Wir erkennen die Unterstützung der Forschung durch die Interne Research Program der NIBIB, NIH.

Messkammerdirektanschluss Montage und Drehmoment <ol><li> Wir beginnen Probenzelle Konstruktion, indem sie zusammen 2 Fenster Baugruppen. Legen Sie ein Fenster Dichtung in das Fenster Halter. Positionieren Sie die Fenster-Liner (oder ist es manchmal ein Fenster Kissen genannt) in das Fenster Halter, so dass die Öffnung der Liner ist gegenüber der Nut des Halters. In einem leichten Winkel, statt das Fenster in die Halterung Ausrichten der Anriss auf das Fenster mit den wichtigsten Weg des Fensters Inhaber. Drücken Sie vorsichtig an den Rändern auf beiden Seiten des Fensters. </li><li> Um eine einwandfreie Abdichtung und genaue Drehmoment des Probenzelle zu gewährleisten, haben wir leicht Beschichtung der Gehäuse-Dichtung und die Schraube mit Spinkote Schmiermittel. Verteilen Sie eine sehr kleine Menge von Spinkote zwischen Daumen und Zeigefinger. Bestreichen Sie die Schraubring Gewinde mit einem dünnen, unsichtbaren Film von Spinkote. Ebenso Beschichtung der Gehäuse-Dichtung. Wischen Sie alle sichtbaren Schmiermittel. </li><li> Begin Probenzelle Montage indem Sie ein Fenster Montage, mit dem Fenster nach oben in Richtung zu Ihnen, in die Zelle Gehäuse, indem Sie die Nut mit dem Gehäuse drücken. Richten Sie den Mittelpunkt Keilnut mit dem Gehäuse gedrückt und lassen Sie ihn sanft auf der Oberseite des Fensters Montage im Inneren der Zelle fallen. </li><li> Verwenden Sie niemals irgendeine Art von Werkzeug, um das Herzstück in die Zelle Gehäuse schieben. Dies könnte zu irreparablen Schäden an den CP was Leck während der Experimente. Schalten Sie das zweite Fenster Montage, so dass das Fenster in Richtung Zentrum vor, weg von dir, Nut auszurichten Gehäuse gedrückt und schieben Sie ihn nach unten auf den Mittelpunkt. Legen Sie ein Gehäuse Dichtung oben, dann ein Schraubring so das Wort &quot;Out&quot; zu sehen ist. Benutzen Sie Ihre Finger und ein Alignment-Werkzeug, ziehen Sie den Schraubring. Wenn der CP nicht leicht in das Gehäuse Barrel, erst ausrichten, dann legen Sie das zweite Fenster Montage oben drauf. Durch die Anwendung sanften Druck auf das Fenster Montage, schieben beide in die Zelle Gehäuse zur gleichen Zeit. Auf diese Weise vermeiden wir drücken direkt auf den CP. Jetzt ist ein guter Zeitpunkt, um innerhalb der Zelle für Staub, Flusen und Fingerabdrücken zu suchen. Sie werden auch feststellen Newtonsche Ringe, dass es noch Luft zwischen den CP und die Fenster anzuzeigen. Diese werden nach dem Auftragen Drehmoment verschwinden. </li><li> Mit dem Schraubring und das Wort &quot;out&quot; zu sehen, statt die Probenzelle den ganzen Weg hinunter in die Zelle Drehmoment Spannzange des Drehmoments stehen. Halten Zelle statt, indem konstanten Druck auf das Drehmoment stehen zu behandeln. In einer kontinuierlichen Bewegung, ziehen Sie die Schraube Ring zwischen 120-140 in-lbs. Bei Verwendung eines einstellbaren Mikrometer Drehmomentschlüssel, setzen Sie ihn auf zwischen 120-140 in / lbs und die Schraube anziehen Ring, bis der Schlüssel &quot;Klicks&quot; zeigt das eingestellte Drehmoment erreicht ist. Lassen Sie die Drehmoment stehen Griff und entfernen Sie vorsichtig die Probenzelle, ohne das