Wir danken dem Biological Imaging Development Center (BIDC) University of California, San Francisco für die Nutzung des Imaris, Imaris XT und Matlab. Wir danken V. Kharazia für die technische Unterstützung und AT Henry, LK Floren, L. Daitch für ihre Beiträge zur Bearbeitung des Manuskripts. 1R21DA029966-01 und NIH Fast Track Award an die MLSMR Sammlung SEB, UCSF School of Pharmacy screenen (: Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem US-Bundesstaat Kalifornien Medical Research zum Thema Alkohol &amp; Substance Abuse durch UCSF SEB, die National Institutes of Health unterstützt Dekanat und Klinische Pharmazie) und die School of Medicine (Clinical Pharmacology &amp; Experimental Therapeutics), um CLHK.

Ein. Dreidimensionale morphometrische Analyse von Single-cell phänotypischen Veränderungen <ol><li> Menschliche embryonale Nieren-(HEK293) Zellen wurden mit Hämagglutinin (HA)-Tag Corticotropin Releasing Factor-Rezeptor-2 (CRF-R2), einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR), wie zuvor beschrieben, 4, 5. </li><li> Die Zellen wurden unbehandelt gelassen (keine Behandlung, NT), stimuliert mit dem CRF-R2 endogener Ligand, Corticotropin Releasing Factor, CRF (1 pM, 30 min) oder vorbehandelt mit einem selektiven CRF-R2-Antagonisten, Anti-Sauvagin 30 (AS -30, 1 pM, 30 min) vor dem Agonist Behandlung. </li><li> Die Zellen wurden dann fixiert, permeabilisiert und mit Anti-HA. CRF-R2 wurde unter Verwendung Alexa 594 nm Konjugat anti-Maus (IgG 1) Antikörper. DAPI wurde verwendet, um die Kerne mitotischen Phase visualisieren. </li><li> Um den Experimentator Subjektivität zu begrenzen, wurden die experimentellen Bedingungen erst nach wurden die Bilder erfasst und analysiert bekannt. </li><li> Wir aufgenommenen Bildess aus dem Festnetz HEK293 Zellen unter Verwendung eines Plan-Apochromat 63x/1.4 Öl DIC objektive und Zeiss LSM 510 META konfokalen Mikroskop mit einem Coherent integrierten Zwei-Photonen-Laser-System eines Verdi-V5 Laser und einem Mira 900-F Lasersystem besteht. </li><li> Während der Datenaufnahme Verfahren wurden die Zellen sowohl durch multispektrale Sektionieren, 488 nm und 790 nm (~ 350 nm 2ph Ex.) Und z-Partitionierung (0,5 um Inkremente), um Daten aus der Kernmembran zu dem äußeren extrazellulären Rezeptor umfassen kompartimentiert Extremitäten. </li><li> Die Fluoreszenz-Daten wurden zunächst verarbeitet Imaris, die die Visualisierung und Segmentierung von 3D-Mikroskopie Datensatz ermöglicht, und ein 3D-Modell von kubischen Voxeln komponiert wurde für morphometrische Analyse erstellt. Dann wurde Imaris XT Modul-Schnittstelle Imaris mit MATLAB Computerprogramm Sprache genutzt werden, um die Stelle Koordinaten der GPCR-Erweiterungen zu bestimmen. Zur Berücksichtigung zelluläre Variabilität nehmen, erhalten wir und analysiert Fluoreszenzbilder taken aus 22 Zellen: keine Behandlung (NT) (n = 7), Agonisten (CRF)-Behandlung (n = 8) und die Vorbehandlung mit Antagonisten (AS-30) vor dem Agonist Behandlung (n = 7) (Figur 2) . <ol><li> Die Region of Interest (ROI) sollte eine Zelle, die nicht aktiv in mitotischen Bühne und nicht auf andere Zellen zu schließen. Auf diese Weise wird die Analyse die Zellen mit nur einem Kern und den Rezeptor Verlängerungen nicht gestört durch Nähe zu anderen Zellen. </li><li> Die zelluläre 3D-Struktur wurde zuerst aus multispektralen Fluoreszenz-Daten mit Imaris (v.7.1.1) rekonstruiert. </li><li> Nach dem Algorithmus durch Imaris gestalten, wurde zunächst die Oberfläche Rendering verwendet, um die Kernmembran repräsentieren. Imaris wird bestimmen, ob es mehr als einen Kern in der ROI. </li><li> Dann wird der Flecken-Erstellung Algorithmus wurde verwendet, um die CRF-R2-Erweiterung finden. Spots Detektion verwendet wurde, weil es für Hintergrundgeräusche und unregelmäßigen Intensität des kompensiertkomplexes Netzwerk aus amorphem geformten Zellen. </li><li> Um die Aufnahme von jeder Einheit der Fluoreszenzdetektion von CRF-R2 zu maximieren, wurde die Flecken &#39;Durchmesser bis 0,2 um, die die kleinste Einheit innerhalb des Bildes, um unterschiedliche Informationen in Form einer gemessenen