Wir sind dankbar, dass unsere Mitarbeiter Knut Holthoff, Arthur Konnerth und Marco Canepari, die in der Anfangsphase der Entwicklung dieser Technik sowie Leslie M. Loew für die freundliche Bereitstellung Farbstoffe teilgenommen. Unterstützt durch NSF IOS-0817969, NIH Zuschüsse NS068407 und M136043 und Kavli Institute for Neuroscience an der Yale University.

Ein. Aufstellbedingungen Schritt 1.1. Imaging Setup Der Schlüssel zur Aufzeichnung Spannung Farbstoff Signale entsprechende Setup-Design. Wir verwenden eine aufrechte Mikroskop (BX51WI Olympus oder Zeiss AxioExaminer) mit drei Kameras ausgestattet. Das Setup wird für die Beleuchtung von einzelnen Neuronen in Hirnschnitten von Anregungslicht in Auflicht-Fluoreszenz, Weitfeldmikroskopie-Modus entweder mit Nikon 60X/1.0 NA oder Zeiss 63X/1.0 NA Wasser Eintauchen Ziele entwickelt. Unsere Mikroskope sind eine Schwingungsisolierung Tisch verschraubt und mit motorisierten beweglichen Stufen. Jedes Mikroskop ist mit drei Kamera-Anschlüssen ausgestattet. Eine Kamera Port verfügt über eine Standard-hohe räumliche Auflösung CCD-Kamera für die Infrarot DIC Video-Mikroskopie (IR-1000, Dage MTI, USA). Die zweite Kamera Port verfügt über eine schnelle Datenerfassung Kamera (bis zu 20 kHz Bildrate) mit relativ geringer räumlicher Auflösung (80 x 80 Pixel), sondern herausragende Dynamik (14 Bit) und außergewöhnlich niedrigen lesenRauschen (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). Die dritte Kamera Port verfügt über eine CCD-Kamera mit hoher Ortsauflösung (pixelfly, 1392x1024 Pixel, PCO AG, Deutschland) auf einem Spinning-Disc konfokalen Scanner (CSU-10, Yokogawa, Japan) verwendet werden, um z-Stacks konfokaler Bilder für sammeln montiert detaillierte morphologische Rekonstruktion des gefärbte Zelle. Ein frequenzverdoppelter diodengepumpten Nd: YVO4 Dauerstrichlaser (400 mW) Emission bei 532 nm (MLL-III/400 mW; CNI, Changchun, China) ist die Quelle des Anregungslichts. Das 2 mm Durchmesser Laserstrahls gated durch einen Verschluss (LS6; Vincent Associates) mit einem Lichtleiter, der mit dem Mikroskop über einen Single-Port Epifluoreszenz Kondensator (TILL Photonics GmbH, Gräfelfing, Deutschland) entwickelt, um die hintere Öffnung des überfüllen gerichtet Ziel und sorgen für eine nahezu gleichmäßige Beleuchtung der Objektebene. Das Laserlicht wird an Stelle eines herkömmlichen Xenon-Bogenlampe, die Empfindlichkeit der V m-Bildgebung durch Maximierung verwendet: (1) unter Verwendung eines monochromatischen exEntgegenhaltung Licht am roten Flügel des Absorptionsspektrums zu V m Empfindlichkeit des Farbstoffes 9, 10 und (2) Erhöhung der Intensität des Anregungslichtes hinter der Ebene, die durch eine Bogenlampe erreicht werden kann maximieren. Das Anregungslicht war der Vorbereitung durch einen dichroitischen Spiegel mit einer zentralen Wellenlänge von 560 nm und die aufgezeichneten Fluoreszenzlicht wurde durch ein 610 nm-Sperrfilter (a Schott RG610) geleitet reflektiert. Die kombinierte Wirkung einer Erhöhung der Lichtintensität und der Verwendung von nahezu optimalen monochromatischen Anregungswellenlängen