Die Autoren bedanken sich bei Tammy Esmaili für ihre Unterstützung danken dem Management von Labor-Verbrauchsmaterialien. AA ist der Empfänger einer PhD Scholarship vom Centre of Excellence für Alzheimer Disease Research and Care, School of Medical Sciences, Edith Cowan University. MC erhält PhD finanzielle Unterstützung aus dem Rotary Club, Perth. AM, sind GV, KT und RNM durch die McCusker Alzheimer Forschungsgemeinschaft.

Ein. Systemwartung <ol><li> Zebrafisch in einem zirkulierenden System, das kontinuierlich Filter gehalten und belüftet das System Wasser, um die Wasserqualität für eine gesunde aquatische Umwelt erforderlich halten. Die zirkulierende System hilft auch, um überschüssige Lebensmittel und Fischausscheidungen filtern. Verschiedene Unternehmen bieten Zebrafisch-Systeme, aber wir Systeme aus aquatische Habitate, USA in unserem Labor. Die Raumtemperatur oder die Temperatur des Behälters allgemein aufrechterhalten zwischen 26-28,5 ° C und die Lichtverhältnisse 14.10 hr sind (Licht: dunkel). Ein Zebrafisch-System von aquatische Habitate (zB Benchtop-System) kostet ~ 9.000 USD. Das Tischgerät mit zwei Regalen können sechs 10-Liter-, zwölf 3-Liter-oder 20 1,5-Liter-Tanks auf jedem Regal zu halten. Mehrere Zeilen von Fisch (zB transgene, Mutante, Wildtyp) kann auch auf dem gleichen System untergebracht werden. </li><li> Eine Reihe von verschiedenen Arten von Filtern in dem System verwendet. In unserem System Wasser aus allen Behältern passes durch ein 120-Mikron-Filter-Unterlage, 50-Micron-Filterpatrone, biologische Filter, Aktivkohle Absorptionsfilter und UV-Desinfektion-Filter, bevor sie zurück in den Tank umgewälzt wird. De-chlorinated/aged Wasser wird im Zebrafisch-System verwendet. Wasser kann durch Alterung für mindestens 48 h DE-chloriert werden. Unter idealen Bedingungen, sollte das Wasser in einem Reservoir mit einer Pumpe zirkuliert das Wasser, damit es warm gehalten werden, und Beschleunigung der de-Chlorierung. </li><li> Der pH-Wert des Systems Wasser sollte täglich überprüft und gewartet werden, zwischen 6,8 und 7,5. Gegebenenfalls ist Natriumbicarbonat verwendet, um den pH zu erhöhen. </li><li> Aquarien sollte regelmäßig gereinigt werden. Um ein Aquarium reinigen, schließen Sie den Wasserfluss zu diesem Tank, abtropfen überschüssige Wasser durch Kippen des Tanks nach hinten und entfernen Sie den Tank vorsichtig aus dem System. Schmutz und Algen werden auf dem Boden und an den Seiten des Tanks erkennen. </li><li> Legen Sie die Blende in einen sauberen Behälter und füllen mit de-chlorierte Wasser (aka-System water). Transferieren es vorsichtig in den Fisch in diesem Tank mit einem Fisch net. Schließen Sie den Deckel und übertragen das Namensschild des Tanks. Legen Sie das saubere Tank in das System und schalten Sie die Wasserversorgung. </li><li> Um den Fisch net, Spray mit 70% Ethanol dekontaminieren, in Wasser spülen und trocknen lassen, bevor wieder mit. Entfernen Sie die Blende von der verschmutzten Tank und sprühen beide Teile mit 70% Ethanol. Gründlich mit Leitungswasser und lassen Sie den Tank und Schallwand vollständig trocknen, bevor Sie wieder mit. </li><li> Die zirkulierenden System filtert müssen überprüft und regelmäßig auf ihre einwandfreie Funktion zu gewährleisten geändert. Diese Filter sollten regelmäßig gewechselt werden, um eine ordnungsgemäße und saubere Wasserversorgung für alle Aquarien zu gewährleisten. </li><li> Die 120-Mikron-Filter-Pad ist in der Regel neu oder ersetzt täglich; Neupositionierung in Richtung der Wasserströmung um es vollständig zu nutzen, bevor Sie mit einem neuen. </li><li> Die Filterpatrone sollte wöchentlich geändert werden. Um den Kanister Filter zu ändern, entfernen Sie die Filtereinheit durch Verdrehen anticlockwise mit einem Schraubenschlüssel oder Händen. Legen Sie eine Plastikfolie oder ein Handtuch unten zu verhindern oder zu absorbieren Wasser verschüttet. Ersetzen Sie den Außenfilter mit einer neuen und passen Sie die Filtereinheit