Wir möchten Michael Feyder und Terrell Holloway für ihre Unterstützung anerkennen während der ersten Einrichtung der Technik und Dr. Fumi Ono s Labor für den Zugang zu ihren konfokalen Mikroskop. Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Health durch die intramuralen Programm NIAAA und NINDS finanziert.

1. Vorbereitung DiI / Tungsten Perlen Bullets: DiI (1-1&#39;-Dioctadecyl-3, 3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine Perchlorat) Kugeln sollten im Voraus von Schneid Hirnschnitten vorbereitet werden. Der Eingriff dauert etwa 2-4 Stunden, je nachdem, wie viele Kugeln auf einmal zubereitet. <ol><li> Wenn ausgehend von einer neuen Charge von Wolfram Perlen, bereiten Aliquots von je 300 mg. Aliquots werden durch Aussetzung 6 Gramm Wolfram in 2 ml Methylenchlorid hergestellt. Dann, um Pipette 100 ul der Bead-Lösung in Mikrozentrifugenröhrchen produzieren Aliquots von 300 mg Wolfram Perlen Shop Aliquots bei Raumtemperatur (Hinweis: Methylenchlorid verdampft sehr schnell Alkohol kann auch verwendet werden, zu minimieren Verdunstung werden.)... </li><li> Beim Starten von Aliquots von Perlen, resuspendieren jedem Aliquot (300 mg Wolfram Perlen) in 300 ul Methylenchlorid und Deckel schnell, um Verdunstung zu verhindern. Diese Menge reicht für 3 Chargen von Kugeln. </li><li> Bereiten Farbstofflösung durch Wiegen 13,5 mg lipophiler Farbstoff DiI und das Hinzufügen von 450 ul Methylenchlorid (Endkonzentration = 3mg/100μl). </li><li> Bestreichen Sie die Perlen mit Farbstoff. Legen Sie einen Objektträger aus Glas auf einem Stück Wachs beschichtete wiegen Papier und Pipette 100 ul von Perlen auf die Folie. 100 l von DiI-Lösung, mischen mit Pipettenspitze und an der Luft trocknen, bis Perlen wiederum hellgrau. </li><li> Verwenden Sie eine Rasierklinge abperlt Glasobjektträger abkratzen und in Würfel schneiden die Perlen zu einem feinen Pulver (Hinweis: Verwenden Sie eine neue Klinge, wenn dadurch mehr als eine Farbe der Kugeln, so dass nicht kontaminieren Farbstoffe).. </li><li> Kratzen Perlen auf der Waage Papier und Trichter Perlen in eine 15 ml konischen Rohr. 3 ml Wasser und beschallen im Wasserbad für 10-30 min bei Raumtemperatur (Hinweis: Würfeln des Pulvers und Beschallung werden angewendet, um die Bildung von Klumpen von Kügelchen, die die spärliche Beschriftung einzelner Neuronen stören wird minimiert).. </li></ol> 2. Vorbereitung Polyvinylpyrrolidon (PVP)-Lösung und Schläuche: Um bead Bindung an die Kugel Schlauch (TEZFEL Schlauch), Mantel mit Polyvinylpyrrolidon (PVP)-Lösung zu verbessern. <ol><li> Bereiten Sie 10 ml PVP-Lösung in Wasser bei einer Konzentration von 10 mg PVP / ml. </li><li> Verwenden Sie eine 12 ml Spritze mit Schlauch-Adapter (flexible Schläuche mit etwas größerem Durchmesser), die PVP-Lösung durch die Kugel Schlauch passieren und dann vertreiben sie aus dem anderen Ende. Reuse Lösung zu beschichten mehr Kugel-Schlauch, wenn mehrere Partien gleichzeitig zubereitet werden. Discard PVP-Lösung nach dem Gebrauch. </li><li> Um die Perlen, um die Kugel Schläuche, Wirbel die Perlen um eine homogene Lösung zu erzeugen und verwenden Sie die Spritze mit dem Bead-Lösung durch den Schlauch zu ziehen, so dass Perlen gleichmäßig über den Schlauch verteilt werden. ((Anmerkung:) versuchen, die Anzahl der Luftblasen in den Schlauch zu minimieren). </li><li> Feed the Schlauch durch das prep Station und lassen die Perlen zu begleichen. Benutzen Sie die Spritze zur schonenden Entfernung des Wassers, so dass nur die Perlen zu bleiben. </li><li> Drehen Sie das Rohr in die prep Station und trocken mit Stickstoffgas bis Wassertröpfchen nicht mehr sichtbar sind. Dieser Schritt dauert ca. 10-20 min. </li><li> Cut Kugeln mit Rohrschneider in 13 mm Länge und in Szintillationsgefäße mit Drierite oder irgendeine Art von wasserfreiem Calciumsulfat. Wrap Fläschchen in