eine dramatische Verbesserung der Empfindlichkeit von Spannung Bildgebung durch einen Faktor von ungefähr 50 gegenüber vorherigen Messungen 6. Schritt 1,2. Stellen Sie für eine gleichmäßige Ausleuchtung Verwenden Sie ein Fluoreszenz-Dia-Standard (Grünanregung / rote Emission). Setzen geeigneter Neutralfilter im Laserstrahlengang so dass die CCD nicht gesättigt ist. Konzentrieren Sie sich das Ziel auf der Oberflächeder Schieber. Die Position des empfangenden Ende des Quarz-Lichtleiter vor dem Laser Trägerrakete Ziel, und die Position des Ausgangsendes des Lichtleiters an dem Mikroskop unter Verwendung geeigneter Stellglieder auf der Epi-Fluoreszenz Kondensator zu erreichen zentrierte und gleichmäßige Ausleuchtung des Sichtfeldes. Schritt 1,3. Bestimmen Vibrationsgeräusche Legen Sie eine kleine schwarze Tinte Markierung auf der Oberfläche der Fluoreszenz Folie. Rekord Lichtintensität mit NeuroCCD im kontinuierlichen Aufnahmemodus. Konzentrieren Sie sich das Ziel auf einem dunklen Rand der schwarzen Tinte Marke. Aufzeichnung der Lichtintensität für etwa 100 ms bei 2 kHz Bildrate. Anzeigen des räumlichen Durchschnitt der fraktionierten Lichtintensität Spuren (AF / F) von ~ 20 Pixel Empfangen von Licht von dem gleichförmig beleuchteten Bereich und von ~ 20 Pixel entlang der Kante der Tintenmarkierung. Der Überschuss Rauschen in Aufnahmen von Pixel mit hohem Kontrast Kanten spiegelt die Vibrationsgeräusche indas System. Schritt 1,4. Schwingungsisolierung Es ist zwingend erforderlich, um Schwingungen mittels eines vibrationsfreien Isolierungstafel auf ein Niveau unterhalb der Schrotrauschen auf Lichtintensitäten vergleichbar experimentellen Aufnahmebedingungen reduzieren. Einstellen der Schwingungsisolierung Tabelle, bis die Vibrationsgeräusche in der Lichtintensität von Pixeln für den scharfen Rand des Bildes ist vernachlässigbar. Keines der Geräte mit beweglichen Teilen (mechanische Shutter, Lüfter) kann auf dem Tisch montiert werden. Die Kabel von der Ausrüstung auf dem Tisch befestigt zu anderen Bauteilen, die nicht vom Vibrationen isoliert sind, müssen so lose sein, dass sie nicht übertragen mechanische Schwingungen auf das Mikroskop. 2. Die Auswahl eines geeigneten Neuron für V m-Imaging Schritt 2.1. Auswahl von Neuronen Machen Hirnschnitten nach Standardverfahren. Verwenden Sie eine Maus exprimiert, EGFP in einzelnen Nervenzellen interest. Mit einer drehenden Scheibe konfokale System, visualisieren EGFP markierten Neuronen in der Schicht. Wählen Neuronen für V m-Bildgebung mit intakten dendritische / axonalen Bäumen und mit Prozessen, die parallel und nahe an der Oberfläche der Scheibe. Dies kann nicht in Wildtyp-Mäusen erreicht werden, da Axonen und Dendriten dünne, zum größten Teil nicht sichtbar sind DIC Mikroskopie Modus. 