Name: nephrotoxin microinjection in zebrafish to model acute kidney injury
Uploaded: 2016-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
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Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH Zuschusses DP2OD008470 unterstützt. Zusätzlich RAM wurde von Fonds, die von der University of Notre Dame Graduate School zur Verfügung gestellt teilweise unterstützt. Wir danken den Mitarbeiter der Abteilung für Biologische Wissenschaften, das Zentrum für Zebrabärblinge Forschung, und das Zentrum für Stammzellen und regenerative Medizin an der University of Notre Dame. Wir danken vor allem den Mitgliedern des Labor für Diskussionen über Nieren Biologie und ihre hilfreichen Feedback zu dieser Arbeit engagieren.

Die Verfahren für die Arbeit mit Genaktivität in diesem Protokoll beschrieben wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of Notre Dame genehmigt. 1. Herstellung der Lösungen <ol><li> Machen Sie eine 50x Stammlösung von E3 Embryo Medium durch Mischen von 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl, 9,15 g CaCl 2 und 9,95 g MgSO 4 in 5 l destilliertem Wasser, und lagern bei RT. </li><li> Für die Kultivierung von Genaktivität verdünnen 50x Stammlösung von E3 Embryo Medium Lager auf eine 1x-Arbeitslösung mit destilliertem Wasser, dann 200 ul 0,05% Methylenblau zu je 1 Liter 1x E3 hinzufügen als Fungizid zu handeln, und an einem RT. </li><li> Machen Sie eine Pigmentierung Blocking-Lösung von E3 Embryo Medium mit 0,003% 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) von 40 ml des 50x E3 Lager kombiniert mit 0,06 mg PTU. Dann bringen Sie die Lautstärke auf insgesamt 2 l mit destilliertem Wasser. </li><li> Rühren Sie die E3 / PTU O / N bei RT die PTU Pulver in Lösung zu erhalten. Dann speichern Sie die E3 / PTU beiRT. Hinweis: Die E3 / PTU eine Lagerbeständigkeit von etwa einer Woche hat und ältere Lösungen werden weniger effektiv bei der Pigmentierung Entwicklung in Zebrabärbling Larven blockieren. </li><li> Machen Sie eine Anästhesielösung von 0,2% Tricaine (MS-222) durch Zugabe von 1 g Tricaine zu 500 ml destilliertem Wasser und der pH-Wert auf 7,2 mit 1 M Tris, pH-Wert 9,5. </li><li> Bereiten einer 2% igen Methylcelluloselösung für die Bildgebung zu machen , indem eine Lösung von 1x E3 (kein Methylenblau) platzieren, mit 1/10 Volumen von 0,2% Tricaine bei 4 ° C zugegeben. Hinweis: Die Methylcellulose-Lösung eine dicke, klare Lösung ist, die sanft verwendet wird, um Live-Embryonen für die Mikroskopie stabilisieren. Nach Manipulationen die Embryonen durchgeführt werden, können in 1x E3 gewaschen werden, um die Methyl aufzulösen, ohne das Tier zu verletzen und bei den nachfolgenden Stufen in der gleichen Probe ermöglicht Mikroskopie. </li><li> Wenn auf 4 ° C abgekühlt, rühren Sie die 1x E3 / Tricaine Lösung kräftig auf einer Rührplatte und nach und nach die entsprechende Menge an Methyl hinzufügenCellulosepulver während sie weiterhin kräftig zu rühren. Nach und nach das Pulver zu der Lösung, um die Bildung von unlöslichen Methyl Aggregate zu verhindern. </li><li> Nachdem das gesamte Pulver in die 2% Methylcellulose / E3 / Tricaine Lösung gemischt wird, rühren Sie die Verbundlösung im 4 ° C kalten Raum O / N. Hinweis: Die kalte Temperatur für voll am besten ist es, das Pulver zu lösen. Wenn die Lösung nicht klar nach einer Nacht ist, rühren Sie für einen zusätzlichen Arbeitstag und / oder einem zweiten O / N. </li><li> Um Luftblasen aus der 2% Methylcellulose / E3 / Tricaine Lösung Aliquot der Mischung in 1,5 ml Röhrchen und drehen mit hoher Geschwindigkeit (12,000 × g) bei 4 ° C für 30 min oder bis zu 2 Stunden zu entfernen. </li><li> Legen Sie die 2% Methylcellulose / E3 / Tricaine Lösung bei 4 ° C für die Langzeitlagerung. Hinweis: Vor der Verwendung sollten Aliquots für die Arbeit mit den Zebrabärbling Proben auf RT vorgewärmt werden. </li></ol> 2. Herstellung von Werkzeugen <ol><li> Bereiten Sie ein Embryo Manipulatorwerkzeug, für po verwendetsitionsang Embryonen für die Mikroinjektion, durch eine Gel-Beladungsspitze am Ende einer 5 &quot;gerade Seziernadel Befestigung und Sicherung mit Klebeband oder superglue. </li><li> Bereiten Mikroinjektionsnadeln mit einer Nadel Abzieher, indem man zuerst ein Feuer platzieren poliert 10 cm Borosilikatglas mit Filament in das Gerät und sichern Sie das Borosilicatglas durch die Griffe festziehen. </li><li> Ziehen Sie das Borosilicatglas fein verjüngte Nadeln zu gestalten. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Wärme 540, ziehen 245, Geschwindigkeit 200 und Zeit 125. </li><li> Platz Nadeln in einer Petrischale, so dass sie auf einem Streifen aus Knetmasse Aussetzung der Nadelspitzen zu schützen, und halten Sie die Schale bedeckt Staubansammlung zu verhindern. </li><li> Vorbereitung der Nadel für Mikroinjektionen zu beenden, mit einer Rasierklinge oder einer feinen Pinzette Kante verwenden die gezogener Ende der Nadel zu schneiden eine scharfe Winkelinjektionsspitze mit einem Durchmesser von etwa 0,05 bis 0,1 mm zu schaffen. </li><li> Um die Mikroinjektions Tablett machen, bereiten Sie einen 1,5% igen / E3-Lösung in einem 100 ml Erlenmeyerkolben und die Agarose aufzulösen, indem der E3 zum Kochen in der Mikrowelle erhitzt dann erlauben bei RT für etwa 10 Minuten abkühlen lassen. </li><li> Gießen Sie die gekühlte Agarose / E3-Lösung in eine Petrischale ein Fundament mit einer Tiefe von etwa 0,5 cm zu machen. Wenn diese erstarrt ist mit einer Tiefe von etwa 0,3 cm eine zweite Schicht gießen und das vorgefertigte Embryo gut Formeinsatz und lassen Sie die Agarose bei RT zu verfestigen. Hinweis: Beim Einsetzen der Form in die Top-Agar / E3-Schicht in einem Winkel um die Form in den Agar Anordnen der Anzahl von Luftblasen zu verringern. </li><li> Wenn die gesamte Mikroinjektions Tablett gesetzt hat, heben auch die vorgefertigte Embryo langsam formen und vorsichtig mit einem Spatel verwenden, dann füllen die Schale mit E3-Lösung und lagern bei 4 ° C. </li></ol> 3. Embryo Vorbereitung <ol><li> Richten Sie Zebrabärbling Paarungs Tanks durch Trennwände in entsprechende Kammern und füllen mit System Wasser kommen. </li><li> Setzen Sie einen Fisch auf jeder Seite des Teilers such, dass jede Gegenkammer enthält eine weibliche und eine männliche Fische und decken jede Paarung Kammer. </li><li> Am nächsten Morgen, entfernen Sie die Teiler Laich zu ermöglichen. </li><li> Überprüfen Sie den Fisch nach ca. 30 min, und nach der Erwachsenen in das Aquarium zurückkehrt, sammeln ihre Embryonen, die durch den Gegentankwasser durch ein feines Drahtgitter Sieb Werkzeug vorbei. </li><li> Kehren Sie die Sieb über einer Petrischale und spülen mit E3 die Embryonen zu sammeln. </li><li> Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 ° CO / N. </li><li> Wenn die Embryonen 24-26 Somitenstufe 26 erreicht haben, dekantiert die meisten der E3 Medien und dann dechorionate von 100 ul 50 mg Addier / ml Pronase zu jeder Schale von Embryonen und die Schale bei RT (23 ° C) Inkubieren für ungefähr 15 Minute Hinweis: Es dauert etwa 24-25 Stunden ab dem Zeitpunkt der Befruchtung für die Embryonen, die 24-26 Somiten Stadium zu erreichen, wenn sie gesammelt werden in der beschriebenen Art und Weise und inkubiert O / N bei 28,5 ° C. </li><li> Füllen Sie die Schale mitE3 und schwenken dann sanft die Chorion aus den Embryonen zu entfernen. </li><li> Dekantiert die E3 / Pronase und spülen Sie die Schale mit 25 ml frischem E3. Wiederholen Sie Spülschritt alle Pronase zu entfernen. </li><li> So blockieren die Entwicklung der Pigmentierung, dekantiert die E3 und ersetzen mit 25 ml frischem E3 / PTU, wenn die Embryonen 24 Stunden