Folie vor Licht zu schützen. </li></ol> 3. DiI Färbung: Diese Kennzeichnung Technik kann verwendet werden, um Neuronen in Hirngewebe von verschiedenen Arten gefärbt werden; in diesem besonderen Fall, von der Maus (3-6 Monate alt) und nicht-menschlichen Primaten (9-15 Jahre alt). Es ist vorzuziehen, dass Scheiben von festen Hirngewebe durch transcardiac Perfusion Fixierlösung erhalten sind bereit, weil Gewebekonservierung wird erwartet, dass am besten unter dieser Bedingung. Allerdings ist Fixierung durch Perfusion nicht immer möglich (wie es der Fall mit dem Affen Gewebe) und DiOLISTIC Kennzeichnung kann immer noch erfolgreich unter verschiedenen Verfahren für das Tissue Vorbereitung angewendet werden. Hier beschreiben wir drei verschiedene Verfahren für das Tissue Zubereitung: <ol class="lalpha"><li> Fix Gehirn durch transcardiac Perfusion → entfernen Gehirn → postfix für 10 min → Anschnitt → Fleck </li><li> Entfernen Gehirn → geschnitten Block von Gewebe → fix Block → waschen in PBS → Anschnitt → Fleck </li><li> Entfernen Gehirn → geschnittenen Scheiben → fix → waschen → Fleck </li></ol> In der vorliegenden Studie wurden die Affen Gehirne von Probanden, die transkardial mit eiskaltem künstliche Rückenmarksflüssigkeit (ACSF) vor Gehirns Ernte und einem Block (4 mm dick) des Gewebes mit dem caudatus a wurden perfundierten erhaltennd Putamen wurde für 60 min bei Raumtemperatur fixiert. Für alle Verfahren enthält Fixierlösung 4% Paraformaldehyd und 4% Saccharose in PBS (frisch zubereitet oder verwendet werden innerhalb von 15 Tagen). Es ist wichtig zu beachten, dass die Fixierung Zeiten entscheidend für eine erfolgreiche Färbung sind. Overfixation können Verfärbungen durch Störung der Integrität der Plasmamembran und verursacht Farbstoff Leck aus der Zelle (siehe weitere Informationen unter Ergebnisse) beeinflussen. <ol><li> Für Verfahren A und B, sind Slices (200 um) von festen Gehirn oder Gewebe blockieren und Scheiben in 24-Well-Platte mit PBS gelegt geschnitten. Für Verfahren c, sind frisch akuten Hirnschnitten (200 um) mit einem Vibratom in Kaltschneiden Lösung (in mm) 110 Cholin-Cl, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl geschnitten 2, 25 Glucose, 11,6 Ascorbinsäure, 3,1 Brenztraubensäure (Osmolarität = 310 mOsmols) und sofort nach der Scheiben in 24-Well-Platten gelegt und fixiert für 30 min mit Fixierlösung bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Scheiben mit PBS, 3-mal. </li><li> Vor dem Schießen Scheiben, entfernen Sie das PBS aus den Vertiefungen und mit einem Pinsel, legen Sie die Scheibe in der Mitte des Brunnens. </li><li> Schießen DiI Kugeln durch 3,0 um Filterpapier mit einer Helios Gene Gun-System bei 120-180 psi Heliumgasdruck, indem Sie die Pistole in einem Abstand von 1,5 cm zwischen der Probe und dem Ende des Laufes. (Wichtiger Hinweis:. Nur Neuronen innerhalb von 50 mm von der Scheibe Oberfläche wird durch diese Methode gekennzeichnet werden, so ist es wichtig, auf der gleichen Seite der Scheibe nach oben in den Waschungen und für die Montage zu halten Auf diese Weise werden Sie sicherstellen, dass die markierten Neuronen innerhalb Brennweite bei Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop). </li><li> Wash Scheiben mit PBS 3 mal und speichern sie in PBS für mehrere Stunden, damit die DiI entlang der Dendriten zu verbreiten. </li><li> Berg Scheiben auf einen Objektträger mit ProLong Gold-Antifade und decken mit einer 18x18 mm No.1 Deckglas. (Hinweis: für das Verfahren c, ist es am besten Scheiben noch am selben Tag Netzlaufwerk, da die Integrität der Scheiben ist nicht gut gepflegt über Nacht). </li><li> Seal mit klarem Nagellack nach der Montage Medien getrocknet ist. </li><li> Alternativ können die Scheiben mit Antikörpern vor der Montage wie unten beschrieben gefärbt werden. (Hinweis: Folien können verwendet werden