Name: high throughput danio rerio energy expenditure assay
Uploaded: 2016-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
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The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).

Hinweis: Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Universität von Arizona Amt für verantwortliches Handeln in der Forschung und wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss gebilligt wurde 1. Zebrafisch-Embryo Zucht und Wartung <ol><li> Bereiten E3 Embryo Medium 8. Um 60x Stammlösung machen, lösen sich 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl 2 ● 2 H 2 O und 9,78 g MgCl 2 ● 6 H 2 O in 1,95 L ddiH 2 O. Der pH-Wert auf 7,2 unter Verwendung von NaOH und HCl Lautstärke bis 2 L mit ddiH 2 O. </li><li> Um 1x E3 Embryo Medium herzustellen, verdünnte 16,5 ml 60x Lager in 1 L ddiH20. Fügen Sie 100 ul 1% Methylenblau. </li><li> Zucht <ol><li> Haus Männliche und weibliche Zuchtbestands (7-18 Monate alt) separat an Fruchtbarkeit zu maximieren. </li><li> Mach das Licht aus 1-2 Stunden vor der am Tag vor der Eier erwünscht sind. Richten Sie Paarung (1 männlich und 1-2 Weibchen) in cRossing Käfige 9, wie zuvor beschrieben. Crossing Käfigen ermöglichen die Eier Raub zu entkommen, als sie durch den perforierten Boden des Tanks Einsatz, in dem die ausgewachsene Fische gehalten werden, übergeben. </li><li> Optional:. Für zeitgesteuerte Zucht, (wie es für Studien mit Morpholino Injektion erforderlich), trennen Sie den männlichen und weiblichen Fische von einem durchsichtigen Kunststoff-Teiler, entfernen diese am Morgen, um in zeitlicher Verlegung der Eier und die Befruchtung führen. Für Morpholino Studien durchführen Leistungsberechnungen, die Zahl der embryonalen Fisch pro Behandlung erforderlich zu bewerten. Ohne eine Schätzung der Größe des Effekts oder Abwandlung kann eine vorläufige Prüfung bei der n = 8 ausgeführt. </li></ol></li><li> Gießen Sie die Eier aus der Kreuzung Käfig in eine Petrischale (100 bis 150 Embryonen / 10 cm Petrischale). Lassen Sie die Eier auf den Boden der Schale niederzulassen und abgießen. Entfernen Sie das restliche Wasser mit einer feinen Spitze Einweg-Transferpipette. Zurück E3 Embryo Medium in Schritt 1.1 gemacht hinzufügen. </li><li> Machen aflame poliert Einwegpipette für zukünftige Ei und Fisch Übertragung. Mit einer Schere, schneiden Sie ein absolvierte Einmaltransferpipette an der 0,25 ml Graduierung. Um Ecken und Kanten, Flammpolitur der Schnitt Spitze über einem Bunsenbrenner zu entfernen. </li><li> Pflegen embryonale Fisch bis 4 Tage nach der Befruchtung (DPF) in 10 cm Petrischalen im Zebrafisch E3 Embryo Medium bei 28,5 ○ C Zweimal täglich, verwenden Sie eine Flamme poliert absolvierte Einmaltransferpipette, um alle unbefruchteten Eiern oder toten Embryonen (opak weißes Aussehen) zu entfernen. Einmal täglich, tauschen E3 Embryo Medium. Abgießen E3 Embryo Medium, entfernen Sie verbleibende Flüssigkeit mit einer feinen Spitze Einweg-Transferpipette, und fügen Sie wieder vorgewärmten (28,5 ○ C) E3 Embryo Medium. </li></ol> 2. Bereiten Sie Testlösung <ol><li> Vorbereitung der Testlösung gemäß Tabelle 1. Sterile Filter Assay Lösung unter Verwendung eines 0,22 um-Filter. Vor Beginn testen, warm die sterile Testlösung in einer 28,5 ○ CWasserbad. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Bestandteil </td><td> % Der Gesamt </td><td> Volumen (ul / 10 ml) </td></tr><tr><td> 60x E3 Embryo Medium </td><td> 1,667 </td><td> 166,7 </td></tr><tr><td> Doppel deionisiertem (DDI) H 2 0 </td><td> 96,233 </td><td> 9.623,3 </td></tr><tr><td> Alamar-Blau- </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 mM NaOH </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0.1 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Assay-Medium 3. Führen Assay <ol><li> Spülen Zebrafischembryonen 3 mal mit steril filtriert E3 Embryo Medium. Kombinieren Sie alle lebensfähigen Zebrafischembryonen von der Kupplung in ein Becherglas. Sterilfilter 75 ml E3 Embryo Medium. Mit einer feinen Spitze Einweg-Transferpipette, rebewegen, wie viel von der E3 Embryo Medium aus den Zebrafischembryonen wie möglich. 20 ml steril filtriert E3 Embryo Medium Rücken. Entfernen und 3 mal ersetzen E3 Embryo Medium. </li><li> Fischplatte 1 in jede der 93 Vertiefungen einer 96-Loch schwarz Seitige durchsichtigen Bodenplatte. Übertragen Sie die embryonale Fisch auf den Teller durch individuelles Einfangen eines Embryos in eine Flamme poliert absolvierte Kunststoff-Einweg-Transferpipette (Schritt 1.5) und sanft Auswerfen in den Brunnen. Bringen E3 Embryo Medium aus dem Becherglas gespült Fisch in den 3 leeren Brunnen entnommen. Dies stellt sicher, dass leere Brunnen wurden auf die gleiche Wasser wie die Brunnen, die Fisch enthalten ausgesetzt. Beide Brunnen, die Fisch und leere Brunnen enthalten sollte mindestens ½ volle (200 ul) auf den Abschluss dieser Schritt sein. </li><li> Ersetzen E3 Embryo Medium mit Assay-Lösung in allen 96 Wells, einschließlich leere Brunnen. Dieser Schritt sollte 1 Spalte zu einer Zeit für jede der 12 Spalten in einer 96-Well-Platte durchgeführt werden. Mit einer feinen Spitze Einweg-transfer Pipette entfernen E3 Embryo Medium aus jeder auch in einer Spalte der Platte (8 Kavitäten). Achten Sie auf die Zebrafischembryo nicht berühren. Werden 300 &amp; mgr; l Assay-Lösung zu jeder Vertiefung, aus dem Wasser entfernt wurde. Wiederholen die Entfernung von E3 Embryo Mediums und Ersatz mit Assaylösung für alle 12 Spalten der Platte. </li><li> Optional: Um die metabolische Rate Änderung in Reaktion auf eine Testverbindung, stellen eine Lösung, die 100-mal (100X) die gewünschte Behandlungskonzentration ist. Zu beachten ist, sicherzustellen, dass die Lösung 100x 10% DMSO nicht überschreiten, um die endgültige DMSO-Konzentration auf nicht mehr als 0,1% zu begrenzen. Werden 3 ul des 100-fach-Lösung in jede der Behandlungs Vertiefungen. HINWEIS: Führen Sie Leistungsberechnungen, die Zahl der Behandlungs Brunnen zu bewerten. Jedoch ohne eine Schätzung der Grße der Reaktion oder einer Variation, einem Vorversuch kann in 8 Verbindung behandelten und 8 mit Vehikel behandelten Kontrollvertiefungen, die Fische enthalten ausgeführt werden. <ol><li> In 3 ul Fahrzeugkontrolle, die Kontrolle (keine drug Behandlung) Brunnen, die Fisch enthalten. Um sicherzustellen, dass das fluoreszierende Reaktion auf Verbindung ist ein Ergebnis der Maßnahmen, die im Fisch, gelten Drogen-und Fahrzeuganwendungen bis 3 leere Wells in einer Platte mit 96 Vertiefungen. </li></ol></li><li> Lesen Fischen gefüllt Platte auf Fluoreszenzplattenlesegerät mit Anregungswellenlänge bei 530 nm und die Emissionswellenlänge bei 590 nm. </li><li> Platz Platte in befeuchteten Inkubator auf 28,5 ○ C (halten Platte in der Dunkelheit über sie Assay zur Photobleichen der Testlösung zu vermeiden) eingestellt. Der Test kann für die Dauer der Zeit, die von 1 Stunde bis 24 Stunden reichen ausgeführt werden. Die Dauer des Tests hängt von der Zielsetzung der Studie. Zum Testen der Reaktion auf eine kurzwirksamen nicht stabile Verbindung eine kurze Dauer kann am besten geeignet. Doch die Maximierung Assay Dauer für eine stabile Verbindung, Tests oder Prüfungen der genetische Effekte, vorzuziehen, die Vorteile mit der Summensignal zugeordnet zu nutzen. </li><li> Zu einem vorbestimmten Zeitpunkt (siehe Schritt 3.6, um festzustellen Timing)Lesen Fluoreszenz des fischreichen Platte wieder mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 3.5. </li></ol> 4. Bewerten Sie die relative Veränderung der Fluoreszenz Verbunden mit Treatment <ol><li> Änderung in der Fluoreszenz von jeder Berechnung auch durch Subtrahieren der Fluoreszenz zum Zeitpunkt 0 von der Fluoreszenz am Ende der Studie. Wells ohne Fisch (Rohlinge) sollten Werte nahe 0 haben, weit unter Werte von Brunnen, die Fisch enthalten. Veränderung der Fluoreszenz = Fluorescence am Schluss - Fluoreszenz zum Zeitpunkt 0 </li><li> Um die relative Veränderung der Fluoreszenz zu ermitteln, berechnen die durchschnittliche Veränderung der Fluoreszenz für die Kontrollvertiefungen dann teilen die Veränderung der Fluoreszenz jedes vom durchschnittlichen Veränderung der Fluoreszenz der Kontrollvertiefungen. Zu beachten ist, könnte Kontrollen entweder Fahrzeugsteuerungen oder genetische Kontrolle zu sein. <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" /></li></ol>