3. Lädt Neuronen mit Spannung Farbstoff Schritt 3.1. Füllen des Patchpipette Füllen Glas Patch-Pipetten von der Spitze mit wasserlöslichen freien intrazellulären Lösung durch Anlegen von negativem Druck für etwa 15 s bis zu 2/3 der Elektrode verjüngt. Der Farbstoff freie Lösung in der Spitze ist notwendig, um den Austritt von Farbstoff auf der Scheibe, die die Hintergrund-Fluoreszenz erhöht und reduziert Signal-Rausch-Verhältnis zu verhindern. Back-füllen die Elektrode mit der Lösung, die die Membran durchdringen kann spannungsempfindlichen Farbstoff gelöst JPW3028der intrazellulären Lösung (0,8 mM). JPW3028, das erfolgreichste Spannungssonde für intrazelluläre Anwendung ist ein zweifach positiv geladene Analogon des ANEP Serie lipophiler Styrylfarbstoffen, die noch ausreichend wasserlöslich, um für die Mikroinjektion verwendet werden. Die Di-Ethyl analogen dieses Farbstoffs hat praktisch identische Eigenschaften (einschließlich spannungsgesteuerten Empfindlichkeit) und ist im Handel als JPW1114 (siehe Tabelle 1). Wir bereiten 20 mM Stammlösung in destilliertem H 2 O. 50 ul Aliquots der Stammlösung werden eingefroren bei -20 ° C. Für die endgültige Farbstoffkonzentration von 0,8 mM, wurde mit 2 ul der Stammlösung in 50 ul intrazellulären Lösung auf dem Tag des Experiments gelöst. Die Aktie Farbstofflösung ist stabil und kann bei Raumtemperatur für mehrere Monate aufbewahrt werden. So halten wir ein 50 ul Aliquot bei Raumtemperatur, bis es aufgebraucht ist. Schritt 3,2. Stellen Sie eine Giga-Dichtung schnell <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Patch eine vorher eingestellte Neuron und erlauben die freie Diffusion des Farbstoffes aus einer somatischen Patchpipette dem Soma in der whole-cell-Konfiguration für 20-45 min. Es ist wesentlich, um eine Dichtung so schnell wie möglich zu erhalten, so dass die Menge an Farbstoff-freie Lösung in der Spitze klein gehalten werden kann. Starten Sie durch Üben schnell Patchen ohne Farbstoff in der Elektrode. Anschließend Praxis Patching und Beladung Neuronen mit dem Farbstoff, mit dem Ziel unter Verwendung einer minimalen Menge an Farbstoff-freie Lösung in der Spitze ohne Kontamination der umgebenden Gewebes. Mit der Praxis ist es möglich, eine Dichtung innerhalb von 1-2 min herzustellen. Schritt 3,3. Überwachung des Standes der Färbung Während Farbstoffdiffusion in der whole-cell-Konfiguration, Überwachung des physiologischen Zustands des Neurons durch Aufzeichnen evozierten Aktionspotentialen im Strom-Clamp-Modus. Außerdem überwachen die Menge der Färbung durch Aufzeichnen des ruhenden Lichtintensität (RLI) vom Zellsoma bei einer Bildrate von 2 k<html> Hz und bei einem Bruchteil des vollen Lichtintensität mit Graufilter (wir verwenden 0,04% der Laserlichtintensität von einem Laser 400 mW) eingestellt. Weiterhin den Farbstoff Ladeprozesses, bis der Aktionspotential startet zu verbreitern, in der Regel nach 20 bis 40 Minuten, je nach Größe der Elektrode und Widerstand. Die Verbreiterung des Spike ist völlig reversibel und höchstwahrscheinlich auf kapazitive Last Wirkung der gesättigten Konzentration des Farbstoffes in der somatischen Membran. Die Wellenform der Dorn vollständig wiederhergestellt, nachdem die Farbstoffkonzentration während des Neurons äquilibriert. Schritt 3.4. Entfernen Sie den Farbstoff Elektrode Am Ende der Färbung Zeitraum vorsichtig das Patch-Pipette entfernt vom Soma in Spannungsklammer