Wir danken Adam Coster und alle anderen Mitglieder der Altschuler und Wu Labors für hilfreiche Rückmeldungen und Diskussionen. Diese Forschung wurde durch das National Institute of Health gewährt R01 GM085442 und CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW) und die Welch Foundation I-1619 (SJA) und I-1644 (LFW).

1. Vorbereiten Proben und Imaging <ol><li> Zellkultur <ol><li> Split Kulturen routinemäßig und zu halten, bei 20-70% Konfluenz. Einen Tag vor dem Experiment, wachsen HeLa-Zellen in DMEM (Dulbecco modifiziertem Eagle Medium, siehe Tabelle der Materialien) und mit 10% FBS (Fetal Bovine Serum) und 1x Penicillin / Streptomycin. </li><li> Am Tag des Experiments geteilten Zellen, die in Kultur (ca. 50% konfluent). </li><li> Waschen der Zellen mit PBS (Phosphate Buffered Saline) freizulegen, um etwa 2 ml Trypsin / EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) für einige Sekunden. Saugen Sie überschüssige Trypsin / EDTA und halten Zellen in einem dünnen Film von Trypsin / EDTA in der Kapuze bei RT für ca. 3 Min. gebadet. </li><li> Mechanisch Kolben zweimal schütteln und lösen Zellen mit Serum Medien. Zählen von Zellen und verdünnt auf 5.000 Zellen/50 ul Medium und sofort Platte 50 ul / Vertiefung auf einer Bodenplatte 384-Well-Glas mit Hilfe eines automatisierten Liquid-Handling-Roboter (nur 30 guts der Platte verwendet werden, hier). </li><li> Inkubieren Platte bei Raumtemperatur 30 min auf Randeffekte in den Vertiefungen 5 zu minimieren. Nach RT Inkubation Ort Platten in einem 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator über Nacht. </li><li> Jedes Medikament wird doppelt getestet werden. Hinzufügen von 25 ul Arzneimittel mit den entsprechenden Vertiefungen auf der Platte bereits enthaltenden Medien. </li><li> Fix Platte mit 4% Paraformaldehydlösung in PBS bei 24 h nach der medikamentösen Behandlung. </li></ol></li><li> Die Färbung Die spezifischen primären Antikörpern, fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper und andere fluoreszierende Flecken, die hier verwendet wurden, sind in Tabelle von Materialien aufgeführt. <ol><li> Durchdringbar fixierten Zellen mit 0,2% Triton X-100-Lösung in TBS (Tris-gepufferte Kochsalzlösung) für 3 min, und wasche mit TBST (Tris-gepufferte Kochsalzlösung + Tween 20) 3x. Plus 5% BSA (Rinderserumalbumin) in TBST-Lösung zum Blockieren. </li><li> Inkubieren Platte bei RT für 2 Stunden und dann mit TBST 3x waschen. </li><li> Machen primären Antikörper DILUTIonen in 5% BSA in TBST (siehe Tabelle der Materialien) und fügen Sie 10 ul /. Inkubieren Platte bei RT für 2 Stunden, und dann waschen 3x mit TBST. </li><li> Machen sekundären Antikörper dilutionin 5% BSA in TBST (siehe Tabelle der Materialien) und fügen Sie 10 ul /. </li><li> Inkubieren Platte im Dunkeln bei RT für 2 Stunden und dann zweimal mit TBST waschen. </li><li> Verdünnungen für Hoechst und Phalloidin (siehe Tabelle der Materialien) in PBS und fügen Sie 10 ul /. </li><li> Die Platte in der Dunkelheit für 30 min bei RT. </li><li> Nach 2 TBST Waschanlagen, Deckplatten in Folie und bei 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Imaging Erwerben Sie Bilder mit Hilfe eines Epifluoreszenzmikroskop mit einem 20fach-Objektiv mit 1x1 Binning-Kamera. Erwerben sechzehn Bilder für jeden gut, für insgesamt 480 Bilder (x3 Kanäle). </li></ol> 2. Analyse Images Downloaden und installieren Sie PhenoRipper von phenoripper.org und starten PhenoRipper um die Analyse der ima beginnenges. PhenoRipper unterstützt derzeit TIFF, PNG und JPEG und alle anderen von MATLAB unterstützten Formate (Mikroskop-Software unterstützen in der Regel den Export in TIFF). 