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+water+content+and+palisade+cell+size.">Leaf water content and palisade cell size.</a> New Phytol. 170, 75-85 (2006).</li><li>Santiago, L. S., Mulkey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+test+of+gas+exchange+measurements+on+excised+canopy+branches+of+ten+tropical+tree+species.">A test of gas exchange measurements on excised canopy branches of ten tropical tree species.</a> Photosynthetica. 41, 343-347 (2003).</li><li>Sack, L., Cowan, P. D., Jaikumar, N., Holbrook, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'hydrology'+of+leaves:+co-ordination+of+structure+and+function+in+temperate+woody+species.">The 'hydrology' of leaves: co-ordination of structure and function in temperate woody species.</a> Plant Cell Environ. 26, 1343-1356 (2003).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Verdunstungskühlung Fluss hier vorgestellte Methode ermöglicht eine relativ schnelle (30 min) Bestimmung des Blattes hydraulische Leitfähigkeit im Labor mit gleichzeitiger Messung stomatäre Leitfähigkeit. Der EFM ist bislang die Methode, die am ehesten den natürlichen Weg des Wassers in den Blättern, da Wasser verdunstet in den Blatt Lufträume und diffundiert aus der Spaltöffnungen 15. Eine Reihe von anderen experimentellen Methoden zur Bestimmung K Blatt existiert 25, mit drei wobei besonders häufig. (1) In der Hochdruckströmung Verfahren (HPFM) wird Wasser durch das Blatt unter Hochdruck 15,26 geschoben. Allerdings können Schwachstellen Kurven mit dieser Methode nicht, weil angewendet positive Drücke können füllen Embolien und rehydrieren Mesophyllgewebe. Erhältlich (2) In der Rehydratisierung Kinetik-Methode (RKM) ist K Blatt unter Verwendung der Analogie zwischen der Rehydratation von dehydrierten Blätter mit dem charging eines Kondensators in Reihe mit Widerständen 27,28. Diese Methode ist schnell, jedoch nicht reproduzieren das gesamte System der natürlichen transpirational Pfade im Blatt und ist nicht leicht modifiziert werden, um die Messung von Blättern akklimatisiert hohen Bestrahlungsstärke ermöglichen. (3) In der Vakuumpumpe Verfahren (VPM) das Blatt in einer Kammer platziert ist, dessen Stiel an einer Wasserquelle auf einer Waage verbunden ist, während Vakuum von unterschiedlichen Intensitäten zu dem Blatt Antreiben Wasserverlust aus dem Blatt 15,26 aufgebracht. Diese Methode kann sehr zeitaufwendig sein. Messungen mit allen drei Methoden haben sich konsistente Ergebnisse 15,28,29 und damit die EFM wird häufig aufgrund ihrer wobei auf transpirational Wasserbewegung Basis verwendet, und seine relative Geschwindigkeit, und dessen Modifikation zum Messen K Blatt unter verschiedenen Bedingungen. All die typischen Methoden zur Bestimmung K Blatt verwendet beinhalten eine Unsicherheit bei der Quantifizierung nachurately die treibende Kraft entspricht Transpiration 25. In dem EFM eingesetzte ΔΨ Blatt zu berechnen K Blattes niedriger ist als die wahre Antriebskraft, wie er auf dem Schüttgut Ψ Blattes bezogen wird, nachdem das Blatt ist äquilibriert der Druckbombe. An diesem Punkt wird der Großteil Ψ Blatt nicht unbedingt dem Wasser Potential der Zellen am Ende des Hydraulik-Stoffwechselweg, wo das Wasser verdampft, sondern eine Volumen-gewichteten Durchschnitt der relativ wenige Zellen mit niedriger Wasserpotential wo Wasser Bewegen und Verdampfen, und für die weitere zahlreiche Zellen mit hohem Wassergehalt, das sich aus dem Transpirationsstrom isoliert werden können. Wie viel die Ψ Blatt aus dem wahren Antriebskraft unterscheidet hängt somit von wo das Wasser in dem Blatt Verdampfen. Wenn Wasser verdampft während des Blattes kann das Bulk-Ψ Blatt in der Nähe der wahren Antriebskraft sein, und wenn Wasser verdunstet nur aus relativ wenigen cEllen nahe der Spaltöffnungen, kann der der Großteil Ψ Blatt wesentlichen unterschätzen die wahre Antriebskraft, also das Wasser Potential dieser Zellen kann tatsächlich viel niedriger sein, und damit K tatsächlichen Blattes niedriger wäre als die mit dem EFM bestimmt. Somit ist der Grad, dass K Blatt durch die EFM bestimmt die wahre K Blatt repräsentiert empfindlich auf die Wasserströmung Signalwege, die immer noch nicht gut verstanden. Während die EFM