Konfiguration sichergestellt wird, dass der Übergang von ganzen Zellen, um Outside-Out-Patch-Konfiguration in dem Verfahren erreicht wird. Schritt 3.5. Warten Farbstoffdiffusion ent &quot;&gt; inkubieren Slice für einen zusätzlichen 1,5-2 Stunden bei Raumtemperatur, um die Spannungs-sensitiven Farbstoffs in neuronalen Prozessen zu verbreiten können. Nach einer deutlichen Menge an Farbstoff diffundiert vom Soma in dendritische und axonalen Prozesse, die Wellenform Der AP ist komplett restauriert. 4. Optical Recording Schritt 4.1. Wählen Sie ein zelluläres Kompartiment für die Bildgebung Suchen Sie die soma des gefärbten Neurons unter Schwachlicht Fluoreszenz und re-patch das Neuron mit einem Standard (kein Farbstoff) Patch-Elektrode unter DIC. Visualisieren neuronalen Prozesse unter Schwachlicht bei einer Bildrate von 10 bis 40 Hz in der kontinuierlichen Aufnahmemodus des CCD für spannungsgesteuerten Bildgebung. Reduzieren Sie die Lichtintensität mit Neutralfilter auf das erforderliche Minimum, um das Objekt von Interesse zu visualisieren. Wir nutzen 0,01% der 400 mW Laser-Intensität während der Positionierung des gefärbten Neurons. Mit einem XY-Tisch, positionieren Sie den neuronalen Prozess der Zinsen in ter Mitte der Bildfläche. Schutz der Soma vom Anregungslicht mit dem teilweise geschlossenen Feldblende Iris des Mikroskops. Abschirmung der Soma aus hoher Intensität Anregungslicht wird deutlich verringern die photodynamische Schäden während der Aufnahme. Schritt 4,2 Rekord optische Signale in Bezug auf Membranpotential Transienten Notieren optischer Signale in Bezug auf backpropagated APs in einzelnen dendritischen Verzweigungen. Notieren optischer Signale in Bezug auf APs im Axon. Notieren optischer Signale in Bezug auf backpropagating APs in dendritischen Dornen. Verwenden Bildraten angemessen genaue Rekonstruktion des Signalverlaufs und halten die Aufzeichnungsperioden und Einwirkung hoher Intensität Anregungslicht so kurz wie möglich zu Farbbleichung und photodynamische Schaden zu minimieren. Zum Beispiel prüft der Sequenz von Bildung und Ausbreitung von einzelnen Aktionspotentiale im Axon erfordert Aufzeichnen Perioden von 5-10 msec. Das Anregungslicht intensiviertty während der Aufnahme ist ein Kompromiss zwischen der Signal-zu-Rausch-Verhältnis auf der einen Seite und dem Grad der Farbbleichung und photodynamische Schäden auf der anderen Seite. Wir verwenden 100% der Intensität des 400 mW Laser Aufnahme von langen Abschnitten der Axone, wenn ein Bereich von 300 um im Durchmesser beleuchtet wird. Wenn das Anregungslicht zu einer 30 um Durchmesser Bereich für dendritische Wirbelsäule Bildgebung fokussiert wird, verwenden wir 10-25% der Laserlichtintensität. Die erforderliche Dauer der Aufnahme ist eine wichtige Determinante des optimalen Anregungslichtintensität, kürzere Erfassungszeiträumen ermöglichen höhere Lichtintensitäten. Die optimale Beleuchtungsstärke wird am besten empirisch für jede Präparation und Messung Einstellungen bestimmt. 