Fenster. </li></ol> Be-und Sealing die Messküvette <ol start="6"><li> Für Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente, die wir routinemäßig laden ein Volumen von 400ul in jedem Sektor des 12mm Mittelstück mit einem 200 &amp;mgr; l Pipette. Position der Messzelle mit dem Laden Löcher auf der Oberseite und das Wort &quot;out&quot; auf dem Schraubring sichtbar. Schieben Sie die Pipettenspitze auf halbem Weg nach unten in den LINKS Herzstück Sektor durch die Be-Löcher und langsam verzichten 200 &amp;mgr; l der Referenzlösung. Wiederholen Sie einmal, um 400ul insgesamt. Mit der gleichen Pipettenspitze und die gleiche Technik, vorsichtig und langsam füllen Sie die RECHTE Herzstück Sektor mit 400ul der Probenlösung. Volumes von 150-180 ul für Sedimentationsgleichgewicht Experimenten verwendet, aber der gleichen Sorgfalt und Technik sind zu beachten. Es ist zwingend notwendig, um das Volumen der Referenz und Probe-Lösungen passen so genau wie möglich. Montage der Pipettenspitze fest auf die Pipette langsam geladen und Abgabe-Lösungen, die Vermeidung loading Blasen und mit der gleichen Pipettenspitze für beide Lösungen alle Beihilfen im Sinne der Volumina möglichst gleich. </li><li> Seal die Zelle, indem Sie 2 neue rot-Gehäuse-Stecker Dichtungen fest in jeder Be-Loch dafür, dass sie zwischen dem Mittelstück und dem Aluminium-Gehäuse positioniert sind. Abdeckung mit jeweils einem Gehäuse anschließen. Hand mit einem kleinen flachen Schraubendreher anziehen. </li></ol> Messkammerdirektanschluss Alignment in Rotor <ol start="8"><li> Vor dem Einlegen des Rotors, stellen Sie sicher, das Gegengewicht ist nicht mehr als .5 g leichter als die Probenzelle in die entgegengesetzte Position für den Fall, dass Probenzelle Lecks. Beginnen Sie mit der Balance bei Null. Zunächst wiegen die Probe Zelle, in der Position gegenüber der CB werden. Tarieren die Probenzelle Gewicht subtrahieren, dann wiegen die CB. Addieren oder Subtrahieren von Gewicht aus dem Befestigungsloch der Ausgleich. Stellen Sie sicher, Gewichte nicht von oben ragen. Erneut gewogen, um sicherzustellen, dass das Gegengewicht Endgewicht innerhalb .5 g leichter ist als das Gegenteil Probenzelle. </li><li> Mit einem 4-fach Rotor, statt das Gegengewicht in Position 4, so dass der weiße Pfeil sichtbar ist und verweist in ter Richtung der Zentrifugalkraft. Stellen Sie sicher, es ist den ganzen Weg hinunter in den Rotor. Vorsichtig ziehen Sie die Stellschraube, auf der Oberseite des Gegengewicht direkt gegenüber dem weißen Pfeil gefunden, bis das Gegengewicht fest an seinem Platz, aber immer noch in der Lage, ausgerichtet werden. Position der ausgewogenen Probenzelle mit dem Gehäuse Stecker vor der Mitte des Rotors und das Wort &quot;out&quot; auf dem Schraubring sichtbar. </li><li> Blick von unterhalb des Rotors, richten Sie die Innenseite Anriss (die Marke am nächsten an der Mitte des Rotors) mit dem Anriss auf das Gegengewicht mit einem Alignment-Tool. Ziehen Sie die Stellschraube ausgerichtet Gegengewicht zu verriegeln. In der gleichen Weise, richten Sie die Probenzelle Anriss mit der Innenseite Anriss an Position 2 auf dem Rotor. </li></ol> Für weitere Informationen siehe <a href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx</a>