2.1 Laden von Daten <ol><li> Kein Standard-Namens / Organisation Konvention für Mikroskopie-Bilder, die das Laden von Bildern und Zuordnen von Metadaten machen existiert (dh experimentellen Annotation wie Art der Behandlung, gut Nummer und so weiter) der schwierigste Teil des Workflows. Wählen eines der vorgestellten Verfahren (unten beschrieben). <ol><li> PhenoLoader: Wählen Sie diese Option, um semi-automatisch zu laden, Daten, wenn der Dateiname und / oder Verzeichnisstruktur enthält genügend Informationen, um Gruppenbilder wie gewünscht (zB B16 HeLa_Drug5-DAPI.png könnte darauf hindeuten, dass das Bild von gut B16, werden die Zellen behandelt mit der Droge, deren ID 5, und das Bild fängt die Kern DAPI-Färbung - mit dieser Namenskonvention konnten alle Bilder von A1 oder auch mit Medikamenten behandelt, 5 leicht zusammengefasst werden). Der Assistent wirdführen den Benutzer Schritt für Schritt, um Metadaten mit Bildgruppen zuordnen und definieren die Marker wie folgt: <ol><li> Klicken Sie auf &quot;Dateistruktur&quot;, um zum Fenster PhenoLoader zugreifen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Definieren Root Directory&quot;, um das Verzeichnis, das die Bilddatensatz zu wählen. Dann für die Analyse (optional, kann leer gelassen werden) die Dateien auswählen, die nicht verwendet werden (nicht verwendete Dateien). </li><li> Klicken Sie auf &quot;Definieren Marker&quot;, um die im Experiment verwendeten Biomarker geben und sie mit den Bildern. Insbesondere, klicken Sie auf eine Bilddatei und wählen Sie dann einen Teil des Dateinamens, die die Biomarker eindeutig identifiziert. Schließlich geben Sie einen Namen für die einzelnen Biomarker. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Definieren von Metadaten&quot;, um Informationen mit jedem Bild zuordnen. Insbesondere, klicken Sie auf eine Bilddatei, und wählen Sie dann einen Teil des Dateinamens identifiziert Bildinformationen (zB &quot;B16&quot; für das Wohl Name). Ein Fenster fragt nach einem Gruppennamen (zB &quot;Wirll &quot;) erscheint, geben Sie einen Namen ein. Mitglieder der Gruppe aus dem Dateinamen extrahiert wird auf dem Gruppentisch (gezeigt werden, z. B. die vollständige Liste der gut Namen). Um nicht im Dateinamen vorhanden zusätzliche Informationen hinzuzufügen, klicken Sie auf&quot; (optional) Weiter &quot;. Klicken Sie auf&quot; Hinzufügen von Metadaten-Gruppe &quot;, geben Sie das zusätzliche Gruppennamen (z. B.&quot; Drug &quot;) und für jeden Wert der vordefinierten Gruppe (zB&quot; Gut &quot;), geben Sie seinen Wert (zB&quot; Taxol &quot;) . Es gibt keine Begrenzung für die Anzahl der zusätzlichen Gruppen, die hinzugefügt werden können. </li><li> Anschließend klicken Sie auf &quot;Erstellen MetaDataFile&quot;, um die Metadaten-Datei zu erzeugen, und weiterhin die. Wenn eine Metadatendatei vorher erzeugt wurde, können die oben beschriebenen Schritte durch direkte Laden der Datei mit der Option &quot;Metadaten Datei&quot; (in 3 unten beschrieben) vermieden werden. </li></ol></li><li> Regular Expression Basierend Vorlagen: Reguläre Ausdrücke sind ein Standardansatz für die passenden Musternin Text. Wählen Sie diese Option, wenn der Dateiname und / oder Verzeichnisstruktur enthält genügend Informationen, um Gruppenbilder und die Namenskonvention mit einem der bereits vorhandenen Vorlagen. Benutzerdefinierte Vorlagen basierend auf regulären Ausdrücken können auch manuell definiert und wiederverwendet werden. Diese erweiterte Option ist nur für Benutzer mit regulären Ausdrücken vertraut empfohlen. </li><li> Metadaten Datei: Wählen Sie diese Option für die ultimative Anpassbarkeit. Definieren und laden eine durch Komma getrennte Werte (CSV)-Datei mit Dateinamen und Metadaten mit jedem Bild zugeordnet. Ein Beispiel für das Dateiformat ist auf der Download-Teil der Website (phenoripper.org) zur Verfügung. Laden Sie einfach die Datei über die Schnittstelle, um die darin enthaltenen Informationen anzuzeigen. </li></ol></li><li> Wählen Sie das Feld Metadaten, die