mindestens 6 Monate bis ein Jahr, wenn im Dunkeln gelagert bei 4 ° C DiI ist lichtempfindlich und langfristige Einwirkung von Licht werden die Flecken verursachen zu verblassen). </li></ol> 4. Antikörper-Färbung: Immunfärbung sollte nach dem Schritt 3,4 und vor der Montage durchgeführt werden. <ol><li> Permeabilisierung: Inkubieren Scheiben in 0,01% Triton X-100 in PBS-Lösung für 15 min bei Raumtemperatur (300-500 ul pro Well). HINWEIS: Verwenden Sie keine höheren Konzentrationen von Waschmittel, da dies DiI auflösen wird und deutlich reduzieren Fluoreszenzfärbung. Versuchen Sie, die Zeit in Reinigungsmittel zu minimieren so umfangreich Inkubationen reduzieren auch die DiI Markierung. Wenn erweiterte Inkubationen notwendig sind, halten Scheiben in PBS statt in Blocking-Lösung. </li><li> Blocking: Inkubieren Scheiben in Blocking-Lösung mit 10% Ziegenserum, 0,01% Triton X-100 in PBS für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Primärer Antikörper: Add-Antikörper bei der gewünschten Verdünnung in Blockierungslösung (z. B. Kaninchen anti-GFP Antikörper bei 1:1000 Verdünnung). Add 300-500 ul pro Well und Inkubation für 1-2 Stunden. (Hinweis: Wenn über Nacht Inkubationen notwendig sind, zu entfernen Waschmittel Blockierungslösung). </li><li> Wash Scheiben mit PBS für 5 bis 15 min, 3-mal. </li><li> Sekundäre Antikörper: Inkubieren mit sekundärem Antikörper für 30 min bei Raumtemperatur. Bereiten sekundären Antikörper-Lösung in der gewünschten Verdünnung in Blockierungslösung (zB Alexa-Fluor 488 konjugierten Antikörper bei 1:1000 Verdünnung). </li><li> Wash Scheiben mit PBS für 5-15 min, 4-mal. </li><li> Berg Scheiben auf Folien mit ProLong Gold-Antifade und decken mit einer 18x18 mm No.1 Deckglas. Seal mit Nagellack nach der Montage Medien getrocknet ist. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: <ol><li> Überprüfung auf korrekte Kennzeichnung: Section kann unter einem Fluoreszenz-Binokular mit einer Quecksilberlampe und rot fluoreszierende Filterwürfel erfolgreiche DiOLISTIC Kennzeichnung bestätigen ausgestattet visualisiert. Abbildung 1 zeigt beispielhaft Bilder schön beschriftet Hirnschnitten bei geringer Vergrößerung erhalten. Zwei wichtige Eigenschaften zu suchen sind eine spärliche Beschriftung Muster (Abbildung 1A) und die Möglichkeit, einzelne Zellbestandteile (Abbildung 1B-C) zu identifizieren. </li&gt; <li> Troubleshooting DiOLISTIC Etikettierung: Abbildung 2 zeigt Beispiele für Abschnitte, in denen die DiOLISTIC Kennzeichnung funktionierte nicht richtig. Nach unserer Erfahrung gibt es drei Hauptursachen für ineffiziente Etikettierung: <ul><li> Labeling ist zu dünn oder dicht: Sehr wenige Zellen pro Abschnitt in einem Fall beschriftet oder zu viele Zellen markiert sind verhindert die Isolierung und Untersuchung einzelner Zellelemente. Lösung: Passen Sie die Konzentration der Kügelchen in die endgültige Lösung für die Beschichtung der Kugel TEFZEL Schlauch (Abschnitt 1.6) verwendet. Abnahme oder Zunahme des Volumens von Wasser (3 ml Anfangswert) verwendet werden, um die Perlen zu lösen, um für zu dünn oder zu dicht Kennzeichnung korrekt ist, bzw.. Darüber hinaus könnten geringe Effizienz der Kennzeichnung durch eine nicht optimale Gasdruck verursacht werden bei der Aufnahme der beschichteten Perlen auf den Abschnitten. Diese Möglichkeit kann, indem sichergestellt wird, dass die TEFZEL Kugel Schlauch hat die meisten der Kügelchen freigesetzt und es scheint, nach der Aufnahme klar ausgeschlossen werden. Ansonsten sollte Gasdruck für die Aufnahme erhöht werden. </li><li> Bad Kugeln: große Klumpen oder Haufen von Farbstoff beschichtete Wolfram Perlen sind während der Vorbereitung Kugel gebildet. Abschnitte werden Beispiele in Abbildung 2A-B ähneln. Lösung: Stellen Sie neue Kugeln mit besonderem Augenmerk auf Abschnitt 1.5 und / oder zu erweitern Beschallungszeit