5. Data Analysis Schritt 5.1. Korrigieren Sie die Rohdaten für bekannte Fehler Die Analyse und Darstellung von Daten wurden unter Verwendung des NeuroPlex Programm (RedShirtImaging) in IDL (ITT Visual Information Solut schriftliche durchgeführtIonen, Boulder, Colorado) und benutzerdefinierte Visual Basic-Routinen. Unter den Bedingungen einer niedrigen Lichtpegeln, wird die Hintergrundfluoreszenz eine wesentliche Determinante des &amp;Dgr; F / F Signalgröße. Die Rohdaten wurden zuerst für diesen Effekt durch Subtraktion der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität Hintergrund aus einem ungefärbten Bereich auf der Scheibe bestimmt korrigiert. Anschließend wurde das Signal Alignment-Software verwendet, um für zeitlicher Jitter in AP Initiation als auch für mögliche kleine Bewegungen der Zubereitung während der Mittelung zu korrigieren. In der Zeitdomäne wurden AP Signale durch Kreuzkorrelation des elektrisch aufgezeichnet APs in jedem Versuch mit dem Referenzsignal am Anfang Mittelung (1B) erworben ausgerichtet. Im räumlichen Bereich wurden Bilder in zwei Dimensionen offline durch Kreuzkorrelation Bild ausgerichtet sind, um für mögliche kleine seitliche Bewegungen der Herstellung zu kompensieren. Die korrekte Fokussierung des Bildes in der z-Dimension wurde vor jedem einzelnen Studie verifiziert; smal<html> l Anpassungen waren oft notwendig. Die räumlich und zeitlich ausgerichteten Signale wurden gemittelt, wie in 1B gezeigt. Langsame Änderungen in der Lichtintensität durch Bleichen des Farbstoffs wurden durch Unterteilen der Daten von einem entsprechenden Dual Exponentialfunktion der Aufzeichnungsgeräte Versuche ohne Stimulierung (1B) abgeleitet korrigiert. Die Wellenform des Signals AP wurde aus einem Satz von Datenpunkten unter Verwendung kubischer Spline-Interpolation, eine stückweise stetige Kurve, die durch jeden Datenpunkt rekonstruiert. Um zu bestätigen, dass die Spannung-empfindlichen Farbstoff Signal Membranpotential spuren ohne wesentliche Verzerrung am Millisekundenbereich wurde die elektrische AP Signal vom Soma zur optischen AP Signal von der benachbarten Axonhügel wie in 3B gezeigt, verglichen. Die beiden Signale sehr eng überlagern, so dass für das Schrotrauschen in optischen Aufzeichnungsmedien. les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Datenanalyse (Animation). (A) Oben: hochauflösende konfokale Abbildung eines gefärbten Neurons mit Axon in Aufnahmeposition. Recording Elektrode Soma und extrazellulären Stimulationselektrode neben basalen Dendriten schematisch dargestellt angebracht. Aktionspotentiale durch extrazelluläre, synaptische Stimulation hervorgerufen. Unten: geringe räumliche Auflösung Fluoreszenzbild des Axons durch CCD verwendet für V m Bildgebung (B) Elektrode Aufnahmen von soma (schwarze Spuren), optische Aufnahmen von AIS (rote Kurven) und von Knoten Ranvier (grün Spuren) erhalten. . Top Spuren: Rohdaten aus 9 Studien zeigen zeitlicher Jitter in AP Initiation. Zweite Reihe von Spuren: zeitlich ausgerichteten Signale. Dritte Reihe von Spuren: gemittelte Signal. Vierte Reihe von Spuren: bleach Korrektur. Bottom Spuren: kubische Spline-Interpolation mit einem Pass zeitliche Glättung.