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	<li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system.">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> PNAS. 110, 13904-13909 (2013).</li><li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter/driver+genes+by+CRISPR/Cas9-mediated+genome+engineering.">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Sci. Rep. 4, 6545 (2014).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+obesogenic+test:+a+tool+for+screening+molecules+that+target+adiposity.">Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity.</a> J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

Kontamination mit Bakterien oder Pilzen stark begrenzen Anwendung dieses Assays. Methylenblau in der E3-Embryomedium begrenzt die Möglichkeit einer Kontamination mit Pilzen. Im gesamten Embryo Aufzucht es wichtig, dass darauf geachtet wird, tote Embryonen zu entfernen zweimal täglich ist. Zusätzlich ist es wichtig, die Embryos mit sterilem E3 Embryo Medium gründlich am Tag Assayinitierungsbereich. Diese 2 Schritte begrenzen das Potenzial für bakterielle Kontamination der Embryonen. Die Einbeziehung der in Schritt 3...

Die Maus ist derzeit das vorherrschende Modell für Adipositas-Forschung. Die kurze Generationsintervall und genetischer Werkzeuge zur Verfügung, in der Maus wurden unerreicht auf dem Laufenden. Allerdings hat der Zebrafisch auch eine kurze Generationsintervall (3-4 Monate) und übertrifft sogar die Maus in eine einfache genetische Manipulation 1,2. Der Zebrafisch unterhält fast 90% der Säugetiergenen, während Sie die Maus weit über der Zahl der Nachkommen und das Potenzial für den Einsatz in genetischen und Drogen-Bildschirme 3. Um das Potenzial des Zebrafisch-Modell für Studien der Fettleibigkeit zu erschließen, müssen Tests entwickelt werden, um Faktoren, die Gewichtsregulation, einschließlich Energieverbrauch beeinflussen zu untersuchen. Als Metaboliten werden durch β-Oxidation und Tricarbonsäurezyklus Sauerstoff verarbeitet verbraucht und NADH 2 wird erzeugt. Somit NADH 2 ist ein direkter Indikator des Flusses von Metaboliten durch Stoffwechselwege (Metabolit Oxidation). In poikilotherms, H + Leck durch die innere Mitochondrienmembran, die NADH 2 -Oxidation entkoppelt von der ATP-Synthese ist 4-5-fach geringer als bei Warmblütern 4. Dementsprechend wird in Zebrafisch NADH 2 sehr fest an die ATP-Produktion durch oxidative Phosphorylierung verknüpft. Hier beschreiben wir einen Test, der NADH 2 Produktion misst in Larven Zebrafisch als Proxy für den Energieverbrauch 5. Der Sauerstoffverbrauch ist der Goldstandard zur Messung der Energieaufwand. Doch am besten nutzen Sie die Hochdurchsatz-Potenzial des Zebrafisch-Assays des Energieverbrauchs muss zugänglich für Hochdurchsatz sein. Sauerstoffverbrauch Systeme, die auf einer geschlossenen Kammer Umlaufsystem abhängt, werden im Durchsatz durch die Anzahl von Kammern vorhanden 6 begrenzt. Open-Air-O 2 Verbrauch / CO 2 -Produktion Assays wurden ebenfalls in der Zebrafisch 5,7 angewandt. Diese Open-Air-Platte mit 96 Vertiefungen BasisD Systems zugänglich sind hohem Durchsatz. Leider Gasaustausch mit der Umgebung begrenzt Empfindlichkeit dieser Assays. Wir haben vor kurzem veröffentlicht die Anwendung eines Assays, die NADH 2 Monitore mit dem Redoxindikator alamarBlue 5. Dieser Test