Wiederholungen definiert, in dem Versuch, um redundante Probenahme zu vermeiden. Für Datensätze, die Wiederholungen (zB alle Bilder in einem gut ähnlich sein sollten) enthalten, zusammen Gruppierung (zB durch gut) kann improve Leistung. In den meisten Fällen ist es sinnvoll, die Standardoption &quot;Random (weiß nicht)&quot;, die eine Teilmenge wählt zufällig zu wählen. </li></ol> 2.2 Einstellen von Analyseparametern Klicken Sie auf &quot;Set Parameter&quot;, die erforderlich ist, um die Datenmenge zu verarbeiten Parameter definieren. Die Parameter zu definieren, sind auf der linken Seite durch. Das rechte Bild zeigt eine zusammengeführte Stichprobe des Datensatzes. Klicken Sie auf die Pfeile links / rechts, um zwischen den verschiedenen Bildern zu wechseln. <ol><li> Threshold Intensität: Wählen Sie einen geeigneten Schwellenwert auf rund identifizieren die Zellbereiche (statt der Hintergrund, zellulären Regionen) der Bilder. Ein Schwellenwert wird durch PhenoRipper vorberechnet, kann aber angepasst werden, um Hervorhebung von Zellregionen zu verbessern mit Hilfe der Bildlaufleiste auf der Oberseite des Bild werden. Wenn eine gewählte Schwelle nicht auf allen Bildern zu arbeiten, die Schwelle so zellulären Regionen anstatt abzufallen zellulären Regionen zu schließen. </li><li> Block-Size: Wählen Sie eine geeignete Blockgröße (in Pixeln) der Netz das Bild. Blöcke der bestimmten Größe auf dem Bild überlagert werden. Passen Sie die Blockgröße auf einen Durchschnitt von 20 bis 30 Blöcke / Zelle zu erhalten. Um das Gitter auf das Bild, klicken Sie auf das Kästchen vor dem Feld &quot;Block Size&quot; überlagern. </li><li> Optionale Parameter: Wenn die Auto-skalierte Bilder nicht Marker mit der gewünschten relativen Intensitäten (zB eine Farbe gesättigt ist) anzeigen oder wenn Markierungen müssen von der Analyse fallen gelassen werden, verwenden Sie das &quot;Anpassen Kanal Intensity&quot;-Option. Um zelluläre Regionen identifizieren auf einer Teilmenge von Markern benutzen Sie die &quot;Kanäle für Threshold verwendet&quot;-Option. Standard-Optionen der anderen Parameter sind in der Regel ausreichend, aber wenn nötig, mit Hilfe der &quot;Advanced Analysis Options&quot; anpassen. </li><li> Führen Sie die Analyse durch Drücken von &quot;PhenoRip&quot; auf der Hauptplatte. PhenoRipper automatisch wiederkehrende Blocktypen in den Bildern zu identifizieren. Phänotypische Profile werden für erzeugt werdenjedes Bild auf der Basis der Anteile der verschiedenen Blocktypen darin. </li></ol> 3. Explo Ergebnisse <ol><li> Entdecken Sie die Beziehungen zwischen den phänotypischen Profile der Bilder mit der PhenoBrowser (Abbildung 1). Die PhenoBrowser Schnittstelle besteht aus vier Tafeln: die linke obere Platte ist eine grafische Darstellung (Streudiagramm) der relativen Ähnlichkeit zwischen verschiedenen Bilder / Bedingungen, die beiden Platten auf der rechten Display-Beispiel-Bilder von ausgewählten Bedingungen und der abschließenden Podiums (Balkendiagramm ) vergleicht deren phänotypische Profilen. </li><li> &quot;Verwerfen Leere Frames&quot; über das Menü &quot;Datenverarbeitung&quot;. </li><li> Entfernen Bildern schlechter Qualität: Erstens, um zu studieren einzelne Bilder auszuschalten Gruppierung aus dem Menü &quot;Datenverarbeitung&quot;. Weiter, klicken Sie durch die Ausreißerpunkte in der Punktwolke und entsorgen Bilder von niedriger Qualität (zB unscharf, Artefakt-Färbung). </li><li> Entdecken Sie die Daten: Entscheiden Sie, welche Metadaten-Feld definierteine Grundeinheit des Vergleichs (zB Medikamente vergleichen, Bilder mit dem gleichen Wert des Feldes Metadaten &quot;Arzneimittel&quot; müssen zusammen gruppiert werden). Alles Bilder mit dem gleichen Wert dieses Metadatenfeld in einem einzigen Datenpunkt mit &quot;Group By&quot;. So wird beispielsweise Gruppierung von Drogen die Bilder innerhalb jedes Medikament durchschnittlich einen Punkt pro Medikament zu erhalten. In der Nähe (oder fernen) Punkte in der Punktwolke reflektieren Bedingungen, die ähnlich (oder unähnlich) zellulären Phänotypen hervorrufen. Farbe oder Etikett Punkte (Datenanzeige-Menü) auf der Grundlage verfügbarer Metadaten Interpretierbarkeit unterstützen. Die 3D-Darstellung ist durch Klicken auf das &quot;drehbar&quot; Kontrollkästchen, und klicken Sie auf die linke Taste und Ziehen mit der Maus über sie drehbar. </li><li> Wählen Sie zwei verschiedene Punkte, um sie direkt zu vergleichen. Die Bildtafeln werden Beispielbilder für jeden Punkt anzuzeigen, und das Balkendiagramm Panel werden die Blocktypen, deren Auftreten Frequenzen sind die meisten Unterschiede zwischen den beiden Punkten zu zeigen. </li><li> Starten Sie die clustergram von der &quot;Clustergram Menü&quot;, um eine globale Sicht der Beziehung zwischen Satzarten und experimentellen Bedingungen. Durch das Gruppieren beide Blocktypen und Bedingungen, hebt diese Darstellung der zellulären Phänotypen, die am besten zu unterscheiden Gruppen von Bedingungen (Abbildung 5). </li></ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebene Workflow ermöglicht eine schnelle und einfache Charakterisierung und Vergleich der Mikroskopie-Bilder. Wir haben zuerst gezeigt, wie dieser Workflow kann Experiment Optimierung, beispielsweise helfen, indem sie schnell die Qualitätskontrolle auf Mikroskopie-Aufnahmen. Weiter haben wir gezeigt, das Potential für die Analyse von Hochdurchsatz-Screening-Daten: Wir konnten Gruppe Medikamente auf ihren Wirkmechanismus. Die Gruppierung von Medikamenten vergleichbar war gefunden mit komplexeren Methoden 6, obwohl PhenoRipper war Grßenordnungen schneller. Obwohl wir diesen Ansatz robust gegen sporadische experimentellen Schwankungen gefunden haben, als mit jedem Bild basierten Ansatz wird Anzeigen durch die systematische nichtbiologischen Effekte beeinflusst sein. Zum Beispiel kann die Platte zu Platte Variation Marker Intensität die biologischen Effekte von Interesse maskieren. Die Auswirkungen derartiger Artefakte können durch entsprechende Korrekturen 7, 8 reduziert, wie pspät, um Platte Normalisierung und Hintergrund-Subtraktion. Die von PhenoRipper erzeugten Profile können auch durch Änderungen in der Zelldichte beeinflusst werden. Während dieses Verhalten ist in der Regel erwünscht (reflektierend Überleben oder Wachstum), kann seine Wirkung durch un-Auswahl der Option &quot;Hintergrund-Informationen&quot; unter &quot;Erweiterte Parameter&quot; reduziert werden. Bei der Wahl der geeigneten Methode für die Analyse, müssen die Benutzer den Kompromiss zwischen Geschwindigkeit, Benutzerfreundlichkeit und das Niveau der analytischen Detail zu betrachten. Segmentierung freie Verfahren wie PhenoRipper 9-11 sind in der Regel schneller und einfacher zu bedienen als einzelne Zell-basierte Methoden wie CellProfiler 2. Der Nachteil der Segmentierung freie Verfahren ist die Unfähigkeit, bestimmte Einzelzelleigenschaften zu quantifizieren. Der Benutzer muss daher auf die entsprechende Ansatz, der auf seine oder ihre Bedürfnisse zu entscheiden. Wenn genauer Vergleich oder Gruppierung der Versuchsbedingungen ist das Hauptziel haben wir gefunden, dass die Höhe derDetail PhenoRipper gefangen ist mehr als ausreichend. Insbesondere untersuchten die Forscher Hochdurchsatz-Experimente werden stark von der Fähigkeit, die Bilddaten schnell und einfach zu erkunden profitieren. Abschließend wird die hier vorgestellte Workflow ermöglichen Bank Wissenschaftler leicht nach Erwerb erkunden ihre Fluoreszenzmikroskopiebilder und bald einen schnellen Turn-around zu erleichtern zwischen Analysen und Bildgebung. Wir glauben, dass dieser Workflow wird die Barriere der Durchführung quantitativer Bildanalyse senken.