nach der Befruchtung erreicht. Hinweis: Für Experimente mehrere Tage Spanning, sobald die E3 / PTU Lösung durch frische Medien ersetzt werden täglich die Schale sauber zu halten. </li></ol> 4. Mikroinjektion von Nephrotoxin Lösung <ol><li> Am Tag der Injektion, bereiten Sie die gewünschte Nephrotoxin Lösung zusammen mit der entsprechenden Fahrzeugsteuerung. </li><li> Vortex oder vorsichtig mischen das Medikament (e), um sicherzustellen, ist / sind in der Lösung, die Seiten der Röhre und die Oberseite der Wassersäule zu überprüfen. Hinweis: Nephrotoxin Lösungen hergestellt werden können, um Spurenmengen von fluoreszenz konjugierten Dextran enthalten Mikroinjektionseffizienz zu überwachen und auch die renale Clearance bei SUBSEQ beurteilenießend Zeitpunkten 20,28. </li><li> Legen Sie eine getrimmten Mikroinjektionsnadel mit ~ 2-3 ul der Nephrotoxin durch eine feine Gel-Beladungsspitze in die Rückseite des Einfädeln und suspendieren die Nadel vertikal mit einem Stück Klebeband die Lösung zu ermöglichen, um das zugeschnittene Nadelspitze durch die Schwerkraft zu füllen. </li><li> Sobald die Nadelspitze voll ist, sichern die geladene Nadel in den Mikromanipulator. </li><li> Testen des Mikroinjektionsvolumen um einen Tropfen Mineralöl auf eine Mikrometer-Objektträger platziert und Injizieren in das Öl um die Tröpfchengröße zu bewerten. Einem Injektionsvolumen von 500 pl hat einen Durchmesser von 0,1 mm. </li><li> Entfernen Sie die Schale von Embryonen aus dem Inkubator und betäuben durch Zugabe von etwa 5 ml 0,2% Tricaine zum Embryo Gericht. </li><li> Um eine vollständige Betäubung gewährleisten, sanft berühren Embryo mit der Spitze des Embryos Manipulatorwerkzeug. Der Mangel an Bewegung gibt ausreichend anesthetization. </li><li> Nach dem erfolgreichen anesthetization, übertragen Embryonen in die Spritzgießform mit einem transfer Pipette. </li><li> Manövrieren Sie jeden Embryo in eine andere Vertiefung der Form, um den Kopf in den tiefsten Bereich des Bohrlochs so platzieren, dass der Stamm entlang der Vertiefung ruht und der Schwanz ragt aus der Depression auf. </li><li> Legen Sie die gefüllte Nadel in den Mikromanipulator und die Position der Nadelspitze neben einem Embryo. </li><li> Führen Sie vorsichtig die Nadel in den Schwanz Schiff durch den Joystick nach vorne und drücken Sie den Fußschalter Bewegen des Mikroinjektions zu liefern. Hinweis: Eine erfolgreiche Injektion kann durch die Beobachtung der Flüssigkeitskreislauf gelangen gemessen werden. Ferner ermöglicht Koinjektion des nephrotoxicant mit fluoreszenz konjugiertes Dextran den Forscher erfolgreiche Injektion im Anschluss an das Verfahren zu überprüfen. </li><li> Ziehen Sie vorsichtig auf dem Joystick zurück, um die Nadel aus dem Embryo zu entfernen. </li><li> Nach der Injektion übertragen Sie die Embryonen in eine saubere Schüssel und spülen Sie die Tricaine und ersetzen mit frischen E3 / PTU zu entfernen. </li><li> Inkubieren des Embryos auf den gewünschten Zeitpunkt zu Eselns Morphologie, die durch die Fotografie in Methylmontage Medien oder Verfahren zur experimentellen Analyse dokumentiert werden kann, wie gewünscht. Hinweis: Erholung von Embryonen beurteilt werden sollte der Anteil der Personen mit Ödemen, um zu bestimmen, die Nierenschädigung zeigt häufig. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Eine vielfältige Anzahl von therapeutischen Wirkstoffen wurden mit AKI 29 verbunden. Es wurden von vielen einzelnen Verbindungen, wie das Aminoglycosid Gentamicin 30 und dem weit verbreiteten chemotherapeutischen Cisplatin induzierte Schäden beim Verständnis 31,32 signifikante Fortschritte in der Forschung gewesen. Einige pathologische Veränderungen dieser Bedingungen beteiligt sind, bleiben jedoch Gegenstand der laufenden Studie. Ein entstehender Herausforderung bleibt das Verständ...