Intensität mit einem Gauß-Filter extrapolieren gesetzt. Spot-Filterung in der spots automatisierte Erstellung einbezogen. Die Software, jedoch gibt dem Benutzer die Flexibilität, Filter zu verwenden, um die Parameter zu definieren. </li><li> Um Daten abgeschnitten zu vermeiden, wurde der Datensatz von 8-Bit (unsigned) festen Punkt, auf 32-Bit Dezimalzahl umgewandelt. </li><li> Die Voxel-Intensitäten Daten ausgetauscht wurden, um Koordinaten unter Verwendung Imaris XT-Modul eine Schnittstelle mit MATLAB und die exakte räumliche Position jedes Spots durch Ausführen einer Transformation unter Verwendung der Entfernung Kernmembran als Bezugspunkt (Abbildung 3) bestimmt erkennen. </li></ol></li><li> Die resultierenden Daten können quantifiziert und dargestellt werden in einem grafischen Format für sTATISTISCHE Analyse. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mit Zwei-Wege-ANOVA und Bonferroni Posttest. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung präsentiert. Unterschiede werden als signifikant bei * p &lt;0,05. Berechnungen wurden mit GraphPad Prism 5,02 (Abbildung 4). </li></ol> 2. Repräsentative Ergebnisse Um die Kraft des Ansatzes zu demonstrieren, haben wir die zelluläre Veränderungen quantifiziert, die sich aus der Interaktion von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) und Corticotropin Releasing Factor-Rezeptor-2 (CRF-R2) mit seinem endogenen Liganden CRF in transfizierten HEK293-Zellen. Wir zeigen, dass CRF-R2-Rezeptoren in der Plasmamembran und ragen aus endlichen Bereichen der Membran der Zellen (2A und Movie 1) befinden. Verwendung herkömmlicher 2D-Analyse ist es möglich, diese Untermenge von extrazellulären CRF-R2-Rezeptoren nur erkennen, wenn man den Rezeptor zu analysieren Adhäsion points auf dem Glas bedeckt. Folglich verlieren wir weitere Informationen aus z-stacked multispektralen Daten (Abbildung 5) abgeleitet. Wenn die Zellen mit CNI behandelt werden, werden die extrazellulären Rezeptoren stark reduziert, wie durch die Abnahme des Abstandes der Flecken von der Plasmamembran gezeigt. Sie werden auch von vorwiegend endliche Orten in eine Anzahl diskreter Orte (2B und Film 2) umverteilt. Die Wirkung von CRF auf Rezeptormembranpräparation Verteilung wird durch Vorbehandlung mit dem CRF-R2 spezifischer Antagonist, antisavagine 30 (AS-30) verhindert, und wir finden, dass die CRF-R2-Erweiterungen nicht ändern (2C und Movie 3). Das distale Verteilung der Flecken, aufgetragen in den 5 um Spektrumspreizung farbcodiert Abständen wird genutzt, um den Abstand der Voxel aus der Kernmembran visualisieren. Keine Behandlung und Antagonist pretreatment (AS-30, 1 M, 30 min) vor Agonisten-Behandlung (CRF, 1 M, 30 min) zeigen keinen signifikanten (ns) Unterschied in der GPCR Kontraktion. Behandlung der Zellen mit dem Agonisten (CRF, 1 pM, 30 min) fortschreitend verringert die Anzahl der CRF-R2-haltigen Voxeln wenn die keiner Behandlung, 0-5 um (ns), 6-15 um (Vergleich ** p &lt; 0,01) und&gt; 15 um (*** p &lt;0,005), oder im Vergleich zu AS-30 Behandlung, 0-10 um (ns), 11-15 um (** p &lt;0,01) und&gt; 15 um (*** p &lt;0,005) (Figur 4). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der aktuell verfügbaren Techniken und deren Beschränkung auf Fluoreszenz-Bildern analysieren. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig2.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 2. 3D multispektralen Fluoreszenz-Aufnahmen von HEK293 transfizierten Zellen mit HA-CRF-R2 vor und nach Agonisten und-Antagonisten. Fusionierten Bildern zeigt HA-CRF-R2-sondiert Verwendung von Anti-HA und visualisiert Alexa 488-konjugierte anti-Maus (IgG 1) sekundären Antikörper; DAPI wurde verwendet, um die Kerne zu visualisieren. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning (CLS)-Mikroskop erworben. Maßstab 5 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig3.jpg" /> Abbildung 3. 