liefert Daten, die von anderen Methoden zur Messung K Blatt (siehe oben) entsprechen, und ist für die vergleichende Einsatz ausgezeichnet, die Möglichkeit der Arten-Variante in Wasser Fließwege durch die Mesophyll bedarf weiterer Untersuchungen. Tatsächlich, sogar für Blätter der gegebenen Spezies könnten diese Wasserwegen unter unterschiedlichen Bedingungen, beispielsweise variieren, unter verschiedenen Wärmelasten Bestrahlungsstärken und 4,30 oder verschiedener Gewässerzustands (gegeben Gewebeschrumpfung) 31. Weitere Kenntnisseder Wasser Transportwege ermöglichen würde somit das EFM verwendet werden, um die Auswirkungen der Änderung auf die allgemeine Wege Blatt hydraulischen Transport zu lösen. Die Messung der Leitfähigkeit in der Stomata EFM hat die Vorteile ermöglichen die Bestimmung von Antworten auf Bestrahlungsstärke und Dehydratisierung, und Bereitstellen abgestimmt Reaktionen g n mit K Blatt. Zusätzlich kann die Auswirkung vorheriger Blatt Dehydratisierung durch Rehydratisierung auf g s folgte mit diesem Verfahren untersucht werden. Jedoch hat dieses Verfahren zwei möglichen Nachteile. Erstens, dieses g s Messung an einem ausgeschnittenen Blatt gemacht wird, anstatt auf einer intakten Pflanze, und zweitens wird die Bestimmung der stomatäre Leitfähigkeit auf Klima-Messung in einiger Entfernung von dem Blatt, anstatt nahe dem Blatt wie in einem Porometer Kammer basiert , obwohl die Belüftung des Blattes mit dem Lüfter äquilibriert die Blattoberfläche mit Umgebungsluft. Für einige Arten, herausgeschnittenBlätter können zeigen unterschiedliche Reaktionen der Stomata als für Blätter auf einer intakten Pflanze 16,32. Jedoch für einige Arten g s unter Verwendung der EFM war ähnlich zu Werten an intakten Pflanzen mit einer Porometer für Blätter am Mittag Ψ Blatt 16 (Fig. 2) gemessen. Der EFM können für physiologische Einsicht, dh angewendet werden, die Untersuchung der Dynamik von K Blatt, dessen Basis in der Struktur und der Anatomie, und seine Reaktionen auf Umweltfaktoren. Zusätzlich kann das Verfahren verwendet werden, um Pflanzen der bestimmten Art unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet vergleichen oder verschiedenen Alters oder Pflanzen verschiedener Arten an unterschiedliche Umgebungen verglichen werden. Mit dem Bau Blatt Schwachstelle Kurven kann ein Einblick in die Mechanismen der Arten Toleranzen gegen Dürre zu gewinnen. Während Dürre, haben Kavitation und Zell Zusammenbruch wurde gezeigt, dass in dem Blatt Xylem einiger auftreten<html> Arten und Zellschrumpfung im Mesophyll während der Dehydratisierung könnte auch Auswirkungen Bewegung des Wassers (Übersicht in 14). Zukünftige Studien werden benötigt, um die relative Bedeutung eines jeden dieser Prozesse in Fahrt den Niedergang der K Blatt und Stomata bestimmen. Bestrahlungsstärke ist auch ein starker Faktor K Blatt und der EFM ist sehr für Messungen unter hohem Bestrahlungsstärke geeignet. Die kombinierte Antwort der Aquaporine um Bestrahlungsstärke und Dürre sollte gewinnen viel Interesse. Hohe Bestrahlungsstärke führt zu einer erhöhten Expression und / oder Aktivierung von Aquaporine, die schneller Wasserfluss ermöglichen durch lebende Zellen, wodurch K Blatt, während Dehydration führt zu einer verminderten Expression und / oder de-activatation der Aquaporine, wodurch K Blatt. Die kombinierten Auswirkungen der Bestrahlungsstärke und Wasserversorgung auf K Blatt erfordern weitere Untersuchungen 4,10,16,33. Zelt &quot;&gt; Weitere, über Arten, hat K Blatt und seine Verwundbarkeit wurde im Zusammenhang mit Arten Ausschüttungen in Bezug auf die Versorgung mit Licht Wasser und anderen Ressourcen 3,13,24. Arten aus trockenen Gebieten tendenziell größere Widerstandsfähigkeit gegen hydraulische Rückgang zeigen, mit Blick auf negativeren Bodenwasser Potentiale und durch Aufrechterhaltung eines hohen K Blatt bei negativeren Potentialen Wasser, können sie behalten hohe g s und weiterhin CO 2-Abtrennung für die Photosynthese 13,14. Somit stellt die Untersuchung von Blatt hydraulischen Eigenschaften Erkenntnisse auf der Ebene der Zelle, Blatt, und ganze Pflanze und ihre Reaktionen auf die Umwelt, und es ist wahrscheinlich, zahlreiche wichtige neue Entdeckungen auf allen Skalen ergeben.