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Dejan Zecevic erklärt, dass er ein Miteigentümer RedShirtImaging LLC., Ein Unternehmen im High-Speed-, Low Noise CCD-Kameras in Spannungs-empfindlichen Farbstoff Aufnahme verwendet spezialisiert ist. Alle anderen Autoren berichten keine finanziellen Interessen oder potenzielle Interessenkonflikte im Zusammenhang mit der aktuellen Studie.

Dieser Artikel beschreibt ein Spannungs-empfindlichen Farbstoff-Aufnahme Verfahren zur Überwachung der elektrischen Aktivität einzelner Neuronen mit sub-Mikrometer-und Sub-Millisekunden-raumzeitliche Auflösung. Laseranregung bei nahezu optimale Wellenlänge (bezüglich Signalgröße) verbessert die Empfindlichkeit der Aufnahme um einen Faktor von ~ 50 gegenüber früheren Ansätzen. Die aktuelle Empfindlichkeit ermöglicht die Überwachung elektrischer Signale aus allen Teilen der einzelnen Neuronen, einschließlich ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name der Komponente </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Setup-Komponenten </td></tr><tr><td> Aufrechte Mikroskope </td><td> Olympus Inc. </td><td> BX51WI </td><td> Mit drei Kamera-Anschlüsse </td></tr><tr><td> Motorisierte bewegliche Bühne </td><td> Siskiyou </td><td> MXOPi.2 </td><td></td></tr><tr><td> Epi-Fluoreszenz-Kondensator für Olympus BX51 </td><td> TILL Photonics </td><td> 0000-560-11659 </td><td></td></tr><tr><td> Aufrechte Mikroskope </td><td> Carl Zeiss, LLC </td><td> AxioExaminer D1 </td><td> Mit drei Kamera-Anschlüsse </td></tr><tr><td> Motorisierte Top-Platte </td><td> Scientifica Begrenzte </td><td> MMBP </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Epi-Fluoreszenz-Kondensator für Zeiss AxioExaminer </td><td> TILL Photonics </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Data Acquisition Kamera </td><td> RedShirtImaging LLC </td><td> NeuroCCD-SM </td><td> Hohe Geschwindigkeit, niedrige Ausleserauschen </td></tr><tr><td> CCD für IR-DIC </td><td> Dage-MTI </td><td> IR-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning-Disc Konfokale Scanner </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-10 </td><td></td></tr><tr><td> Hohe räumliche Auflösung CCD auf Konfokale Scanner </td><td> PCO AG </td><td> Pixelfly </td><td> 1392x1024 Pixel </td></tr><tr><td> DPSS CW Laser (532 nm) </td><td> CNI Optoelektronik Tech. Co., Ltd </td><td> MLL-III-532 400mW </td><td> Anregungslichtquelle </td></tr><tr><td> Multi-Mode Fiber Launcher </td><td> Siskiyou </td><td> SM-CFT </td><td></td></tr><tr><td> Light Guide </td><td> TILL Photonics </td><td> 0000-515-11524 </td><td></td></tr><tr><td> Verschluss </td><td> Vincent Associates </td><td> LS6 </td><td></td></tr><tr><td> Vibration Isolation Tabelle </td><td> Minus k Technologie </td><td> MK26 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenzien </td></tr><tr><td> Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) </td><td> Life Technologies </td><td> D-6923 </td><td> Spannung Farbstoff </td></tr><tr><td> Crym-EGFP Mauslinie </td><td> GENSAT (MMRRC) </td><td> STOCK Tg (Crym-EGFP) GF82Gsat/Mmcd </td><td> Dünn Ausdruck EGFP in Layer 5 kortikalen Neuronen </td></tr></tbody></table>

voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices

Das Verständnis der biophysikalischen Eigenschaften und funktionelle Organisation der einzelnen Neuronen und wie sie Informationen verarbeiten ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis, wie das Gehirn funktioniert. Die primäre Funktion einer beliebigen Nervenzelle ist, um elektrische Signale, in der Regel von verschiedenen Quellen verarbeiten. Elektrische Eigenschaften neuronaler Prozesse sind außerordentlich komplex, dynamisch und in der allgemeinen Fall unmöglich, in Abwesenheit von detaillierte Messungen vorauszusagen. Um eine solche Messung würde man erhalten, idealerweise gerne in der Lage zu überwachen, an mehreren Standorten, unterschwelligen Ereignisse, wie sie von den Websites der Herkunft auf die neuronale Prozesse und summieren an bestimmten Orten zu Aktionspotential Einleitung beeinflussen reisen. Dieses Ziel wurde in keiner Neuronen aufgrund technischer Einschränkungen von Messungen, die Elektroden beschäftigen erreicht worden. Um diesen Nachteil zu überwinden, ist es höchst wünschenswert, um den Patch-Elektrode Ansatz mit bildgebenden Verfahren, die umfangreiche parallel recordin ermöglichen ergänzengs von allen Teilen eines Neurons. Hier beschreiben wir eine solche Technik - optische Aufzeichnung des Membranpotentials Transienten mit organischen spannungsabhängigen Farbstoffen (V m-imaging) - gekennzeichnet durch Sub-Millisekunden-und Sub-Mikrometer-Auflösung. Unsere Methode basiert auf bahnbrechenden Arbeiten zur Spannungs-sensitive molekulare Sonden 2 basiert. Viele Aspekte der anfänglichen Technologie wurden kontinuierlich über mehrere Jahrzehnte 3, 5, 11 verbessert. Zusätzlich früheren Arbeiten zwei wesentliche Merkmale von V m-imaging dokumentiert. Erstens sind Fluoreszenzsignale linear proportional zu Membranpotentials über den gesamten physiologischen Bereich (-100 mV bis +100 mV, 10, 14, 16). Zweitens, Be-Neuronen mit der Spannung-empfindlichen Farbstoff welche hier (JPW 3028) nicht nachweisbare pharmakologische Wirkungen. Die aufgezeichneten Verbreiterung der Spitze während der Farbstoff Laden ist vollständig reversibel 4, 7. Zusätzlich zeigt experimentelle Hinweise, dass es möglich ist, zu erhalteneine beträchtliche Anzahl (bis zu hundert) von Aufnahmen vor nachweisbare phototoxische Effekte 4, 6, 12, 13. Derzeit nutzen wir die hervorragende Helligkeit und Stabilität einer Laserlichtquelle bei nahezu optimale Wellenlänge, um die Empfindlichkeit des V m-Bildgebungstechnik zu maximieren. Die aktuelle Sensitivität ermöglicht mehreren Standorten optische Aufnahmen von V m Transienten aus allen Teilen eines Neurons, einschließlich Axonen und Axon Sicherheiten, Terminal dendritischen Zweigen, und einzelne dendritische Dornen. Die erfassten Informationen zu Signals Wechselwirkungen kann quantitativ als auch direkt visualisiert in Form eines Films analysiert werden.

Erfolgreiche Konfokalmikroskopie ermöglichen sollten eindeutige Identifizierung von intakten neuronalen Prozesse, die nahe der Oberfläche der Scheibe sind und sich in einer Ebene des Fokus. Die Auswahl von Nervenzellen, die geeignet sind für Spannung Bildgebung vor Spannungs-empfindlichen Farbstoff Belastung ist kritisch. Ein Beispiel von konfokalen Bildern von L5 pyramidalen Neuronen exprimieren EGFP in einer kortikalen slice (Crym transgenen Maus-Linie) ist in Abbildung 2 gezeigt. Axone einzelner N...

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Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Ein bildgebendes Verfahren zur Überwachung des Membranpotentials Änderungen mit sub-Mikrometer-räumlichen und Sub-Millisekunden zeitlicher Auflösung beschrieben. Die Technik, auf Laseranregung von Spannungs-sensitiven Farbstoffen, ermöglicht Messungen von Signalen in Axonen und Axon Kollateralen, Terminal dendritische Äste, und einzelne dendritischen Dornen.

Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

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Research

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Neuroscience

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Serie: Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

DiOLISTIC Labeling von Neuronen aus Nager und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Forschung

Neurowissenschaften

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

Optical Imaging von Neuronen im Crab stomatogastrischen Ganglion mit spannungsabhängigen Farbstoffen

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Morphologische Analyse Drosophila Larven peripheren sensorischen Neuron Dendriten und Axone mit Genetic Mosaike

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von identifizierten Neuronen im intakten Gehirn von transgenen Fischen

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Akute Dissoziation von Neunauge retikulospinale Axone in den Aufnahme von der Trennfläche Membran einzelner Funktions präsynaptischen aktivieren

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Methods Article

Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten