Dieses Protokoll kann für die Bewertung von Anhaftungen an das Nukleoskelett verwendet werden, anstatt die DamID-Sequenzierung zu verwenden, und es handelt sich um einen Einzelzellassay. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie kostengünstig und leicht zugänglich ist. Es kann funktionelle Unterschiede zwischen Genen und Chromosomen hervorheben, die bei anderen Visualisierungstechniken normalerweise nicht auftreten würden.
Räumliche und funktionelle Organisationen innerhalb des Genoms in behandelten Krebs- und Progeriezellen sowie genomische Verhaltensunterschiede in seneszenten Zellen können mit diesem Protokoll bewertet werden. Diese Methode kann auf jeden Zell- oder Gewebetyp über die gesamte Lebensspanne und auf jede Krankheit angewendet werden. Es kann auch in Modellorganismen eingesetzt werden, in denen Sonden zur Verfügung stehen.
Bereiten Sie zunächst 500 Milliliter 10%ige Salzsäure vor und gießen Sie diese in ein großes Becherglas. Lassen Sie Objektträger einzeln in die Säure fallen und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem auf zwei G eingestellten Shaker. Dekantieren Sie die Säure aus dem Becherglas und waschen Sie die Objektträger 10 Mal in Leitungswasser. Dann weitere 10 Mal in deionisiertem Wasser.
Spülen Sie die Objektträger zweimal in Methanol und bewahren Sie sie bis zur Sterilisation in Methanol auf. Kippen Sie die Objektträger zum Trocknen auf ein Papiertuch und wickeln Sie sie zur Sterilisation in einem Autoklaven oder heißen Ofen in Folie ein. Züchten Sie die Zellen im geeigneten Medium mit Serum für mindestens 48 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bis eine Konfluenz von 60 bis 70 % erreicht ist.
Ernten Sie jeden Zelltyp und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Säen Sie einmal 10 bis fünf Zellen in 10 Milliliter Medium pro Objektträger. Nehmen Sie die Kulturschale mit den Objektträgern und den anhaftenden Zellen aus dem Inkubator.
Entsorgen Sie das Medium und beschriften Sie die Dias mit einem Bleistift. Legen Sie sie dann in ein Coplin-Glas mit 50 Millilitern eiskaltem Zytoskelettpuffer. Inkubieren Sie das Glas 15 Minuten lang auf Eis oder bei vier Grad Celsius.
Entsorgen Sie den Zytoskelettpuffer und spülen Sie die Objektträger dreimal schnell in 50 Milliliter einmaligen DNA-Halo-Puffer, indem Sie sie mit dem Puffer in ein Coplin-Glas tauchen. Übertragen Sie die Objektträger in ein Coplin-Glas mit 50 Millilitern Extraktionspuffer und inkubieren Sie sie vier Minuten lang bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Objektträger dann nacheinander in 50 Millilitern 10-mal, fünfmal, zweimal und einmal DNA-Halo-Puffer für jeweils eine Minute.
Wenn Sie fertig sind, tauchen Sie die Objektträger durch eine sequenzielle Ethanolreihe von 10, 30, 70 und 95 % Ethanol. Führen Sie die Objektträger jeweils fünf Minuten lang durch eine sequenzielle 50-Milliliter-Ethanolserie mit 70, 90 und 100 % Ethanol. Trocknen Sie sie an der Luft auf einem Warmhalteteller.
Dann im 70 Grad Celsius heißen Ofen fünf Minuten backen. Denaturieren Sie die Objektträger, indem Sie sie zwei Minuten lang bei 70 Grad Celsius in eine 70%ige Formamid-SSC-Lösung legen. Legen Sie die denaturierten Objektträger fünf Minuten lang in 50 Milliliter eiskaltes 70%iges Ethanol.
Bewegen Sie sie dann fünf Minuten lang durch eine Ethanolreihe von 90, 95 und 100 % bei Raumtemperatur. Wenn Sie fertig sind, trocknen Sie die Objektträger auf einer Warmhalteplatte an der Luft. Denaturieren Sie die DNA-Sonden bei 75 Grad Celsius für 10 Minuten in einem heißen Block oder Wasserbad.