measurement of leaf hydraulic conductance and stomatal conductance and their responses to irradiance and dehydration using the evaporative flux method (efm)

Wasser ist eine wichtige Ressource, und die Pflanze Wasser-Transport-System setzt Grenzen für maximales Wachstum und die Toleranz gegenüber Trockenheit. Wenn die Pflanzen die Spaltöffnungen öffnen, um eine hohe stomatäre Leitfähigkeit (g s) erreichen, um CO 2 für die Photosynthese zu erfassen, wird das Wasser durch Transpiration 1,2 verloren. Verdampfende Wasser aus den Lufträumen von Zellwänden ersetzt, die wiederum Wasser aus dem Xylem Blattadern wiederum Zeichnung aus Xylem in den Stängeln und Wurzeln. Als Wasser durch das System gezogen wird, erfährt es hydraulische Widerstand, wodurch Spannung im gesamten System und eine niedrige Blattwasserpotentials (Ψ Blatt). Das Blatt selbst ist ein kritischer Engpass in der gesamten Pflanze Systems Anteil von durchschnittlich 30% der Anlage hydraulischen Widerstand 3. Blatt hydraulischen Leitwert (K blatt = 1 / Blatt hydraulischen Widerstand) ist das Verhältnis der Wassermenge zu dem Wasser Potentialgradient über dem Blatt, und fasst dasVerhalten eines komplexen Systems:. bewegt sich das Wasser durch die Blattstiel und durch mehrere Aufträge von Venen, Ausfahrten in die Bündelscheide und durchläuft oder um Mesophyllzellen vor dem Verdampfen in den Luftraum und aus der Spaltöffnungen durchsickerte K Blatt ist von großem Interesse als wichtige physiologische Eigenschaft zu Spezies zu vergleichen, Quantifizierung der Wirksamkeit der Blattanordnung und Physiologie für den Wassertransport, und ein Schlüssel für Variable, um ihre Beziehung zu Schwankungen in der Struktur (beispielsweise in Blattrippen Architektur) und ihre Auswirkungen auf photosynthetischen Gasaustausch untersuchen. Ferner reagiert K Blatt fest an der inneren und äußeren Umgebung Blatt 3. Blatt K drastisch erhöhen kann mit Bestrahlungsstärke offenbar aufgrund von Änderungen in der Expression und Aktivierung von Aquaporine, die Proteine ​​in Wassertransport durch Membranen 4 beteiligt, und K blatt lehnt stark während drsollten, durch Kavitation und / oder Zusammenbruch des Xylem Leitungen und / oder Verlust der Durchlässigkeit in den extra-Xylem Gewebe aufgrund Mesophyll und Bündelscheide Zellschrumpfung oder Aquaporin Deaktivierung 5-10. Da K Blatt kann g s und photosynthetische Rate über Arten in gut bewässert Bedingungen und während der Dürre zu beschränken, und damit zu begrenzen ganzen Anlagenleistung sie möglicherweise bestimmen Arten Distributionen insbesondere Dürren in Häufigkeit und Schwere von 11 bis 14 zu erhöhen. Wir präsentieren Ihnen eine einfache Methode zur simultanen Bestimmung von K Blatt und g s am herausgeschnitten Blätter. Ein transpirierende Blatt wird durch seine Blattstiel zum Schlauch verbunden läuft mit einer Wasserquelle auf einer Waage. Der Verlust von Wasser aus dem Gleichgewicht wird aufgezeichnet, um die Strömungsrate durch das Blatt zu berechnen. Beim stationären Transpiration (E, mmol • m -2 • s -1) erreicht ist, g <sub&gt; S ist durch Dividieren durch Dampfdruckdefizit bestimmt und K Blatt durch Dividieren durch den Wasserpotential Antriebskraft bestimmt mit einem Druckraum (K = leaf E / - Δψ Blatt, MPa) 15. Diese Methode kann verwendet werden, um K Blatt Reaktionen auf verschiedene Bestrahlungsstärken und die Anfälligkeit der K Blatt zu Dehydratation 14,16,17 beurteilen.