<ol>
	<li>Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+protein-protein+interactions+by+sedimentation+velocity+analytical+ultracentrifugation.">Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).</li><li>Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions+by+equilibrium+sedimentation.">Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).</li><li>. Home - Workshops [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx</a></li></ol>

Die richtige Zellverband, Probe Insertion und Ausrichtung der Zellen in der Rotor ist entscheidend für die hohe Qualität AUC Experimente. Dies gilt insbesondere für Experimente, die eine sehr detaillierte Analyse der erfassten Daten über die makromolekulare Sedimentation Profile erfordern, z. B. beim Studium Protein-Interaktionen und die Bestimmung Spur Gesamtbeträge. Oft ist die Qualität der Versuchsaufbau ist für die Genauigkeit und Präzision der Ergebnisse aus der AUC Studie begrenzen. Für Einzelheiten über die praktische Design und die weitere Ausführung des AUC Experimente finden Sie unter Referenzen 1 bis 3. Workshops zu den praktischen Aufbau, Theorie und Datenanalyse von AUC Experimente werden zweimal im Jahr in unserem Labor an der National Institutes of Health [4].

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4-place Ti analytical rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>361964</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torque stand assembly</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>361318</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell alignment tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinkote Lubricant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>306812</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Counterbalance</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>360219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Housing kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>334602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window gasket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>327021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window liner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362329</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window, sapphire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>307177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window, quartz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>301730</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>305037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12mm double sector Epon centerpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>306493</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell plug gaskets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>327022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell housing plug	</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362327</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell

Die analytischen Ultrazentrifuge (AUC) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das uns biophysikalischen makromolekulare Sedimentation Profile während Hochgeschwindigkeitszentrifugation aufnehmen können. Wenn sie richtig geplant und ausgeführt, kann ein AUC Sedimentationsgeschwindigkeit oder Sedimentationsgleichgewicht Experiment sehr viel über ein Protein in Bezug auf Größe und Form, Muster Reinheit, Sedimentationskoeffizient, Oligomerisierung Staaten und Protein-Protein-Wechselwirkungen zeigen. Diese Technik erfordert jedoch eine strenge Niveau der technischen Aufmerksamkeit. Beispiel Zellen Besitz eines sectored Kernstück zwischen zwei Glasscheiben eingeschlossen. Sie sind mit einem Drehmoment Druck von etwa 120-140 in / lbs versiegelt. Referenz-Puffer und Probe werden in den Mittelpunkt Sektoren geladen und dann nach der Versiegelung werden die Zellen genau in einem Titan-Rotor so ausgerichtet, dass die optische Detektion Systeme scannen beide Probe und Referenz-Puffer in der gleichen radialen Weg Mittellinie durch jede Herzstück Sektor während der Rotation bei Geschwindigkeiten von bis zu 60 000 Umdrehungen pro Minute und unter sehr hohem Vakuum Nicht nur ist die richtige Probenzelle Montage kritisch sind Probenzelle Komponenten sehr teuer und muss richtig gepflegt werden, um sicherzustellen, dass sie in optimale Arbeitsbedingungen Voraussetzung, um Lecks und Brüche während der Experimente zu vermeiden. Handle Fenster sorgfältig, denn selbst die kleinste Riss oder Kratzer zu einem Bruch in der Zentrifuge führen kann. Der Kontakt zwischen Kernstück und Fenster müssen so dicht wie möglich, dh keine Newton s Ringe sichtbar sein soll, nachdem Drehmoment Druck ausgeübt wird. Staub, Flusen, Kratzer und Öle entweder auf die Fenster oder das Herzstück aller Kompromisse diesen Kontakt und kann sehr einfach an der undichten Lösungen von einem Sektor zum anderen oder ein Auslaufen der Mittelpunkt allen zusammen zu führen. Nicht nur die wertvollen Proben verloren, Auslaufen von Lösungen während eines Experiments wird ein Ungleichgewicht der Druck in der Zelle führt oft zu Glasbruch und Mittelstücke verursachen. Darüber hinaus müssen Plug Dichtungen und Gehäuse Stecker fest an seinem Platz, um Lösungen Herausziehen des Mittelstücks Sektor durch die Be-Löcher durch das Hochvakuum in der Zentrifugenkammer zu vermeiden. Fenster-Liner und Dichtungen müssen frei von Brüchen und Rissen dazu führen, dass Bewegung die sich in zerbrochenen Fenstern konnte. Dieses Video wird unser Verfahren der Messküvette Montage zu demonstrieren, zu minimieren Drehmoment, Be-und Rotor-Ausrichtung, um Komponenten beschädigt, Lösung undicht und Bruch während des perfekten AUC Experiment.