In den vergangenen zehn Jahren haben rasche Fortschritte in der Bildgebung Technologie viele Labors angesichts der Möglichkeit, Hochdurchsatz-Mikroskopie durchzuführen. Die Herausforderung ist nun von einer der Abbildungs ​​einem der Analyse verschoben. Wie können wir zu charakterisieren, zu vergleichen, und erkunden Sie die Flut von komplexen und doch subtil Phänotypen durch eine typische Hochdurchsatz-Imaging-Bildschirm erzeugt? Eine Reihe von Bildanalyse-und Informatik-Plattformen haben die Nutzer anspruchsvolle Toolboxen 1-3 für das Extrahieren von Informationen aus großen biologischen Sammlungen von Bildern gegeben. Doch viele bleiben erhebliche Hindernisse bei der Analyse von Daten aus Hochdurchsatz-Image-basierte Bildschirme. Schwierigkeiten mit der Auswahl geeigneter Charakterisierungen der Bilder und die Feinabstimmung der algorithmischen Parameter (zum System der Zinsen) beteiligt oft in langen Rüstzeiten, insbesondere für Anwender ohne Bildanalyse-Know-how führen. Insbesondere Zellsegmentierung, der Prozess der Identifizierung von Einzelzellen imBild n, ist ein Engpass in dieser Hinsicht. Segmentierung kann sehr empfindlich auf experimentellen Parameter wie Zelltyp, Zelldichte und Biomarker sein und erfordert häufig wiederholte Einstellung für eine große Datenmenge. Aus diesen Gründen ist die Bildanalyse häufig eine unabhängige Terminal Schritt durch Spezialisten und nicht integrierter Bestandteil des Versuchsablauf durchgeführt. Dies schließt die schnelle Feedback-Zyklus zwischen Analyse und Experiment, ein entscheidender Teil der Assay-Entwicklung. Hier beschreiben wir einen alternativen Workflow, der für Hochdurchsatz-Fluoreszenz-Mikroskopie optimiert ist und vermeidet viele der oben genannten Schwierigkeiten. Dazu nutzen wir PhenoRipper 4, einem Open-Source-Software-Plattform für die schnelle Erforschung und Analyse von Mikroskopie-Bilder. Bezeichnenderweise PhenoRipper vermeidet viele der Herausforderungen, mit Zell Segmentierung nach nicht versuchen, einzelne Zellen zu identifizieren beteiligt. Stattdessen teilt PhenoRipper Bilder in PixelBlöcke von subzellulären Größe und charakterisiert Bilder in Bezug auf die Blöcke, die sie enthalten. Insbesondere PhenoRipper Profile Blöcke in Form von Marker-Kolokalisation-basierten Funktionen und identifiziert vier repräsentativsten Blocktypen in den Trainings Bilder automatisch ein. PhenoRipper ordnet dann jedem Block am ähnlichsten repräsentatives Blocktyp und schließlich charakterisiert Bilder basierend auf den Typen der Blöcke, die sie enthalten. Im Vergleich zu herkömmlichen Single-Cell-basierte Ansätze erfordert dieser Ansatz minimale Feinabstimmung und Know-how. Als solche müssen die Anwender lediglich zwei Parameter: die Blockgröße und eine Schwellenintensität (bis zellulären Teile eines Bildes zu verwerfen), die beide mit grafische Rückmeldung gesetzt. Wichtig ist, dass die hier beschriebene Arbeitsablauf hat sich gezeigt, 4 leicht, viel größere Datenmengen, bei denen die Geschwindigkeit und minimale Feinabstimmung bietet große Zeitgewinne und Zuverlässigkeit zu skalieren. In der Praxis finden wir, dass diese AppPlötze reduziert die Zeit sowohl für das Setup und läuft durch mehrere Größenordnungen 4 erforderlich. Die primäre Ausgabe des PhenoRipper ist eine visuelle Darstellung von Bildähnlichkeit, die dem Benutzer ermöglicht, Gruppen von Versuchsbedingungen, die Zellen zu ähnlichen Phänotypen führen anzuzeigen identifizieren. Die Gruppierungen PhenoRipper findet typischerweise vergleichbare &quot;biologische Interpretierbarkeit&quot; zu den von zeitaufwendiger, zellbasierte Verfahren 4 erzeugt. In der Praxis bedeutet dies, dass häufig innerhalb einer halben Stunde von der Durchführung einer typischen 96-Well-Fluoreszenzmikroskopie Experiment, ein Experimentator ohne vorherige Bildanalyse-Erfahrung kann eine zuverlässige Anzeige über die Leistung seines Experiments zu bekommen. Der Experimentator kann dann beginnen die Erkundung der Beziehungen zwischen den verschiedenen Versuchsbedingungen und in Bezug auf diese Beziehungen Bild Phänotypen. Wir zeigen diesen Workflow hier durch die Analyse der Auswirkungenvon Drogen in verschiedenen mechanistischen Klassen auf HeLa-Zellen für die DNA-und Zytoskelett-Marker gefärbt. Bilder von Zellen mit der gleichen Klasse von Medikamenten behandelt wurden, zusammengefasst und schlechte Bildqualität (Artefakte Färbung, unscharf Zellen und so weiter) erschien als Ausreißer, so dass sie leicht zu identifizieren und möglicherweise verwerfen. Während dieser Arbeitsablauf ist für eine große Anzahl von bildbasierten Assays, sind offensichtlich viele Situationen, in denen ein anderer Ansatz könnte informativer. Zum Beispiel ist der Ausgang von PhenoRipper hauptsächlich ein relativer Vergleich der Fluoreszenzmuster in den experimentellen Bedingungen. Wenn ein Absolut Charakterisierung eines bestimmten Einzelzellan anstelle erforderlich ist (zum Beispiel die Anzahl der Flecken in einer Zelle) würde eine Einzelzell-basierte Analyse erforderlich. Dennoch, auch in dieser Art von Situation ist PhenoRipper wahrscheinlich Veränderungen in diesen Einzelzellen-Phänotypen erkennen und daher ein nützliches Instrument zur Analyse opti seinmierung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="855">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11965</td>
			<td style="width:404px;">High Glucose, L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Marker Hoechst 33342</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H1399</td>
			<td style="width:404px;">DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Marker phalloidin-Alexa488</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Primary Antibody &#945;-tubulin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T9026</td>
			<td style="width:404px;">Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td>
			<td style="width:116px;">Jackson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">115-025-166</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Aldosterone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apicidin</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Colchicine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.16 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cortisol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Docetaxel</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M344</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS-275</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prednisolone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RU486</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scriptaid</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :70 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taxol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinorelbine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images

Trotz der raschen Fortschritte in der Hochdurchsatz-Mikroskopie, quantitative Bild-basierte Assays stellen immer noch erhebliche Herausforderungen. Während eine Vielzahl von Fachbildanalyse-Tools zur Verfügung, die meisten traditionellen Bild-Analyse-basierte Workflows haben steile Lernkurven (für die Feinabstimmung der Analyse-Parameter) und führen zu langen Laufzeiten zwischen Abbildung und Analyse. Insbesondere Zellsegmentierung, der Prozess der Identifizierung einzelner Zellen in einem Bild ist ein Flaschenhals in dieser Hinsicht. Hier präsentieren wir Ihnen eine alternative, zellfreie Segmentierung Workflow basierend auf PhenoRipper, einem Open-Source-Software-Plattform für die schnelle Analyse und Exploration von Mikroskopie-Aufnahmen ausgelegt. Die hier vorgestellte Pipeline für Immunfluoreszenz-Mikroskopie-Aufnahmen von Zellkulturen optimiert und erfordert nur minimale Benutzereingriffe. Innerhalb einer halben Stunde können PhenoRipper Daten aus einer typischen 96-Loch-Experiment analysieren und Bildprofile. Benutzer könnendann visuell ihre Daten zu erforschen, führen die Qualitätskontrolle auf ihren Versuch sicherzustellen, Reaktion auf Störungen und überprüfen Reproduzierbarkeit der Wiederholungen. Dies ermöglicht eine schnelle Feedback-Zyklus zwischen Analyse und Experiment, das während der Assay-Optimierung entscheidend. Dieses Protokoll ist nützlich, nicht nur in einem ersten Pass-Analyse für die Qualitätskontrolle, sondern kann auch als End-to-End-Lösung verwendet werden, insbesondere für das Screening. Die hier beschriebene Arbeitsablauf skaliert, um große Datenmengen, wie sie durch Hochdurchsatz-Screens erzeugt und wurde zur Gruppe experimentellen Bedingungen Phänotyp genau über einen weiten Bereich von biologischen Systemen gezeigt worden. Die PhenoBrowser Schnittstelle bietet eine intuitive Rahmen, um die phänotypische Raum zu erkunden und beziehen Bildeigenschaften, biologische Anmerkungen. Zusammengenommen wird die hier beschriebenen Protokoll, die Hindernisse für die Annahme quantitative Analyse von Bild-Screens senken.