Anschließend werden sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert, bevor 10 Mikroliter auf den entsprechenden Objektträger pipettiert werden. Überziehen Sie die Sonde mit einem 21 x 21 Millimeter großen Deckglas und versiegeln Sie es mit Gummizement. Inkubieren Sie die Objektträger mindestens 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Hybridisierungskammer.
Nach der Inkubation den Gummizement vorsichtig mit einer Pinzette entfernen. Anschließend werden die Objektträger in 50 Millilitern 50%iger Formamid-Zweimal-SSC-Lösung bei pH sieben, die auf 45 Grad Celsius vorgewärmt wurde, für drei fünfminütige Inkubationen inkubiert. Als nächstes legen Sie die Objektträger in 50 Milliliter 0,1-facher SSC-Lösung, die auf 60 Grad Celsius vorgewärmt wurde, aber in ein 45 Grad Celsius warmes Wasserbad.
Inkubieren Sie fünf Minuten lang und ersetzen Sie den Puffer zweimal für fünfminütige Inkubationen. Legen Sie die Objektträger in ein Coplin-Glas mit 50 Millilitern vierfacher SSC-Lösung bei Raumtemperatur und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang mit drei Pufferwechseln. Um die Bindung unspezifischer Antikörper zu verhindern, tragen Sie 100 Mikroliter 4%BSA-Vierfach-SSC-Lösung auf jeden Objektträger auf und überziehen Sie ihn mit einem Stück Paraffinfolie.
10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann inkubieren Sie die Objektträger mit 100 Mikrolitern Streptavidin Cy3, verdünnt eins zu 200, für eine Stunde bei Raumtemperatur, um die markierte Sonde nachzuweisen. Legen Sie die Objektträger in ein Coplin-Glas mit 50 Millilitern vierfacher SSC-Lösung bei Raumtemperatur und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang mit drei Pufferwechseln.
Montieren Sie die Objektträger in 20 Mikrolitern einer DAPI-haltigen Montagelösung und überlagern Sie sie mit einem 22 x 50 Millimeter großen Deckglas. Visualisieren Sie DNA-Halos und Chromosomengebiete mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einem 100-fachen Ölobjektiv. Die DNA-Halo-Präparation ermöglicht es, den Rand eines Restkerns, die im Restkern verbleibende DNA und die ungebundene DNA, die sich in die Umgebung ausgebreitet hat, zu sehen.
DNA-Halos von proliferierenden humanen dermalen Fibroblasten wurden aus Zellen mit eingebautem BRDU erzeugt und anschließend mit Anti-BRDU-Antikörpern gefärbt. Proliferierende Zellen waren positiv für BRDU und anti-pKi-67. Dieses Protokoll wurde verwendet, um Chromosomenterritorien innerhalb von DNA-Halos sichtbar zu machen.
Einzelne Chromosomen wurden mit spezifischen Ganzarm-Chromosomen-Malsonden für die Chromosomen 1, 13, 17 und 18 markiert. Anti-pKi-67 wurde verwendet, um proliferierende Zellen und deren Abwesenheit in derselben Kultur zu markieren. DNA-Halo-Präparationen mit Telomeren in grün sind hier dargestellt.
Es ist möglich, den Anteil der Telomere im DNA-Halo zu beobachten, insbesondere im Bild des zweiten Experiments. Der mittlere Anteil an Telomeren lag bei ca. 17% in ruhenden Zellen. Unterschiede in der Chromosomenbindung wurden in primär kontrollierten Fibroblasten und in erkrankten Zellen mit typischem und atypischem Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndrom festgestellt, die eine andere Sun1-Isoform und keine Lamin-A-Mutation exprimieren.
Die Chromosomen eins und 13 zeigen statistisch signifikante Unterschiede in ihrer Anheftung innerhalb der Restkerne im Vergleich zu kontrollierten DNA-Halos. Die Position des gesamten Chromosomenterritoriums korrelierte mit dem Restkern und dem DNA-Halo. Wenn Sie dieses Protokoll ausprobieren, stellen Sie sicher, dass die Zellen in der richtigen Dichte ausgesät und zum richtigen Zeitpunkt extrahiert werden.
Im Anschluss an dieses Verfahren können indirekte Immunfluoreszenz und RNA-FISH durchgeführt werden.