wieder in das System vorsichtig mit den Händen und einem Schraubenschlüssel ggf. festziehen. </li><li> Der Aktivkohlefilter sollte alle zwei Wochen gewechselt werden (alle zwei Wochen). Um die Kohlefilter zu ändern, entfernen Sie den Aktivkohlefilter Gerät vorsichtig mit einem Schraubenschlüssel. Entsorgen Sie die gebrauchte Aktivkohle und ersetzen sie durch neue Aktivkohle. Bauen Sie die Carbon Halter und setzen Sie ihn wieder in die Filtereinheit. Den Filterträger wieder in das System. Schalten Sie das System neu und überprüfen, dass das Wasser den Filter fließt. Wenn nötig, spülen Sie etwas Wasser durch die Rohre von Schmutz in den Leitungen reinigen, bevor der Filter montiert in das System. </li><li> Der biologische Filter gereinigt alle sechs Monate überprüft werden. Ein biologischer Filter ist im Allgemeinen zwischen dem Kanister und Aktivkohlefilter in dem zirkulierenden System. Um die biologische Filter, rem ändernove die Filtereinheit aus dem System. Lassen Sie den Druck aus dem Filter, indem Sie den Druck loslassen. Lösen Sie den Filter mit einem Schraubenschlüssel. Im Allgemeinen sind zwei Personen für diesen Schritt erforderlich ist. Entfernen Sie den Deckel der Filtereinheit. Entleeren des Inhalts des Filters in einen Behälter, um die gesiebte siporax vom Wasser zu trennen. Anmerkung: siporax ist eine feinporige Biofilter Medien, die die Fähigkeit, sowohl die Nitrifikation und Denitrifikation durchzuführen hat. </li><li> Wenn die siporax ist sehr schmutzig ersetzen sie durch neue. Füllen Sie den Filter mit System Wasser (de-chlorierte Wasser), den Deckel schließen, kehren die Filtereinheit an das System an und schalten Sie die Wasserversorgung. Hinweis: In einer eingewöhnt Aquarium, das siporax wird die Heimat für mehrere Nitrifikanten sein. Diese Mikroorganismen sind kritisch für die Aufrechterhaltung der Stickstoffkreislauf im Aquarium, und Entfernen des primären Gehäuse für den biologischen Filter (das schmutzige siporax) konnten in einem schweren Ammoniak Spike führen, gefolgt von einem Nitrit Spike während der new biologischen Filter (mit neuen siporax) ist wieder herzustellen. Diese beiden Zwischenzustände des Stickstoff-Zyklus kann giftig für Wasserorganismen und kann Zebrafisch zu töten, wenn nicht angemessen reagiert. Daher ist es wichtig, eine sekundäre biologische Filter an anderer Stelle in dem Zebrafisch Gehäusesystem (z. B. in den Sammelbehälter in aquatischen System FFH) haben, um eine schnelle Repopulation dieser wichtigen Mikroorganismen auf der neuen siporax ermöglichen. </li><li> UV-Filter werden verwendet, um System biologischen Verunreinigungen (z. B. Bakterien) zu kontrollieren und sollte alle 9-10 Monate. Anzumerken ist, dass UV-Filter Desinfektion Dosisleistung ~ 110 mJ / cm 2 bei Beginn der Lebensdauer der Lampe und die Dosisrate nimmt im Laufe der Zeit, es ist daher notwendig, um die Kugel zu ersetzen, selbst wenn es noch erscheint, muss sein funktionell. </li></ol> 2. Ernährung <ol><li> Zebrafisch kann mit trockenen Lebensmitteln (food Größe von 100 Mikron für Larven t zugeführt werdeno 300/400 Mikron für ausgewachsene Fische) oder Lebendfutter (Artemia). Artemia (Artemia sp.) Eier sind von örtlichen Zoohandlungen und kann im Labor, indem Sie den einfachen Schritten unten beschrieben ausgebrütet. <ol class="lalpha"><li> Lösen Roten Meer Salz in alte Wasser, indem Sie einen Becher mit Salz auf einem Magnetrührer für eine bessere Löslichkeit. Alternativ kann Salz in Wasser durch Belüften mit dem Belüftungsrohr aufgelöst werden. Instant Ocean Salz kann auch als Schlupf-Lösung verwendet werden, wenn rote Meersalz ist nicht verfügbar. Salinenkrebse tolerieren kann eine breite Palette von Salzgehalt, aber schlüpfen wir unsere Artemia (10-15 g) in 30-35 g / L Roten Meer Salzwasser. Hinweis: Bei Artemia Eier sind nicht ohne weiteres in den lokalen Zoohandlungen verkapselt Salinenkrebse kann auch nach &quot;decapping&quot; sie in den Reihen, bevor sie auf die Garnelen Brüterei