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Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM

Wir beschreiben ein relativ schnelles (30 min) und realistische Verfahren zur gleichzeitigen Messung von blatt hydraulischen Leitwert (<em&gt; K</em<sub&gt; Blatt</sub&gt;) Und stomatäre Leitfähigkeit (<em&gt; G</em<sub&gt; S</sub&gt;) Für transpiring herausgeschnitten Blätter. Das Verfahren kann modifiziert werden, um die leichte und die Dehydratisierung Reaktionen zu messen<em&gt; K</em<sub&gt; Blatt</sub&gt; Und<em&gt; G</em<sub&gt; S</sub&gt;.

Measurement of Leaf hydraulische Leitfähigkeit und stomatäre Leitfähigkeit und ihre Antworten auf Bestrahlungsstärke und Dehydration Mit dem Evaporative Flux-Methode (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to ...

measurement-leaf-hydraulic-conductance-stomatal-conductance-their

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method (EFM)

37.1K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. Wir beschreiben ein relativ schnelles (30 min) und realistische Verfahren zur gleichzeitigen Messung von blatt hydraulischen Leitwert ( K

Serie: Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in cellular and mammalian models. Here, we describe detailed methods to perform stable isotopic profiling of intermediary metabolism and metabolic flux in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are described for profiling whole worm free amino acids, labeled carbon dioxide, labeled organic acids, and labeled amino acids in animals exposed to stable isotopes either from early development on nematode growth media agar plates or beginning as young adults while exposed to various pharmacologic treatments in liquid culture. Free amino acids are quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) in whole worm aliquots extracted in 4% perchloric acid. Universally labeled 13C-glucose or 1,6-13C2-glucose is utilized as the stable isotopic precursor whose labeled carbon is traced by mass spectrometry in carbon dioxide (both atmospheric and dissolved) as well as in metabolites indicative of flux through glycolysis, pyruvate metabolism, and the tricarboxylic acid cycle. Representative results are included to demonstrate effects of isotope exposure time, various bacterial clearing protocols, and alternative worm disruption methods in wild-type nematodes, as well as the relative extent of isotopic incorporation in mitochondrial complex III mutant worms (isp-1(qm150)) relative to wild-type worms. Application of stable isotopic profiling in living nematodes provides a novel capacity to investigate at the whole animal level real-time metabolic alterations that are caused by individual genetic disorders and/or pharmacologic therapies.

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling by gas chromatography mass spectrometric analysis of intermediary metabolic flux is described in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are detailed for assessing isotopic enrichment in carbon dioxide, organic acids, and amino acids following isotope exposure either during development on agar plates or during adulthood in liquid culture.