3D-Modell der HEK293 transfizierten Zellen mit HA-CRF-R2 rekonstruiert aus CLS Bilder mit Imaris Software. Oberflächen-Rendering des Kerns und Flecken Erstellung beschreiben GPCR-Erweiterungen umgewandelt kleine Bläschen. Die Fluoreszenz-Daten wurden zunächst verarbeitet Imaris die Visualisierung und Segmentierung von 3D-Mikroskopie Datensatz ermöglicht. Dann wurde Imaris XT-Schnittstelle Imaris mit MATLAB genutzt. Die Voxel Intensitäten wurden in ausgetauschtOrt koordiniert. Die Spots Spektrum-codierte Farbe (blau 0-5 um, grün, 6-10 um, gelb 11-15 um und rot&gt; 15 um) geben den Abstand bilden die Kernmembran. Skalieren 5 um. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig4.jpg" /> Abbildung 4. Graphische Darstellung der Verteilung von distalen Spots aufgetragen im Spektrum-Farbe in 5 um Intervallen codiert wird verwendet, um den Abstand der Voxel aus der Kernmembran visualisieren. Keine Behandlung und Vorbehandlung mit einem Antagonisten (AS-30, 1 M, 30 min) vor Agonisten-Behandlung (CRF, 1 M, 30 min) zeigen keinen signifikanten (ns) Unterschied in der GPCR Kontraktion. Behandlung der Zellen mit einer Agonisten (CRF, 1 pM, 30 min) fortschreitend verringert sich der Abstand der Anzahl an CRF-R2-haltigen Voxeln, wenn keine Behandlung 0-5 um (ns), 6-15 um (** p Vergleich &lt;0,01) und&gt; 15 um (*** p &lt;0,005) oder AS-30 Behandlung 0-10 um (ns), 11-15<html> um (** p &lt;0,01) und&gt; 15 um (*** p &lt;0,005). <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig5.jpg" /> Abbildung 5. Begrenzung der 2D morphometrische Analyse von HEK 293 transfizierten Zellen mit HA-CRF-R2. Die Midplane Abschnitt von Zellen (3-4 um über dem Deckglas) zeigt den Mittelpunkt der Kerne sichtbar gemacht mit DAPI und HA-CRF-R2 sondiert Verwendung von Anti-HA und visualisiert Alexa 488nm konjugiertem anti-Maus (IgG 1) sekundäre Antikörper und erwarb mit CLS zeigt keinen Unterschied zwischen (A) keiner Behandlung (NT) und (B)-Agonisten (CRF, 1 M, 30 min), während die Rezeptor-Klebepunkten dramatisch unterschiedlich sind. Movie 1. Frei rotierende 3D-Modell in der &quot;Surpass&quot;-Modus der HEK 293 transfizierten Zellen mit HA-CRF-R2, keine Behandlung, um zelluläre Phänotyp Unterschiede zwischen Rezeptorproteine ​​zu bewerten. Maßstab von 5 bis 20 um./ Files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier, um Film zu sehen. Film 2. Freilaufend 3D-Modell in der &quot;Surpass&quot; Modus der HEK 293-Zellen transfiziert mit HA-CRF-R2,-Agonisten, CRF (CRF, 1 pM, 30 min) auszuwerten zelluläre Phänotyp Unterschiede zwischen Rezeptorproteine. Maßstab von 5 bis 20 um. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie2.avi" target="_blank">Klicken Sie hier, um Film zu sehen.</a> Film 3. Freilaufend 3D im &quot;Surpass&quot; Modus der HEK 293-Zellen transfiziert mit HA-CRF-R2, Vorbehandlung mit einem Antagonisten (AS-30, 1 pM, 30 min), bevor Agonist Behandlung (CRF, 1 pM, 30 min ) zur Auswertung zelluläre Phänotyp Unterschiede zwischen Rezeptorproteine. Maßstab von 5 bis 20 um. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie3.avi" target="_blank">Klicken Sie hier, um Film zu sehen.</a>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir zeigten, dass CRF Behandlung eine signifikante Veränderung in der Morphologie und Lage der CRF-R2 induziert. Die Veränderung der CRF-R2 wurde durch selektive Antagonisten Behandlung gehemmt. Wir haben gezeigt, dass Rezeptor Modifikationen, die nicht erkannt wurden und kann nicht gemessen werden mit den Standard-2D-multispektralen Techniken. Die Fähigkeit, komplexe 3D-Bilder zu studieren ist kritisch, um die Komplexität der biologischen Parameter für morphometrische Analyse aufzunehmen. Wir waren in der Lage, 3D...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK293) </td><td> American Type Culture Collection </td><td> CRL-1573 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965118 </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor-488 (IgG2b) </td><td> Invitrogen </td><td> A-11001 </td><td></td></tr><tr><td> monoklonalen Anti-HA.11 (IgG 1) </td><td> Covance </td><td> 16B12 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-1200 </td><td>; </td></tr><tr><td> CRF </td><td> Sigma </td><td> C2917 </td><td></td></tr><tr><td> Antisauvagine-30 (AS-30) </td><td> Sigma </td><td> A4727 </td><td></td></tr></tbody></table>