verwendet werden. Dies könnte auch zu vermeiden häufige Ausflüge in die Tierhandlung. </li><li> Füllen Sie den Artemia hatcher mit salt Wasser und fügen Sie die Garnelen Eier in einer Konzentration von 1,2 Esslöffel / Liter. Lüften Sie den hatcher kräftig mit einer Luftpumpe und lassen Sie die Artemia Eier für ~ 48 Stunden schlüpfen. Hinweis: Es wird darauf hingewiesen, dass un-angereicherten Artemia Nährwert jede Stunde nach dem Schlüpfen verlieren. Daher kann es zweckmäßig sein, entweder Luke über 24 h oder zu bereichern über 48 Std., um das maximale Nährwert von der Artemia erhalten. </li><li> Abwasser aus der Schlupf-System wird in die Quarantäne Abfällen hinzugefügt, um mit Bleichmittel desinfiziert und entsorgt werden später auf. </li></ol></li><li> Um die Salinenkrebse sammeln, entfernen Sie das Luftrohr und erlauben die Kultur für 4-5 min, jedoch nicht länger als 10 min zu begleichen. Die schraffierten Salinenkrebse sammeln sich an der Unterseite des Hatcher. <ol class="lalpha"><li> Collect Salinenkrebse mit dem Abgriff an der Unterseite der Schlupfanlage. Entsorgen Sie die erste Strömung, die von UN-geschlüpften Artemia Eier besteht. </li><li&gt; Nach Verwerfen der un-geschlüpften Artemia, sammeln die geschlüpften Artemia, die als Zebrafisch Lebensmitteln verwendet werden. </li><li> Trennen Sie die Salinenkrebse aus dem salzigen Wasser, mit einem Artemia collection net (~ 350 micron Nylongewebe). Spülen Sie die Salinenkrebse aus dem Netz in einen Behälter mit System Wasser. </li></ol></li><li> Die gesammelten Salinenkrebse sind allgemein in hoher Konzentration an der Unterseite des Behälters gibt es einen ziemlich orange Farbe. </li><li> Führen Sie die Salinenkrebse dem Zebrafisch mit einer Pipette oder einer Pipette / squeezy Flasche. Die Menge der Nahrung verzichtet hängt von der Bevölkerungszahl der einzelnen Tanks. Die allgemein akzeptierte Verhältnis für Zebrafisch ist bis 4% des Körpergewichts in Futter pro Tag erhalten. Zebrafisch sollte nie überfüttert, da dies den Nitratgehalt im Wasser zu erhöhen, möglicherweise Auswirkungen auf ihre Zucht, oder die Lebensfähigkeit, wie manche Fische sterben aufgrund overeating werden. <ol class="lalpha"><li> Beim Einspritzen Nahrung in derWasser, hungrige Fische schwimmen um die Salinenkrebse fangen. </li></ol></li><li> Trockenfütterung kann unter Verwendung eines Aquatic Eco-Systems / aquatische Habitate einfache Feder-basierte Fischfutter Spender werden. Alternativ können Trockenfütterung auch unter Verwendung eines einfachen Löffel oder durch Schneiden eines Kunststoff-Pipette diagonal mit einer Schere, um ihm das Aussehen eines kleinen Löffel. </li></ol> 3. Zucht <ol><li> Zebrafisch initiieren Züchtung bei Beginn der Licht. Befruchteten Eier können entweder durch in-Tank-Zucht oder paarweise Zucht erhalten werden. Während in-Tank-Zucht ist mehr Arbeit effizienter und für die regelmäßige Entnahmeeinheit in unserem Labor durchgeführt wird paarweise Zucht bevorzugt, wenn Gene oder Mutationen einzelner Fische abgeschirmt werden. </li><li> Für In-Tank-Züchtung, zusammenzubauen der In-Tank Züchter Drop langsam in das Aquarium nach Beginn der Licht. Alternativ kann im Tank Züchtung Aufbau über Nacht in dem Fischbecken gelassen werden. </li><li> LTrauf das In-Tank Züchter für etwa 15 min, damit die Fische vor dem Entfernen der Züchter aus dem Tank und das Sammeln der Eier paaren. </li><li> Paarweise Zucht ist in der Regel in den späten Nachmittag gesetzt nach der Fütterung. </li><li> Montieren Sie die Zucht und füllen Sie ihn mit alten System Wasser. </li><li> Übertragen ein weiblicher und ein männlicher auf gegenüberliegenden Seiten des Aufzuchtbecken. Frauen können von Männern wegen ihrer größeren Bauch unterschieden werden. Männer können auch von den Weibchen unterschieden werden, weil sie schlanker und dunkler in der Farbe als die Weibchen sind. Außerdem haben Männer mehr Gelbfärbung in der Afterflosse Vergleich zu Frauen (siehe Abbildung 1). Im Zweifelsfall Look für den ovipositor bei weiblichen Zebrafisch (siehe Abbildung 4). </li><li> Entfernen Sie den Teiler am nächsten Morgen kurz nach dem Beginn des Lichts. Erlauben Paarung auftritt für 20 min oder mehr bewegt werden bis eine ausreichende Zahl von Embryonen im Boden des Behälters festgelegt sind. </li><li> Nach Zucht,zurück die Fische zu ihren Panzern. Sammeln Sie die Eier mit einem Sieb. </li><li> Waschen Sie die Embryonen gründlich mit System Wasser. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen in eine Petrischale durch Spülen Sie das Sieb mit Embryo Medium; aka EM3 (NaCl, 13,7 mM; KCl, 0,54 mM; MgSO 4, 1,0 mM; CaCl 2, 1,3 mM; Na 2 HPO 4, 0,025 mM; KH 2 PO 4, 0,044 mM; NaHCO 3, 4,2 mM). </li><li> Embryonen können unter einem Mikroskop beobachtet werden. Befruchteten Eier werden dann aus den unbefruchteten Eiern mit einer Nadel und einer Pipette (siehe Abbildung 3) getrennt. </li></ol> 4. Anhebung der Larven <ol><li> Befruchteten Eier werden in einem Inkubator (~ 28,5 ° C) für 72 Stunden, bis die Larven geschlüpft gehalten. </li><li> Jetzt die Larven aus dem Chorion und Schwimmen frei sie bereit sind, zu einem wesentlichen Aquarium zu übertragen sind. Larven müssen ab 5 Tage nach der Befruchtung (dpf) zugeführt werden und werden im Keim Medium (Zusammensetzung beschriebenTeil 3, 10) oder Systemwasser. Larven können in runden Schalen mit ca. 50% oder mehr an Wasser darin auf einer täglichen Basis verändert gehalten werden. Der Wasserwechsel sollte das Entfernen verendeten oder kranken Larven und andere Ablagerungen. </li><li> Übertragen der Larven sanft in einem Tank, das eine kleine Größe Ablenkplatte (von etwa 300 bis 400 Mikron). Tote und kranken Larven zu entfernen und ein paar Milliliter Wasser sollte langsam auf einer täglichen Basis hinzugefügt werden. </li><li> Nach 14 Tagen können Larven Tanks werden in das System ad acta gelegt, und mit einem kleinen Bach des Radsports Wasser (1-2 Tropfen pro Sekunde). Wie die Larven wachsen, können Wasserdurchfluss erhöht werden. Verschiedene Größen von Prallflächen können je nach Größe der Larven (zB Schallwand Größe 300-400, 500, 700-750 und 1000 Mikron) und einem normalen Kunststoff Schallwand werden sollte für den erwachsenen Fischen verwendet werden. </li><li> Es dauert in der Regel 3 Monate für die Embryonen in geschlechtsreifen Erwachsenen zu entwickeln. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Zebrafisch stammen aus dem Ganges in Nordindien und werden immer in der Forschung populär sowohl in ihrem Erwachsenenleben und Larvenstadien 2, bewertet von Spence et al. 3. Zebrafisch besitzen mehrere Vorteile gegenüber anderen Tiermodellen wie hohe Fruchtbarkeit, Wartungsfreundlichkeit, optische Abstand von Embryonen, schnelle Embryonalentwicklung und niedrige Wartungskosten. Sie zugänglich sind Genmanipulation 6 und geeignet für das Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening 4,5. Ihre Befruchtung externen was vorteilhaft ist für die Verwendung von Entwicklungsbiologen. Aufgrund dieser günstigen Eigenschaften werden Zebrafisch an Popularität gewinnt in der Genetik 7, pharmakologische 8 und Verhaltensforschung 9,10. Es gibt eine Reihe von Herausforderungen zur Aufrechterhaltung eines Zebrafisch-Anlage und Zebrafisch Tierhaltung Embryonen zu erhalten. Hier beschreiben wir unsere Erfahrungen und Empfehlungen bei der Bewältigung dieser Herausforderungen und outline ein Protokoll für die Systemwartung, Fütterung, Zucht und Aufzucht der Larven. Systemwartung Um Zebrafisch in einem gesunden Zustand zu erhalten, ist es wichtig, sie mit einer sauberen Umgebung in einer ordnungsgemäß funktionierenden Aquariums System bereitzustellen. Ein wichtiger Teil davon ist Wechselsystem Filter regelmäßig, so dass alle Tanks richtige Wassermenge und sauberem Wasser erhalten. Es ist wichtig, zu einem Ausfall des Rad Wasserversorgung jedem Tank durch blockierte Systemrohre vermeiden. Die Rohre können mit einem höheren als normalen Wasserdruck und Durchfluss werden, wenn Verstopfung auftritt. Idealerweise sollten etwa 10% des Systems Wasser ersetzt täglich gute Wasserqualität aufrecht zu erhalten. Alternativ kann Wasser ersetzt werden, während die Änderung der Kanister oder Kohlefilter werden. Dies sorgt dafür, dass Schmutz in den Verbindungsleitungen diese Filter abgeschieden entfernt wird. Die Qualität des Wassers sollte regelmäßig überprüft werden. Parameter wie Alkalität, pH, temperature, Härte, Ammoniak, Sauerstoff, Salzgehalt und Leitfähigkeit sollte als wichtige Faktoren bei der Vertretung der Qualität des Systems Wasser (siehe Tabelle 2 für Details) berücksichtigt werden. Zumindest Nitrat, sollte pH-Wert und Temperatur auf einer regelmäßigen Basis, um eine gute Wasserqualität für den Wohnungsbau Zebrafisch sicher überwacht werden. Ideal Nitrat (NO 3 -) Ebenen sind &lt;50 mg / l 11; wenn hohe diese Ebenen kann durch Ersetzen des Wassers in dem Kreislaufsystem mit dem frischen System Wasser reduziert werden. Gelegentlich müssen Filter nicht gut passen und undicht werden, so empfiehlt es sich, für alle Lecks nach einem Filterwechsel überprüfen. Wenn der Wasserfluss von dem Hauptreservoir wird entweder nach dem Ändern der Wasserpumpe oder Ändern eines Filter blockiert ist, kann der Wasserstrom entweder durch Lösen oder Entfernen des Filters für ein paar Sekunden, jede Vakuums in den Leitungen erzeugt freizugeben wiederhergestellt werden. Die benötigte Zeit, um Filter ändern in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren, wie insgesamt biologischen Belastung o variierenn das System, Sauberkeit der andere Filter, und Schmutzansammlungen in den Rohren. Daher sollten Filter sofort geändert werden, wenn sie verschmutzt oder angezeigt, wenn alle Tanks sind nicht mit der korrekten Wasserversorgung werden. Es wird auch empfohlen, dass die Fische net mit 70% Ethanol gereinigt und in Wasser gespült, um es zu dekontaminieren, und man ließ sie, bevor sie wieder verwendet trocknen. Trocknung sorgt die Verdunstung von Ethanol, die sonst ist giftig für Fische. Die meisten der Zebrafisch-Systeme verwenden de-gechlortem Leitungswasser, aber verwenden einige Systeme entionisiertes Wasser. Es ist wichtig, um die Leitfähigkeit des Systems Wasser zwischen 300 und ~ 1500 uS halten, da dies reduziert die Energie der Fisch muss Körper Salze aufrechtzuerhalten. Daher kann Zebrafisch nicht in deionisiertem Wasser gehalten werden, es sei denn Salze zugesetzt werden, um die optimale Leitfähigkeit Niveau zu halten. Es besteht die Gefahr der möglichen hohen Kupferkonzentrationen im System Wasser, wenn Leitungswasser wird verwendet, da der Aktivkohlefilter nicht entfernt Kupfer. Daher users sollte für Kupfer-Konzentrationen zu überprüfen und zu vermeiden Kupferrohren, soweit möglich. Ernährung Zebrafisch sollte nie überfüttert, da dies den Nitratgehalt im Wasser zu erhöhen, möglicherweise Auswirkungen auf ihre Zucht 11, oder die Lebensfähigkeit, wie manche Fische sterben aufgrund overeating werden. Wir empfehlen die Bereitstellung keine Nahrung mehr in einem Fütterung als ein Tank von Fisch kann innerhalb von 10 min zu beenden. Es ist sehr wichtig, um Salz aus der Salzlösung zu entfernen Shrimps vor der Zuführung zu dem Zebrafisch als überschüssige Salzkonzentration Tode führt. Wenn mehr Zebrafisch-Eier erforderlich sind, können die Fische dreimal am Tag gefüttert werden. Reinigung der Züchter Aquarien täglich verbessert auch Ebenen der Eierproduktion. Bei der Fütterung auf die aquatische Habitate Systeme, die wir in der Regel das Wasser abzustellen Pumpe und Luftpumpe, damit die Fische das Futter für 10 min essen. Dies verringert die Menge an Nahrung, die in den Filtern gewaschen wird. Benutzer müssen jedoch vorsichtig sein, um remEmber auf dieser Pumpen danach wieder einzuschalten. Zucht Zebrafisch sind in der Regel bei optimaler Zucht Zustand zwischen ~ 3 und 18 Monate alt. Paarweise Zucht darf nicht an zwei aufeinanderfolgenden Tagen 11 durchgeführt werden, jedoch in-Tank-Zucht kann täglich als Tank durchgeführt werden kann viele Fische, die die Chance des gleichen Paares der Fische wird für zwei Tage in einer Reihe gezüchtet reduziert. Zucht sollte in regelmäßigen Abständen durchgeführt werden, auch wenn Eier sind nicht erforderlich. Dieser Prozess stellt sicher, die Zucht der Fische Zyklus aufrechterhalten wird. Es wird empfohlen, dass es mehr Frauen als Männer in einer Zucht Set-up. Männlich Zebrafisch ändern ihre weiblichen Partner auf einer täglichen Basis 12, die weiter unterstützt diese Empfehlung. Außerdem in unserem Labor haben wir zunächst hatten Probleme mit der Zucht, aber mit mehr Frauen als Männer in einer Zucht set-up half das Problem lösen. Darüber hinaus Fütterung mit einem hohen Proteingehalt content Ernährung und Artemia 2-3 mal am Tag, Misch-Fisch aus verschiedenen Tanks (aus verschiedenen Eltern), wobei die Temperatur der Zucht Set-up zwischen 27 und 28 ° C, und drückte die Bäuche der Weibchen mit blockierten Eierstock Rohre mit sanfte Massage weitere Eierproduktion verbessert. Wir empfehlen, eine Aufzeichnung der Fische Zeilen / Ursprung in-Zucht zwischen Geschwistern zu vermeiden. Dies verbessert zusätzlich die Embryo-Erzeugungseinheiten. Aufzeichnungen über die Anzahl der Embryonen von Fischen aus jedem Tank gelegt wird ebenfalls empfohlen. Dies hilft mit der Führung eines Titels der besten Zucht Aquarien und Maßnahmen zur Zucht in der Fisch nicht Eiablage zu verbessern. Anhebung der Larven Fütterung der Larven sollte 5 dpf (Tage nach der Befruchtung) beginnen. Junge Larven können mit trockenen Lebensmitteln von ~ 100 Mikrometer groß (zB ZM100) oder Lebendfutter wie Pantoffeltierchen und Rädertierchen (das stimuliert das Wachstum) zugeführt werden. Das Essen Größe kann langsam erhöht werdenbis 200 Mikron (zB ZM200) oder 300/400 Mikrometer (zB ZM300). Eine Population von erwachsenen Fischen sollte ca. 6-7 Fisch pro Liter Wasser. Diese Praxis ist für eine bessere Wartung der BSB (Biologischer Sauerstoffbedarf) zu den Tanks empfohlen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td></td></tr><tr><td> Zebrafisch Umlaufsystems </td><td> Aquatische Habitate, USA </td><td> AHAB Stand-alone-, Bank-Top-Systeme </td><td></td></tr><tr><td> Sodium Bicarbonate </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Fischfutter Spender / Dry Food Feeder </td><td> Aquatische Habitate, USA </td><td> AH19 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> SZX12 </td><td></td></tr><tr><td> Dry Food </td><td> ZM Fischfutter, UK </td><td> ZM100, ZM200, ZM300 </td><td></td></tr><tr><td> Artemia Eier </td><td> Salt Creek, Inc., USA </td><td> Premium Grade </td><td></td></tr><tr><td> In-Tank-Züchter</td><td> Aquatische Habitate, USA </td><td> ITSTS-A </td><td></td></tr><tr><td> Aktivkohle </td><td> Penn-Plax Pro-Krabben, USA </td><td> PBC3MF </td><td></td></tr><tr><td> Zuchtbecken </td><td> Aquatische Habitate, USA </td><td> SBTANK (1L) Züchter Panzer-2 (2L) </td><td></td></tr><tr><td> Red Meersalz </td><td> Red Meersalz, USA </td><td> Örtlichen Tierhandlung / <a href="http://www.redseafish.com" target="_blank">www.redseafish.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Filter (Kanister, Filtermatten und UV) </td><td> Aquatische Habitate, USA </td><td> <a href="http://www.aquatichabitats.com" target="_blank">aquatichabitats.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Siporax Medien </td><td> Aquatische Habitate, USA </td><td> BF 820 </td><td></td></tr><tr><td> Artemia net </td><td> Aquatische Habitate, USA </td><td> BSN1 </td><td></td></tr><tr><td> Artemia hatcher </td><td> Aquatische Habitate, USA </td><td> BS252 </td><td></td></tr><tr><td> Schikanen </td><td> Aquatische Habitate, USA </td><td> <a href="http://www.aquatichabitats.com" target="_blank">aquatichabitats.com</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Tabelle spezifische Reagenzien und Ausrüstung in diesem Protokoll verwendet. </td></tr></tbody></table>

regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: an introduction

Dieses Protokoll beschreibt die regelmäßige Pflege und Wartung eines Zebrafisch-Labor. Zebrafisch sind jetzt an Popularität gewinnt in der Genetik, pharmakologischen und Verhaltensforschung. Als Wirbeltier werden Zebrafisch Aktien beträchtliche genetische Sequenz Ähnlichkeit mit Menschen und ist als Tiermodell für verschiedene menschlichen Krankheitszuständen verwendet. Die Vorteile der Zebrafisch im Vergleich zu anderen gemeinsamen Wirbeltier Modelle verfügen hohen Fruchtbarkeit, geringe Wartungskosten, transparent Embryonen und schnelle Entwicklung. Durch die Ausläufer des Interesses im Zebrafisch Forschung, die Notwendigkeit zur Schaffung und Aufrechterhaltung einer produktiven Zebrafisch Gehäuse Anlage ist ebenfalls steigend. Obwohl Literatur ist für die Aufrechterhaltung eines Zebrafisch Labor verfügbar ist, wird eine kurze Videoprotokoll fehlen. Dieses Video veranschaulicht das Protokoll für die regelmäßige Haltung, Fütterung, Zucht und Aufzucht von Zebrafisch-Larven. Dieser Prozess wird den Forschern helfen, das natürliche Verhalten und optimale Bedingungen zebrafis verstehenh Tierhaltung und damit beheben experimentelle Fragen, die von den Fischen Haltungsbedingungen stammen. Dieses Protokoll wird von großer Hilfe für Forscher planen, ein Zebrafisch Labor zu etablieren und auch für Studierende, die beabsichtigen, Zebrafisch als Tiermodell verwenden absolvieren sein.

Zebrafisch Gehäuse und Wartung ist einfacher und billiger als herkömmliche Nagermodellen. Mehrere tausend Zebrafisch kann in einem kleinen Labor untergebracht werden. Als Ergebnis dieses Protokolls werden Forscher in der Lage, eine Einrichtung, die Zebrafisch gesunden Bedingungen zum Zebrafisch liefert verwalten. Darüber hinaus werden die folgenden Abbildungen zu identifizieren befruchtete Eier, erwachsenen Zebrafisch, und ihre Nahrung. Eine Illustration eines männlichen Zebrafisch (Abbildung 1A) und weiblichen Zebrafisch (Abb. 1b und 1c) wird gezeigt, dass den Forschern helfen, zwischen einem männlichen und einem weiblichen Zebrafisch für die Zucht Zweck zu unterscheiden Abbildung 2 zeigt eine mikroskopische Ansicht;. Salinenkrebse mit 12facher (Abbildung 2A), eine einzelne Artemia bei 90X (2B) und eine unbefruchtete Artemia Ei 90X (Abbildung 2C). Dies wird für das Verständnis der Unterschied zwischen unbefruchteten und befruchteten Salinenkrebse für prop helfener Fütterung Zwecke. Befruchteten und unbefruchteten Eier werden in Abbildung 3 dargestellt. 3A veranschaulicht eine mikroskopische Ansicht der befruchteten und unbefruchteten Embryonen. Unbefruchteten Embryonen sind in der Regel undurchsichtig und / oder mit geplatzten Zelle (n) in der Chorion (schwarzer Pfeil), während befruchteten Embryonen scheint intakt und wächst auf der nächsten Zellteilung Zustand (für detaillierte Lektüre der verschiedenen Stadien des Zebrafisch-Embryonen siehe 1). Höhere Vergrößerung Ansicht eines befruchtet und eine unbefruchtete Eizelle in 3B gezeigt und 3C sind. Abbildung 4 zeigt einen weiblichen Zebrafisches ovipositor Forschern zu helfen, zwischen einem männlichen und einem weiblichen Zebrafisch unterscheiden. Mehrere kritische Probleme, die in einem Zebrafisch Labor auftreten können gehören Blockade der Wasserversorgung auf einzelne / alle Tanks im Gehäuse-System, schlechte Wasserqualität, und Leckagen in Rohrleitungen oder Behälter des Kreislaufsystems. ZusätzlichProbleme bei der Beschaffung von Embryonen aus Zucht könnte ein weiteres Anliegen sein. Troubleshooting dieser Fragen wird im Folgenden erörtert. <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Eine Illustration eines männlichen Zebrafisch (A) und weiblichen Zebrafisch (B, C). <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Eine mikroskopische Ansicht der Salinenkrebse mit 12facher (A), eine einzelne Artemia bei 90X (B) und eine unbefruchtete Artemia Ei 90X (C). <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Mikroskopische Aufnahme (16X) von befruchteten und unbefruchteten Eiern, wo nur zwei Eier werden unbefruchtete, die unbefruchteten Eier werden mit schwarzen Pfeile (A). Höhere VergrößerungAnsicht (90X) einer befruchteten Eizelle (B) und eine unbefruchtete Eizelle (C). <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Eine weibliche Zebrafisches ovipositor (angegeben mit schwarzer Pfeil) Darstellung. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Parameter </td><td fo:width="3in"> Optimalen Bereich </td></tr><tr><td> Alkalinität </td><td> 50-150 mg / L CaCO 3 </td></tr><tr><td> pH </td><td> 6,8-7,5 (6,0-8,5 toleriert) </td></tr><tr><td> Temperatur </td><td> 26-28,5 ° C </td></tr><tr><td> Härte </td><td> 50-100 mg / L CaCO 3 </td></tr><tr><td> Un-ionisierten Ammoniak </td><td> &lt;0,02 mg / L </td></tr><tr><td> Nitrat (NO 3 -) </td><td> &lt;50 mg / l </td></tr><tr><td> Nitrit (NO 2 -) </td><td> &lt;0,1 mg / l </td></tr><tr><td> Gelöstem Sauerstoff </td><td> &gt; 6,0 mg / L </td></tr><tr><td> Salzgehalt </td><td> 0,5-1 g / L </td></tr><tr><td> Leitfähigkeit </td><td> 300 -1500 uS </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Wasserqualität Parameter. Wasserqualität Parameter. Optimale Palette von ökologischen Parametern in der Zebrafisch Aquarium 11.

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Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

Dieses Protokoll beschreibt die regelmäßige Wartung und Pflege, um optimale Bedingungen für die Zebrafisch Haltung beizubehalten. Das Video veranschaulicht das Protokoll, für die Systemwartung, regelmäßige Haltung, Fütterung, Zucht und Aufzucht von Zebrafisch-Larven.

Regelmäßige Pflege und Wartung eines Zebrafisch (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Labor: Eine Einführung

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

88.4K Aufrufe.  Edith Cowan University. Dieses Protokoll beschreibt die regelmäßige Wartung und Pflege, um optimale Bedingungen für die Zebrafisch Haltung beizubehalten. Das Video veranschaulicht das Protokoll, für die Systemwartung, regelmäßige Haltung, Fütterung, Zucht und Aufzucht von Zebrafisch-Larven.

Serie: Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Gross und Fine Dissection of Inner Ear Sinnesepithelien in Adult Zebrafisch ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Forschung

Biologie

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Herz Dissection in Larven, juvenile und adulte Zebrafisch, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo Modellierung des Morbid Human Genome mit Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Hochdurchsatz-<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energieumsatz-Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Aufrechterhaltung eines<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Bevölkerung Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.

Nachweis Estrogenic Liganden in Körperpflege-Produkte mit einer Hefe Östrogen Bildschirm optimiert für Undergraduate Teaching Labor

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that the incubation in normoxic (5% CO2 in air) or hypoxic (low oxygen levels) conditions followed by an anoxic incubation (an absence of free oxygen) results in limited viability (2&#8211;3 days). A novel methodology was developed that enables an anoxic cell cultivation (for at least 17 days; the maximum time tested). The most critical aspect of this methodology is to ensure that no oxygen is introduced into the system. This is obtained by the degassing of media, and by flushing tubes, dishes, flasks, and pipettes with an anaerobic gas mixture (H2, CO2, N2) followed by permitting the materials to equilibrate to the anoxic (non-oxygen) environment prior to usage.&#160;Additional care must be exercised when acquiring photomicrographs to ensure that the micrographs obtained do not contain artifacts. In the absence of oxygen, cell morphology is significantly altered. Two distinct morphotypes are noted for all anaerobically-grown cells. The ability to grow and maintain mammalian cells in the absence of oxygen can be applied to the analysis of cell physiology, polymicrobial interactions, and the characterization of biosynthetic pathways for novel cancer drug development.

Here, we describe a new method that enables the anaerobic long-term cultivation of established cell lines. The maximum survival time that was tested is 17 days. This method is suitable for the testing of cytotoxic agents and exploring the physiology of anoxically replicating cells.

Anaerobe Wachstum und Erhalt von Säugetieren Zelllinien

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

Etablierung und Pflege von Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These structures are collectively known as the nucleoskeleton and include the nuclear lamina, the nucleoli, and nuclear bodies. Although many variants of fluorescence in situ hybridization (FISH) exist to study the genome and its organization, these are often limited by resolution and provide insufficient information on the genome&#39;s association with nuclear structures. The DNA halo method uses high salt concentrations and nonionic detergents to generate DNA loops that remain anchored to structures within nuclei through attachment regions within the genome. Here, soluble nuclear proteins, such as histones, lipids, and DNA not tightly bound to the nuclear matrix, are extracted. This leads to the formation of a halo of unattached DNA surrounding a residual nucleus which itself contains DNA closely associated with internal nuclear structures and extraction-resistant proteins. These extended DNA strands enable increased resolution and can facilitate physical mapping. In combination with FISH, this method has the added advantage of studying genomic interactions with all the structures that the genome is anchored by. This technique, termed HALO-FISH, is highly versatile whereby DNA halos can be coupled with nucleic acid probes to reveal gene loci, whole chromosomes, alpha satellite, telomeres and even RNA. This technique provides an insight into nuclear organization and function in normal&#160;cells and in disease progression such as with cancer.

Combining DNA halo preparations with fluorescence in situ hybridization enables high-resolution analysis of genomic interactions with the nucleoskeleton. Attached genome leads to hybridized fluorescent signals located within the residual extracted nuclei, whereas non-attached genome is in the halo of DNA surrounding the residual nuclei.