Hier testeten wir die Fähigkeit dieses Workflow Gruppe Medikamente auf ihren Wirkmechanismus. HeLa-Zellen wurden in 30 Wells einer 384-Well-Platte ausgesät und DNA / Aktin / α-Tubulin gefärbt. Die spezifischen primären Antikörper, fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper und andere Fluoreszenzfarbstoffe, die verwendet wurden, sind in Tabelle aufgeführten Materialien. Wells wurden mit 15 Drogen zu drei mechanistische Klassen (Histon-Deacetylase-hemmende, Mikrotubuli-Targeting und DNA-schädigende) für 24 h und abgebildet mit einem Epifluoreszenzmikroskop bei 20X Objektivvergrößerung gehört, behandelt. Sechzehn Bilder wurden für jede gut erworben, für insgesamt 480 Bilder (x3 Kanäle). Die hier beschriebenen Daten können von www.phenoripper.org heruntergeladen werden. Wie oben beschrieben, wurde PhenoRipper verwendet, um diese Bilder zu analysieren. Der Vordergrund Schwelle wurde auf 5% (dh 5% der maximal möglichen Intensität) und die Blockgröße auf 20 Pixel (Figur eingestellt<html> e 2). Die Analyse dieses Datensatzes dauerte etwa 10 Minuten auf einem Standard-Desktop-Computer (64-Bit-, 8-Core-Maschine mit 3,2 GHz mit 16 GB RAM). Die PhenoBrowser Schnittstelle (Abb. 3) wurde verwendet, um die Ergebnisse zu untersuchen. Imaging-Artefakte wie schlechte Färbung und leere Rahmen waren leicht zu identifizieren, da sie stand als klare Ausreißer (Abbildung 4). Die relativen phänotypischen Ähnlichkeiten zwischen den Bildern werden in der oberen linken Teil von Abbildung 3 mit multidimensionalen Skalierung visualisiert. Jeder Punkt repräsentiert ein einzelnes Bild von der eigenen Medikamentenwirkmechanismus gefärbt. Dieser Plot zeigt, dass die phänotypische Profile können Gruppen von Medikamenten ihres Wirkmechanismus verwendet werden. Ein clustergram der Daten (Fig. 5) bezieht sich diese Anordnung auf die phänotypische Profile. s/ftp_upload/51280/51280fig1.jpg &quot;width =&quot; 600px &quot;/&gt; Fig. 1 ist. Workflow für die Fluoreszenzmikroskopie mit PhenoRipper. Zelllinien sind in einer Platte ausgesät, dann werden Störungen in jede Vertiefung gegeben und die Platte wird inkubiert. Die Bilder werden mit einem automatisierten Mikroskop erworben und dann schnell mit PhenoRipper analysiert. So werden Ergebnisse der aktuellen Experiment kurz nach Bildgebung bekannt und können, falls erforderlich, verwendet, um das Setup für künftige Iterationen verfeinern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51280/51280fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51280/51280fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51280/51280fig2.jpg" width="600px" /> 2. Einstellen PhenoRipper Parameter: Blockgröße und Schwellenintensität sind über eine grafische Oberfläche mit Echtzeit-visuelle feedbac eingestellt<html> k. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51280/51280fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51280/51280fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51280/51280fig3.jpg" width="600px" /> 3. PhenoBrowser Schnittstelle für PhenoRipper Ergebnisse zu entdecken: PhenoBrowser Schnittstelle ist in vier Bereiche unterteilt: die linke obere Panel ist ein Streudiagramm die Anzeige der relativen Ähnlichkeiten zwischen verschiedenen Bilder / Bedingungen, die zwei Platten auf der rechten Display-Beispiel-Bilder von ausgewählten Bedingungen und der linken unteren Panel vergleicht deren phänotypische Profilen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51280/51280fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . load/51280/51280fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51280/51280fig4.jpg &quot;width =&quot; 600px &quot;/&gt; 4. Beispiel für einen Ausreißer in der Punktwolke (markiert), die ein Artefakt-Färbung (siehe Video). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51280/51280fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51280/51280fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51280/51280fig5.jpg" width="600px" /> 5. Clustergram Darstellung PhenoRipper Profilen: Jede Zeile steht für ein einziges Medikament, und jede Spalte ein Bausteintyp. Die Grauwerte spiegeln die phänotypische Profile, also der Anteil der verschiedenen Blocktypen für jede Droge. Ein Feuerzeug Wert bezeichnet eine höhere Bruchteil dieser Blocktyp. Hierarchical Clustering der verschiedenen Drogen durch Drogenklasse (rot / blau / gr weitgehend trennteen Farbe auf der rechten Seite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51280/51280fig5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