überwindet die Beschränkungen in Durchsatz und Empfindlichkeit gemeinsam Analysen der Sauerstoffverbrauch in der Zebrafisch. Der Zebrafisch ist ein zunehmend wichtiges Modell für die Untersuchung der ganze Körper Energie-Homöostase. Zum Teil, weil Zebrafisch zugänglich sind in den zukunfts genetischen Screens und Drogen-Bildschirme verwenden. Darüber hinaus gezielte genetische Manipulation, einschließlich Zuschlags und Knock-in, kann schnell angewendet werden. Wir haben bereits gezeigt, dass dieser Test kann mit Badewanne Medikamentenapplikation und der genetischen Zuschlags oder KO kombiniert werden, um Verbindungen und Gene, die Stoffwechselrate zu ändern 5 zu identifizieren. Außerdem ist dieser Test für die hohen Durchsatzvorteile inhärent Zebrabärbling auszunutzen. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-230-103</td><td>Manufactured by Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fine Tip DisposableTransfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-26</td><td>Manufactured by Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-771-9AM</td><td>Manufactured by Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Black sided clear bottom 96-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-320-785</td><td>Manufactured by E&amp;amp;K Scientific Products Inc.</td></tr></tbody></table>

high throughput danio rerio energy expenditure assay

Zebrafische sind ein wichtiger Modellorganismus mit inhärenten Vorteile, die das Potenzial Zebrafisch ein weithin angewandt Modell für die Untersuchung der Energie-Homöostase und Übergewicht zu machen. Die geringe Größe der Zebrafisch ermöglicht Tests an Embryonen in einem 96 oder 384 Well-Plattenformat durchgeführt werden, Morpholino und CRISPR basierte Technologien zu fördern einfache genetische Manipulation, und medikamentöse Behandlung von Badanwendung lebensfähig ist. Darüber hinaus sind Zebrafisch ideal für zukunfts genetischen Screens so dass für neues Gen Entdeckung. Angesichts der relativen Neuheit der Zebrafisch als Modell für Übergewicht, ist es notwendig, Werkzeuge, die diese Vorteile voll ausschöpfen zu entwickeln. Hier beschreiben wir eine Methode, um den Energieverbrauch in Tausenden von embryonalen Zebrafisch gleichzeitig zu messen. Wir haben eine ganze Tiermikroplattform, in der wir Platten mit 96 Vertiefungen zu einzelnen Fische zu isolieren entwickelt und wir beurteilen kumulative NADH 2-Produktion unter Verwendung des im Handel erhältlichen Zellkulturfähigkeit reMittel alamarBlue. In poikilotherms die Beziehung zwischen NADH 2 Produktion und Energieverbrauch ist eng verknüpft. Dieser Energieverbrauch Test schafft das Potenzial, sich rasch zu screenen pharmakologische oder genetische Manipulationen, die den Energieverbrauch direkt zu ändern oder ändern Sie die Reaktion auf eine angelegte Drogen (zB Insulin-Sensitizer).

Assay-Lösung nicht-Fluoreszenz in Abwesenheit von embryonalen Fisch (1) zu erhöhen. Jedoch ist der Test sehr empfindlich auf kleine Änderungen der Stoffwechselrate im Bohrloch. Eine einzelne Fische innerhalb einer gut schafft ein Signal deutlich von leeren Brunnen innerhalb 1 Stunde (P &lt;0,0001). Abbildung 2 bietet eine visuelle Darstellung der Signale, die von embryonalen Fische nach 24 Stunden Inkubation erzeugt. Für die Zwecke dieses Bildes klar seitige Vertiefungen wurden verw...