an analytical tool that quantifies cellular morphology changes from three-dimensional fluorescence images

Die häufigsten Software-Analyse-Tools für die Messung der Fluoreszenz Bilder sind für zweidimensionale (2D) Daten, die auf manuelle Einstellungen für die Aufnahme und den Ausschluss von Datenpunkten und computergestützte Mustererkennung, um die Interpretation und die Ergebnisse der Analyse zu unterstützen verlassen. Es wird zunehmend wichtig, in der Lage sein Fluoreszenzbilder von dreidimensionalen (3D) ausgebildet Datensätze zu messen, um in der Lage sein, die Komplexität der zellulären Dynamik zu erfassen und verstehen, die aufgrund von zellulären Plastizität innerhalb biologischer Systeme. Sophisticated Mikroskopie Instrumente der Visualisierung von 3D-Fluoreszenz-Aufnahmen durch den Erwerb von multispektralen Fluoreszenz-Bildern und leistungsstarke Analysesoftware, die die Bilder rekonstruiert aus konfokalen Stacks, die dann eine 3D-Darstellung der gesammelten 2D-Bildern erlaubt. Fortschrittliches Design-based Stereologie Methoden aus der Angleichung und Annahmen des origina fortgeschrittenl Modell-basierte Stereologie 1 auch in komplexen Gewebeschnitten 2. Trotz dieser wissenschaftlichen Fortschritte in der Mikroskopie, bleibt ein Bedarf an einem automatisierten Verfahren, das analytische schöpft die intrinsische 3D-Daten für die Analyse und Quantifizierung der komplexe Veränderungen der Zellmorphologie, Proteinlokalisierung und Rezeptortransport ermöglichen. Aktuelle Techniken zur Verfügung Fluoreszenz-Bildern zu quantifizieren sind Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) und Image J (NIH), die manuelle Analyse liefern. Imaris (Andor Technology, Belfast)-Software bietet das Merkmal MeasurementPro, welche die manuelle Erzeugung von Messpunkten, die in einem Volumen Bild platziert werden können oder auf einem gezogenen Serie von 2D-Slices, um ein 3D-Objekt zu erstellen. Diese Methode eignet sich für Ein-Klick-Punkt-Messungen, um eine Linie zwischen zwei Objekten zu messen oder ein Polygon, das einen Bereich von Interesse umschließt schaffen, aber es ist schwierig, kompl geltenex Zellularnetz Strukturen. Filament Tracer (Andor) ermöglicht die automatische Erkennung des 3D neuronalen fadenähnlicher aber dieses Modul wurde entwickelt, um definierte Strukturen, wie Neuronen, die von Dendriten, Axonen und Stacheln (Baumstruktur) enthalten sind zu messen. Dieses Modul wurde raffiniert Verwendete zu morphologischen Messungen nicht-neuronalen Zellen 3 machen jedoch vorsehen, die Ausgangsdaten mit Informationen von einer ausgefahrenen Zellularnetz unter Verwendung einer Software, die auf einem definierten Zellform anstatt eine amorphe-förmigen zellularen Modell abhängt. Um das Problem zu analysieren amorphe-förmigen Zellen und Bereitstellung der Software besser geeignet, um eine biologische Anwendung zu überwinden, entwickelte Imaris Imaris Cell. Dies war ein wissenschaftliches Projekt mit der Eidgenössischen Technischen Hochschule, die entwickelt wurde, um die Beziehung zwischen Zellen und Organellen zu berechnen. Während die Software ermöglicht die Detektion von biologischen Zwänge, durch Erzwingen einen Kern pro Zelleund Verwenden Zellmembranen Zellen zu segmentieren, kann er nicht verwendet, um Fluoreszenz-Daten, die nicht kontinuierlich, da idealerweise Zelloberfläche baut ohne Hohlräume zu analysieren. Nach unserem Kenntnisstand derzeit kein Benutzer änderbare automatisierten Ansatz, morphometrische Informationen liefert aus 3D-Fluoreszenz-Bildern entwickelt worden, erzielt zellulären räumliche Information einer undefinierten Form (Abbildung 1). Wir haben eine analytische Plattform mit dem Imaris Kern Softwaremodul und Imaris XT Schnittstelle zu MATLAB (Mat Works, Inc.) entwickelt. Diese Tools ermöglichen die 3D-Messung von Zellen ohne eine vordefinierte Form und mit inkonsistenten Fluoreszenz-Netzwerk-Komponenten. Darüber hinaus wird diese Methode können die Forscher die Know-how erweitert haben in biologischen Systemen, aber nicht Vertrautheit EDV-Anwendungen, um eine Quantifizierung der morphologischen Veränderungen in der Zelle Dynamik durchzuführen.