Stabilen Isotopen Profiling von Intermediary Metabolic Flux in Entwicklungs-und Erwachsenen-Stadium Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Forschung

Biologie

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Eine innovative Methode zur Quantifizierung und Exosom Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Die Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembran Regulator-Protein in Ausgedrückt<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Eine standardisierte Methode für die Analyse von Leber sinusoidalen Endothelzellen und ihre Fenestrationen durch Rasterelektronenmikroskopie

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Relating Stomatal Conductance to Leaf Functional Traits

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, morphological leaf traits have the potential to summarize plants strategies in terms of water use efficiency, growth pattern and nutrient use. The leaf economics spectrum (LES) is a recognized framework in functional plant ecology and reflects a gradient of increasing specific leaf area (SLA), leaf nitrogen, phosphorus and cation content, and decreasing leaf dry matter content (LDMC) and carbon nitrogen ratio (CN). The LES describes different strategies ranging from that of short-lived leaves with high photosynthetic capacity per leaf mass to long-lived leaves with low mass-based carbon assimilation rates. However, traits that are not included in the LES might provide additional information on the species&#39; physiology, such as those related to stomatal control. Protocols are presented for a wide range of leaf functional traits, including traits of the LES, but also traits that are independent of the LES. In particular, a new method is introduced that relates the plants&#8217; regulatory behavior in stomatal conductance to vapor pressure deficit. The resulting parameters of stomatal regulation can then be compared to the LES and other plant functional traits. The results show that functional leaf traits of the LES were also valid predictors for the parameters of stomatal regulation. For example, leaf carbon concentration was positively related to the vapor pressure deficit (vpd) at the point of inflection and the maximum of the conductance-vpd curve. However, traits that are not included in the LES added information in explaining parameters of stomatal control: the vpd at the point of inflection of the conductance-vpd curve was lower for species with higher stomatal density and higher stomatal index. Overall, stomata and vein traits were more powerful predictors for explaining stomatal regulation than traits used in the LES.

Unraveling how physiology and morphology are linked allows a deeper understanding of mechanistic functioning of plant leaves. We present both a procedure to derive parameters of stomatal regulation from stomatal conductance measurements and correlations with traditional functional leaf traits.

Bezug stomatäre Leitfähigkeit zu Blatt Funktionale Merkmale

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular systolic and diastolic function. Measures of ventricular contractility and compliance are obtained through examination of cardiac response to changes in afterload and preload. These techniques were originally developed nearly three decades ago to measure cardiac function in large mammals and humans. The application of these analyses to small mammals, such as mice, has been accomplished through the optimization of microsurgical techniques and creation of conductance catheters. Conductance catheters allow for estimation of the blood pool by exploiting the relationship between electrical conductance and volume. When properly performed, these techniques allow for testing of cardiac function in genetic mutant mouse models or in drug treatment studies. The accuracy and precision of these studies are dependent on careful attention to the calibration of instruments, systematic conduct of hemodynamic measurements and data analyses. We will review the methods of conducting pressure-volume loop experiments using a conductance catheter in mice.

Cardiac pressure-volume loop analysis is the most comprehensive way to measure cardiac function in the intact heart. We describe a technique to perform and analyze cardiac pressure volume loops, using conductance catheters.

Cardiac Druck-Volumen-Loop-Analyse mit Conductance-Katheter bei Mäusen

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Einfache und effektive Verwaltung und Visualisierung von Mikropartikeln im Herz-Kreislauf-System von kleinen Fischen mit Niere Injektion

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Messung des Energiestoffwechsels in explantierten Netzhautgewebe extrazelluläre Flux-Analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main lysosome-dependent pathway is called autophagy, while the primary non-lysosomal method for protein catabolism is the ubiquitin-proteasome system. Recent studies in model organisms suggest that the activity of both autophagy and the ubiquitin-proteasome system is not constant across the day but instead varies according to a daily (circadian) rhythm. The ability to measure biological rhythms in protein turnover is important for understanding how cellular quality control is achieved and for understanding the dynamics of specific proteins of interest. Here we present a standardized protocol for quantifying autophagic and proteasomal flux in vivo that captures the circadian component of protein turnover. Our protocol includes details for mouse handling, tissue processing, fractionation, and autophagic flux quantification using mouse liver as the starting material.

We describe our protocol for measuring biological rhythms in protein catabolism via autophagy and the proteasome in mouse liver.

Measurement of Leaf hydraulische Leitfähigkeit und stomatäre Leitfähigkeit und ihre Antworten auf Bestrahlungsstärke und Dehydration Mit dem Evaporative Flux-Methode (EFM)

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Stabilen Isotopen Profiling von Intermediary Metabolic Flux in Entwicklungs-und Erwachsenen-Stadium Caenorhabditis elegans