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High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Hochdurchsatz-<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energieumsatz-Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

12.6K Aufrufe.  Vanderbilt University Medical Center. Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery. 

Serie: High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

Fettreiche Ernährung Fütterung und Hochdurchsatz Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Forschung

Genetik

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Verhalten

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental factors, and the toxicological and pharmacological effects of numerous substances. Few methods currently implemented are amenable to high throughput measurement. The Microplate Feeder Assay (MFA) was developed for quantifying the consumption of liquid food for individual flies using absorbance. In this assay, flies consume liquid food medium from select wells of a 1536-well microplate. By incorporating a dilute tracer dye into the liquid food medium and loading a known volume into each well, absorbance measurements of the well acquired before and after consumption reflect the resulting change in volume (i.e., volume consumed). To enable high throughput analysis with this method, a 3D-printed coupler was designed that allows flies to be sorted individually into 96-well microplates. This device precisely orients 96- and 1536-well microplates to give each fly access to up to 4 wells for consumption, thus enabling food preference quantification in addition to regular consumption. Furthermore, the device has barrier strips that toggle between open and closed positions to allow for controlled containment and release of a column of samples at a time. This method enables high throughput measurements of consumption of aqueous solutions by many flies simultaneously. It also has the potential to be adapted to other insects and to screen consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals.

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

The microplate feeder assay offers an economical, high throughput method for quantifying liquid food consumption in Drosophila. A 3D-printed device connects a 96-well microplate in which flies are housed to a 1536-well microplate from which flies consume a feeding solution with a tracer dye. The solution volume decline is measured spectrophotometrically.

Ein Hochdurchsatz-Mikroplatten-Feeder-Assay zur Quantifizierung des Verbrauchs in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

Hochdurchsatz-Assay zur Messung der Nahrungsaufnahme und Lebensdauer von Caenorhabditis elegans

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of Caenorhabditis elegans&#160;(C. elegans), an important parameter when studying the genetics of aging or metabolism. In most species, feeding is determined by measuring the difference between the amount of food provided and the amount left after a given time interval. The method presented here uses the same strategy to determine the feeding of C. elegans. It measures the amount of bacteria, the food source of C. elegans, cleared within 72 h. This method uses 96-well microtiter plates and has allowed the screening of hundreds of drugs for their ability to modulate food intake at a speed and depth not possible in other animal models. The strength of this assay is that it allows to measure feeding and lifespan simultaneously and directly measures the disappearance of food and, thus, is based on the same principles used for other organisms, facilitating species-to-species comparison.

Autor im Rampenlicht: Erforschung des Zusammenhangs zwischen Lipotoxizität und HFpEF 

This protocol describes an assay to quantify Caenorhabditis elegans feeding rate based on measuring the clearance of bacteria in liquid culture.

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Assay mit hohem Durchsatz Eiablage Präferenzen der einzelnen zu untersuchen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Neurowissenschaften

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate their food environment. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a genetically tractable model organism that is widely used to decipher the molecular, cellular, and neural underpinnings of food preference. To analyze fly food preference, a robust feeding method is needed. Described here is a two-choice feeding assay, which is rigorous, cost-saving, and fast. The assay is Petri-dish-based and involves the addition of two different foods supplemented with blue or red dye to the two halves of the dish. Then, ~70 prestarved, 2-4-day-old flies are placed in the dish and&#160;allowed to choose between blue and red foods in the dark for about 90 min. Examination of the abdomen of each fly is followed by the calculation of the preference index. In contrast to multiwell plates, each Petri dish takes only ~20 s to fill and saves time and effort. This feeding assay can be employed to quickly determine whether flies like or dislike a particular food.

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

We present a protocol for a two-choice feeding assay for flies. This feeding assay is fast and easy to run and is suitable not only for small-scale laboratory research, but also for high-throughput behavioral screens in flies.

Ein schneller Food-Preference-Test in Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Hochdurchsatz-

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Fettreiche Ernährung Fütterung und Hochdurchsatz Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

Ein Hochdurchsatz-Mikroplatten-Feeder-Assay zur Quantifizierung des Verbrauchs in Drosophila

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Assay mit hohem Durchsatz Eiablage Präferenzen der einzelnen zu untersuchen

Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn

Ein schneller Food-Preference-Test in Drosophila

Messung der Stoffwechselrate in