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An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Wir entwickelten eine Software-Plattform, Imaris Neuroscience, ImarisXT und MATLAB, um die Änderungen in der Morphologie einer undefinierten Form von dreidimensionalen konfokale Fluoreszenz einzelner Zellen aufgenommen zu messen verwendet. Dieser neuartige Ansatz kann verwendet werden, um Veränderungen in der Zellform nach Aktivierung des Rezeptors zu quantifizieren und stellt somit eine mögliche zusätzliches Werkzeug für die Wirkstoffforschung.

Ein analytisches Werkzeug, das zelluläre Morphologie Änderungen von Dreidimensionale Fluorescence Images Quantifiziert

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.5K Aufrufe.  University of California, San Francisco. Wir entwickelten eine Software-Plattform, Imaris Neuroscience, ImarisXT und MATLAB, um die Änderungen in der Morphologie einer undefinierten Form von dreidimensionalen konfokale Fluoreszenz einzelner Zellen aufgenommen zu messen verwendet. Dieser neuartige Ansatz kann verwendet werden, um Veränderungen in der Zellform nach Aktivierung des Rezeptors zu quantifizieren und stellt somit eine mögliche zusätzliches Werkzeug für die Wirkstoffforschung.

Serie: An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Chip-basierte dreidimensionale Zellkultur in perfundierten Micro-Bioreaktoren

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Forschung

Biologie

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabrication der Chip-Größe Gerüste für die dreidimensionale Kultivierung der Zellen

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Montage-, Lade-und Alignment einer analytischen Ultrazentrifuge Messkammerdirektanschluss

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Änderungen der Brustdrüsen Morphologie und Breast Cancer Risk in Ratten

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Schnelle Analyse und Exploration von Fluoreszenzmikroskopie Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

Quantitative Ansätze zur Untersuchung zellulärer Strukturen und Organelle Morphologie in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...