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Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Hier beschreiben wir einen Arbeitsablauf für die schnelle Analyse und Erforschung von Sammlungen Fluoreszenzmikroskopiebilder mit PhenoRipper, eine kürzlich entwickelte Bild-Analyse-Plattform.

Schnelle Analyse und Exploration von Fluoreszenzmikroskopie Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

rapid-analysis-and-exploration-of-fluorescence-microscopy-images

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Aufrufe.  UT Southwestern Medical Center.  Hier beschreiben wir einen Arbeitsablauf für die schnelle Analyse und Erforschung von Sammlungen Fluoreszenzmikroskopiebilder mit PhenoRipper, eine kürzlich entwickelte Bild-Analyse-Plattform. 

Serie: Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Forschung

Biologie

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Zell Elektroschweißmuffe Visualisierte mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Ein analytisches Werkzeug, das zelluläre Morphologie Änderungen von Dreidimensionale Fluorescence Images Quantifiziert

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Die Analyse der Autophagie in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Mithilfe von Starvation Pads in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

Identifikation von Kinesin-1 Cargos Mit Fluoreszenzmikroskopie

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source High Content Analyse Unter Verwendung Automatische Fluorescence Lifetime Imaging Mikroskopie

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Oligomerisierungsdynamik von Zelloberflächenrezeptoren in lebenden Zellen durch totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie kombiniert mit Zahlen- und Helligkeitsanalyse

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...