in Abschnitt 1.6. </li><li> Over-Fixierung: Gewebe wird in Paraformaldehyd-Lösung für mehr als die optimal benötigte Zeit für die Befestigung (30 Minuten für 200-300 um Abschnitte, 1 Stunde für 4 mm Abschnitte) gehalten. Dies gefährdet die Integrität der Plasmamembran und produziert markierte Abschnitte, wie in Abbildung 2C-D gezeigt, in der Kennzeichnung scheint out of focus aufgrund der Dispersion des Farbstoffes aus den Zellen heraus zu suchen. Lösung: Reduzierung Fixierung Zeit. </li></ul></li><li> Konfokale Bildgebung: Image Stacks sind aufgenommen mit einem konfokalen Mikroskop (Zeiss LSM 510 META) mit einem 20x-Objektiv für die ganze Zelle und 63x Wasserimmersionsobjektiv für Dendriten Segmenten. DiI war begeistert mit einem DPS 561 nm Laserlinie und grüne Fluoreszenz des sekundären Antikörpers war begeistert mit einem 488 nm Laser-Linie. Die optische Schnitte der markierten Probe erreicht werden, wenn die konfokale Mikroskopie ermöglicht ferner zur Isolierung von einzelnen markierten Zellen in der Probe. Abbildung 3A zeigt einen striatalen Medium stacheligen Neuron aus Maus Gehirns und seiner komplexen Dendriten Zweig Muster. Hohe Vergrößerung Bilder von Dendriten Zweige dieser Neuronen aus Nagetieren (3B) und nicht-menschliche Primaten (Abbildung 3C) zeigen den Grad der Färbung in Dendriten und dendritischen Dornen mit dieser Technik in beiden Spezies. Dendriten und deren Vorsprünge (Stacheln) scheinen gut definiert, auch wenn man die langen, dünnen Wirbelsäule Köpfe so reichlich in mittlerer stachelige Neuronen. Bei der Kombination von DiOLISTICS mit Immunfärbung ist konfokale Bildgebung auch in eindeutig lokalisiert den Fleck auf der gleichen Bildebene und derselben Zelle hilfreich. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für Kolokalisation von DiI Kennzeichnung und Immunfärbung für GFP in einer einzigen Zelle. Das Bild ist ein Stack (0,7 um z-Bereich) aus einer striatalen Slice aus einer transgenen Maus Ausdruck des fluoreszierenden Proteins GFP unter der D1 Dopamin-Rezeptor-Promotors. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. DiI Markierung von Neuronen in Hirnschnitten von nicht-menschlichen Primaten. (A) geringer Vergrößerung Bild eines gefärbten Hirnschnitten mit dem Nucleus caudatus von einem Cynomolgusaffen dass spärliche Beschriftung von Neuronen mit DiI zeigt. (BC) Isolated Medium stachelige Neuronen können leicht identifiziert werden mit einem fluoreszierenden Binokular. <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Fehlerbehebung DiOLISTIC Kennzeichnung. (AB) Stained Scheiben von dorsale Striatum der Affen (A) und Maus (B) zeigt große Klumpen von Farbstoff-beschichteten Beads und als Folge davon, keine einzelnen zellulären Elementen unterschieden werden können. (CD) Bilder, die das Ergebnis der Anwendung DiOLISTIC beispielhaft Kennzeichnung auf Abschnitte, die in Fixierlösung für längere Zeit oder bei denen Gewebe Erhaltung aufbewahrt wurden nicht in Affen (C) und Maus (D) Gewebe. <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Konfokale Bild der striatalen Medium stacheligen Neuron mit DiI gefärbt. (A), ermöglicht Bildstapel einer ganzen Zelle für die morphologische Analyse der dendritischen Verzweigungen. (BC) Dendrite Segmente aus der Maus (B) und Affen (C) mittlere stachelige Neuronen zeigen eine klare Kennzeichnung von Dendriten und Dornen. <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Die Kombination DiOLISTIC Markierung mit Immunfärbung. (A) DiI markierten <sTrong&gt; Medium stacheligen Neuron aus Striatum von BAC transgene Maus, die GFP unter der D1 Dopamin-Rezeptor-Promotor. (B) Immunfärbung mit anti-GFP Antikörper als Methoden von Lee et al angepasst beschrieben. (2006). Gleichen Feld wie A. (C) Composite Bild rote und grüne Fluoreszenz identifiziert DiI-markierten Neuronen als GFP-positive Neuronen.