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Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Die analytischen Ultrazentrifuge (AUC) Probenzelle hält Probe und Referenz-Puffer und während der Experimente und eine hohe Vakuum-und Rotor-Geschwindigkeiten von bis zu 60.000 Umdrehungen pro Minute ausgesetzt. Dieses Video startet den viel Liebe zum Detail, die für Montage, Be-und Ausrichtung dieses sehr wichtige Komponente einer AUC Experiment demonstrieren.

Montage-, Lade-und Alignment einer analytischen Ultrazentrifuge Messkammerdirektanschluss

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

assembly-loading-alignment-an-analytical-ultracentrifuge-sample

Research

JoVE Journal

Biology

22.4K Aufrufe.  Dynamics of Macromolecular Assembly, Laboratory of Bioengineering and Physical Science. Die analytischen Ultrazentrifuge (AUC) Probenzelle hält Probe und Referenz-Puffer und während der Experimente und eine hohe Vakuum-und Rotor-Geschwindigkeiten von bis zu 60.000 Umdrehungen pro Minute ausgesetzt. Dieses Video startet den viel Liebe zum Detail, die für Montage, Be-und Ausrichtung dieses sehr wichtige Komponente einer AUC Experiment demonstrieren.

Serie: Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Präparation Organizer und Animal Pole Explantate aus Xenopus laevis Embryos und Montage eines Cell Adhesion Assay

Forschung

Biologie

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Nuclear Assembly mit Fraktionierte Xenopus Egg Auszüge

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The apertureless near-field microscope is a light scattering-type instrument that provides infrared spectra at circa 20 nm resolution. A complete list of components and a step-by-step protocol for use is provided.  Common errors in assembly and instrument tuning are discussed.  A representative data set that shows the secondary structure of an amyloid fibril is presented.  

The assembly of a nearfield infrared microscope for imaging protein aggregates is described.

Montage, Tuning und Verwenden eines aperturlosen Near Field Infrared Mikroskop für Protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Ein analytisches Werkzeug, das zelluläre Morphologie Änderungen von Dreidimensionale Fluorescence Images Quantifiziert

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Testproben zur Optimierung STORM Super Resolution Mikroskopie

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized plasmids for expression of exogenous genes in mouse embryonic stem cells (mESCs). Expression of exogenous genes under the control of the SV40 or human cytomegalovirus promoters diminishes quickly after transfection into mESCs. A remedy for this diminished expression is to use the human elongation factor-1 alpha (hEF1&#945;) promoter to drive gene expression. Plasmid vectors containing hEF1&#945; are not as widely available as SV40- or CMV-containing plasmids, especially those also containing N-terminal 3xFLAG-tags. The protocol described here is a rapid method to create plasmids expressing FLAG-tagged CstF-64 and CstF-64 mutant under the expressional regulation of the hEF1&#945; promoter. GA uses a blend of DNA exonuclease, DNA polymerase and DNA ligase to make cloning of overlapping ends of DNA fragments possible. Based on the template DNAs we had available, we designed our constructs to be assembled into a single sequence. Our design used four DNA fragments: pcDNA 3.1 vector backbone, hEF1&#945; promoter part 1, hEF1&#945; promoter part 2 (which contained 3xFLAG-tag purchased as a double-stranded synthetic DNA fragment), and either CstF-64 or specific CstF-64 mutant. The sequences of these fragments were uploaded to a primer generation tool to design appropriate PCR primers for generating the DNA fragments. After PCR, DNA fragments were mixed with the vector containing the selective marker and the GA cloning reaction was assembled. Plasmids from individual transformed bacterial colonies were isolated. Initial screen of the plasmids was done by restriction digestion, followed by sequencing. In conclusion, GA allowed us to create customized plasmids for gene expression in 5 days, including construct screens and verification.

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&amp;#945; Promoter Using Gibson Assembly

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

Erzeugung von Plasmid-Vektoren, die FLAG-markierten Proteine ​​Nach der Verordnung der Menschen Elongation Factor-1α Promoter Mit Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Ein alternativer Ansatz für die Probenvorbereitung mit geringer Zellzahl für die TEM-Analyse

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Spaltöffnungen Tape-Peel: Ein verbessertes Verfahren zur Wache Zelle Probenvorbereitung

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

Kryogene Probenladung in ein magisches Winkel-Spinning-Kernspinresonanzspektrometer, das die Zelllebensfähigkeit bewahrt

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...