AKI ist ein abrupter Verlust der Nierenfunktion , die 1 bis verheerenden gesundheitlichen Folgen führen kann. AKI ist ein bedeutendes Gesundheits Problem weltweit aufgrund seiner hohen Inzidenz von etwa 20% bei Patienten im Krankenhaus, mit noch höheren Raten von 30-50% in kritischen Pflegefälle und ältere Menschen, und die Sterblichkeitsrate von 50-70% 1-3. Leider hat sich die Prävalenz von AKI zugenommen und wird voraussichtlich weiter über die nächsten zehn Jahre zu eskalieren, zum Teil aufgrund der Vielfalt der Faktoren, die AKI auslösen können, zu denen die postoperative Belastung, Ischämie und Exposition gegenüber Nephrotoxinen wie Antibiotika und chemotherapeutischen Arzneimitteln 4. AKI beinhaltet plötzliche Zellschäden in der Niere, die gemeinhin in Nephronen auftretenden, die die wesentlichen Funktionseinheiten sind, und aus einem Blutfilter und einer segmentierten tubule umfasst , die Urin in den zentralen Sammelrohre 1 entwässert. Wenn eine erhebliche Anzahl von Nephronen sindwährend AKI beschädigt, sind die unmittelbaren Auswirkungen einer Unterbrechung in der Abfall Clearance aus dem Kreislauf und reduziert oder außer Kraft gesetzt Fluidstrom durch Nephronen durch Obstruktion von toten und sterbenden Zellen 1. Im Laufe der Zeit können Rohr Behinderung zu einer Degeneration des gesamten Nephronen führen, die 1 Nierenfunktion reduziert dauerhaft. Physiologische Veränderungen in der Niere folgenden AKI beinhalten auch komplexe entzündliche Ereignisse , die zu chronischen Vernarbung 1 führen kann. Trotz dieser Ergebnisse haben Nephronen gewisse Fähigkeit Regeneration nach AKI zu unterziehen, die die Tubulusepithel 5,6 rekonstituiert. Zwar gibt es eine wachsende molekulare Verständnis von nephron Regeneration gewesen ist, bleiben die Mechanismen schwer in vielerlei Hinsicht und erforderlich machen Untersuchung 7 fortgesetzt. Das Ausmaß, in dem AKI führt zu einer dauerhaften Nierenschädigung bleibt ebenfalls unbekannt. Die aktuelle Forschung deutet darauf hin, das regenerative Potenzial für die Niere ist diehöchste folgenden weniger schwere Fälle von AKI, während ausgeprägter oder wiederholte Episoden zu einer chronischen Nierenerkrankung (CKD) führen und in Nierenerkrankung im Endstadium (ESRD) , die lebensrettende Transplantation oder Dialyse erfordert 8,9 gipfeln. Darüber hinaus Personen , die bereits von CKD leiden , sind zu einem noch höheren Risiko von 8,9 eine schwere Folge von AKI Vertrags. Zusammengenommen ist es klar, dass die weitere Grundlagen- und klinische Forschung zu verstehen, von entscheidender Bedeutung ist, zu behandeln und AKI verhindern. Forschung mit Tiermodellen hat in Würdigung der Progression der lokalen und ökologischen Veränderungen beigetragen , die während der AKI 10 auftreten. Um dieses Verständnis zu erweitern sowie die Entwicklung neuer Therapien, die Zebrabärbling Tiermodell wurde in einer Vielzahl von Möglichkeiten 11,12 eingesetzt. Die Nephronen der Zebrabärbling Niere, sowohl im Embryo und Erwachsenen zeigen einen hohen Grad an Konservierung bei Säugetieren 13-16. Ferner nephron epithelialen Verletzungen in zeFisch - ähnelt dem Prozess bei höheren Wirbeltieren, wobei die lokale Zerstörung von röhrenförmigen Zellen durch intratubulären Proliferation und Wiederherstellung der nephron Architektur 17-19 folgt. Im Embryo ist jedoch umfangreiche Röhrchens Schaden von den Nephrotoxinen wie Cisplatin im Zusammenhang mit Letalität 20,21. Zum Vergleich: überleben Zebrabärbling Erwachsene AKI und zeigen materielle regenerative Fähigkeiten in der Niere. Zum Beispiel, um das Aminoglykosid - Antibiotikum Gentamicin nach der Exposition, Zebrabärbling Röhrchens Epithelschädigung regenerieren und neue Nephron - Einheiten sowie 22-24 wachsen. Während diese Gentamicin-induzierten AKI Studien wertvolle Informationen zur Verfügung gestellt haben, Nierenschäden aus verschiedenen Nephrotoxinen Verständnis bleibt entscheidend , um die Auswirkungen und die Reaktion auf verschiedene Arten von Schäden 25 zu schätzen. Der Zebrafischembryo, aufgrund seiner Größe, Transparenz und genetische Lenkbarkeit, hat viele Vorteile für Nephrotoxin Studien &lt;sup&gt; 25, wobei das Verfahren der Mikroinjektion 20,21 verwendet, um das Molekül (e) für die Untersuchung zu verabreichen. Nephron werden von 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) und beginnen zu filtern Blut von etwa 48 HPF 26,27 gebildet. Somit erleichtert die schnelle Bildung und Funktion der embryonalen Nieren experimentellen Analyse. Allerdings hat der Prozess der Mikroinjektions technischen Herausforderungen, und es kann eine steile Lernkurve zu Beherrschung der Technik sein. In diesem Video-Artikel beschreiben wir, wie Mikroinjektionen durchführen und Tipps zur Fehlerbehebung, um die Rate der erfolgreichen Injektionen bieten zu verbessern.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00366</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;(microinjection tray) 150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Low Temperature Incubator</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Tweezer</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>Micrometer</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>2280-24</td><td></td></tr></tbody></table>

nephrotoxin microinjection in zebrafish to model acute kidney injury

Die Nieren sind anfällig von der Exposition zu schädigen zu Chemikalien, die sie aus dem Blut zu filtern. Dies kann mit einem raschen Rückgang der Nierenfunktion und die Entwicklung des klinischen Syndrom bekannt als akute Nierenschädigung (AKI) in Verbindung zu Organschäden führen. Pharmakologischer Mittel verwendet, um medizinische Bedingungen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen zu Krebs reichen, wenn sie einzeln verabreicht werden oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen, kann AKI initiieren. Zebrabärbling sind ein nützliches Tiermodell die chemischen Wirkungen auf die Nierenfunktion in vivo zu untersuchen, da sie eine embryonale Niere Nephron Funktionseinheiten besteht bilden , die mit höheren Vertebraten konserviert sind, einschließlich Menschen. Ferner kann Zebrabärbling genetische und chemische Bildschirme auszuführen verwendet werden, die Möglichkeiten bieten, um die zellulären und molekularen Facetten AKI aufzuklären und therapeutischen Strategien wie die Identifizierung von Molekülen nephroprotektive entwickeln. Hier zeigen wir, wie die Mikroinjektion in dieZebrafischembryo kann als Paradigma für Nephrotoxin Studien genutzt werden.

Ein Mikroinjektionsstation eingerichtet umfasst eine Stereo, Mikromanipulator und Druckregler (1A). Durchleuchtung der Einspritzplatte ist bevorzugt , Proben während dieses Verfahrens (1B) anzuzeigen. Herstellung der Injektionsnadel umfasst das Ziehen des entsprechenden Borsilikatglas, gefolgt von der Kante der Vorbereitung mit Schneiden und schließlich die Nadel Backloading. Optimalerweise wird die Nadelspitze abgeschrägt anstatt stumpf (1C),...

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Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Renal Verletzungen von Nephrotoxinen entstehen, die Medikamente im Bereich von Antibiotika zu Chemotherapeutika gehören, können in komplexen Erkrankungen, deren Pathogenese zur Folge bleibt unvollständig verstanden. Dieses Protokoll zeigt, wie Zebrabärbling für Krankheitsmodelle dieser Bedingungen verwendet werden, die zur Identifizierung von renoprotektive Maßnahmen angewendet werden können.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

nephrotoxin-microinjection-in-zebrafish-to-model-acute-kidney-injury

Research

JoVE Journal

Biology

8.8K Aufrufe.  University of Notre Dame.  Renal Verletzungen von Nephrotoxinen entstehen, die Medikamente im Bereich von Antibiotika zu Chemotherapeutika gehören, können in komplexen Erkrankungen, deren Pathogenese zur Folge bleibt unvollständig verstanden. Dieses Protokoll zeigt, wie Zebrabärbling für Krankheitsmodelle dieser Bedingungen verwendet werden, die zur Identifizierung von renoprotektive Maßnahmen angewendet werden können. 

Serie: Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Die Transplantation von Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafisch

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biologie

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Testen der physiologische Barrieren für die virale Transmission in Blattläuse mit Mikroinjektion

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Präziser zellulärer Ablationsansatz zur Modellierung akuter Nierenverletzungen bei der Entwicklung von Zebrafisch

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Intravenöse Mikroinjektionen mit Zebrabärblingembryonen zu Acute Kidney Injury Study

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Laser Ablation des Zebrafisch Vorniere auf Study Renal Epithelregeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analyse der Nephron Zusammensetzung und Funktion im erwachsenen Zebrafisch Nieren

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Akute Nierenverletzung Modell induziert durch Cisplatin bei erwachsenen Zebrafischen

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Medizin

Intravenous Microinjection of Nephrotoxins into Zebrafish Embryo: A Technique to Deliver Nephrotoxic Agents into the Bloodstream of Zebrafish Embryo

Source: McKee, Robert A. et al. <a href="https://www.jove.com/video/54241" target="_blank">Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the intravenous microinjection of nephrotoxins into the tail vein of a zebrafish embryo to study their chemical effects on renal function.

Intravenöse Mikroinjektion von Nephrotoxinen in den Zebrafischembryo: Eine Technik zur Abgabe nephrotoxischer Wirkstoffe in den Blutkreislauf des Zebrafischembryos

Source: McKee, Robert A. et al. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the ...