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOLISTIC"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOLISTIC" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harb Protoc. , pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).</li><li>Grutzendler, J., Tsai, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+labeling+of+neuronal+populations+by+ballistic+delivery+of+fluorescent+dyes.">Rapid labeling of neuronal populations by ballistic delivery of fluorescent dyes.</a> Methods. 30, 79-85 (2003).</li><li>Lee, K. W., Kim, Y., Kim, A. M., Helmin, K., Nairn, A. C., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine-induced+dendritic+spine+formation+in+D1+and+D2+dopamine+receptor-containing+medium+spiny+neurons+in+nucleus+accumbens.">Cocaine-induced dendritic spine formation in D1 and D2 dopamine receptor-containing medium spiny neurons in nucleus accumbens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 3399-3404 (2006).</li><li>Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+double-labeling+with+carbocyanine+neuronal+tracing+and+immunohistochemistry+using+a+cholesterol-specific+detergent+digitonin.">Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin.</a> J Neurosci Methods. 174, 71-81 (2008).</li><li>Neely, S. t. a. n. w. o. o. d., Deutch, G. D., Y, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+diOlistic+labeling+with+retrograde+tract+tracing+and+immunohistochemistry.">Combination of diOlistic labeling with retrograde tract tracing and immunohistochemistry.</a> J Neurosci Methods. 184, 332-336 (2009).</li><li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diolistics:+incorporating+fluorescent+dyes+into+biological+samples+using+a+gene+gun.">Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun.</a> Trends Biotechnol. 25, 530-534 (2007).</li><li>Shen, H. W., Toda, S., Moussawi, K., Bouknight, A., Zahm, D. S., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+dendritic+spine+plasticity+in+cocaine-+withdrawn+rats.">Altered dendritic spine plasticity in cocaine- withdrawn rats.</a> J. Neurosci. 29, 2876-2884 (2009).</li></ol>

Alle tierischen Verfahren wurden folgende Anleitung aus dem Animal Care und Verwenden Ausschuss NIAAA und der Oregon National Primate Research Center durchgeführt. Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

DiOLISTIC Kennzeichnung ist eine der vielseitigsten Techniken zur Fluoreszenz-Markierung von Zellen, weil es kann zu Gewebeschnitte aus verschiedenen Arten angewendet werden, um eine breite Palette von Alter und das Gewebe erhalten frisch oder aus Fixativ-perfundierten Tieren (siehe auch Gan et al ., 2009). Das Verfahren ist relativ schnell, wie es 1-2 Tage dauert und es kann mit anderen klassischen Kennzeichnung Ansätze wie Immunfärbung (Lee et al., 2006) kombiniert werden. Besondere Aufmerksamkeit sollte auf über Fixierung und den Einsatz von High Detergenzkonzentrationen in Inkubationslösungen zu vermeiden, da diese die Integrität der lipophilen Membran umfassen wird und zu dem Farbstoff ein Austreten aus den Zellen. Antikörper Penetration kann durch niedrige Konzentrationen von erleichtert werden Triton X-100 (Lee et al., 2006), sowie Digitonin oder Saponin in der Inkubationslösung (Matsubayashi et al., 2008). Einige Änderungen, die diese Technik angewendet werden können, gehören die Verwendung von Geschossen mit mehreren Farbstoffen wie Gan et al. (2000) oder das Ändern der Länge und Art der Antikörper-Exposition (Neely et al., 2009) beschrieben. Traditionell wurde DiI verwendet worden, um neuronale Projektionen im Gehirn zu verfolgen. DiOLISTIC Kennzeichnung erweitert seine Anwendung durch die Beschreibung einer Methode sinnvoll, Zellmorphologie zu untersuchen. Neuronale Morphologie ist von großem Interesse wegen der großen Vielfalt in das Gehirn und die Spekulationen, dass die Zellform könnte die Funktion Vielzahl von neuronaler Populationen im Nervensystem spiegeln gefunden. Ein Beispiel hierfür ist die Tatsache, dass viele Neurone in Nervensystems der Säuger Anzeige kleinen Vorsprung dendritischen Dornen, dass die Website von glutamatergen Synapsen genannt werden. Auf diese Weise kann die Dichte der glutamatergen Synapsen auf eine Zelle, um die Dichte der dendritischen Dornen, die unter Verwendung der Kennzeichnung Technik beschriebenen korreliert werden soll. Darüber hinaus können auch andere morphologische Parameter wie Dendriten Gesamtlänge Verzweigungsmuster, dendritischen Dorn Form und Dichte quantifiziert und untersucht werden. Die Verwendung von Fluoreszenz-Markierung für die Untersuchung neuronaler Morphologie hat viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Techniken, die auf Hellfeld-Mikroskopie (z. B. Golgi-Färbung) verlassen verglichen, weil es für eine höhere Auflösung der konfokalen Bildgebung ermöglicht. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von DiI als Fluorophor in Experimenten an Mess-dendritischen Dorn Dichte ausgerichtet und Morphologie ist ihre lipophilen Eigenschaften. DiI-Partitionen in der Plasmamembran und bietet eine gut definierte Kontur der neuronalen Prozesse und dendritischen Vorsprüngen. Angesichts des geringen Volumens der meisten dendritischen Dornen (weniger als 1 Femtoliter), ist Membranfärbung effizienter und ermöglicht eine bessere Visualisierung von kleinen, dünnen Vorsprünge als zytoplasmatische Färbung.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1-1&#x2019;-dioctadecyl-3,3,3&#x2019;,3&#x2019;- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
<td>H485-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2269</td>
<td>1.7 &mu;m diameter</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyvinylpyrrolidone </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>529504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tefzel bullet tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2441</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing cutter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2422</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios Gene Gun</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2431</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopore membrane filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>TSTP02500</td>
<td>3.0 &mu;m pore size</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold Antifade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>30525-89-4</td>
<td>(16% w/v)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

diolistic labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices

DiOLISTIC Färbung nutzt die Gen-Kanone, um fluoreszierende Farbstoffe, wie DiI einzuführen, in die Neuronen des Gehirns Scheiben (Gan et al, 2009;. O&#39;Brien und Lummis, 2007; Gan et al, 2000.). Hier bieten wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung der einzelnen Schritte zusammen mit exemplarischen Bildern von guten und schlechten Ergebnissen, die helfen beim Einrichten der Technik erforderlich. In unserer Erfahrung, bewies ein paar Schritte von entscheidender Bedeutung für die erfolgreiche Anwendung von DiOLISTICS. Diese Überlegungen sind die Qualität der DiI-beschichtete Kugeln, das Ausmaß der Fixierungsmittel Belichtung und die Konzentration des Waschmittels in der Inkubationszeit Lösungen eingesetzt. Tipps und Lösungen für gemeinsame Probleme sind vorhanden. Dies ist ein vielseitiges Kennzeichnung Technik, die auf mehrere Tierarten in einem breiten Altersspektrum angewendet werden können. Im Gegensatz zu anderen Fluoreszenzmarkierung Techniken, die zur Vorbereitung von jungen Tieren bedingt oder befristet sind, um Mäuse, weil sie auf die Expression eines fluoreszierenden Transgen verlassen können DiOLISTIC Kennzeichnung von Tieren aller Altersklassen, Arten und Genotypen angewendet werden und es kann in Kombination mit verwendet werden Immunfärbung auf eine bestimmte Subpopulation von Zellen zu identifizieren. Hier zeigen wir die Verwendung von DiOLISTICS zu beschriften Neuronen in Hirnschnitten von adulten Mäusen und Erwachsenen nicht-menschlichen Primaten mit dem Ziel der Quantifizierung Dendrit Verzweigung und dendritischen Dorn Morphologie.

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DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Wir demonstrieren den Einsatz der Gen-Kanone, um fluoreszierende Farbstoffe, wie DII, zu Neuronen in Hirnschnitten von Nagern und Primaten verschiedener Altersstufen einzuführen. In diesem speziellen Fall, verwenden wir erwachsenen Mäusen (3-6 Monate alt) und Erwachsenen cynomologus Affen (9-15 Jahre alt). Diese Technik, die ursprünglich von dem Labor von Dr. Lichtman beschrieben (Gan<em&gt; Et al</em&gt;., 2000), ist gut für die Untersuchung der dendritischen Verzweigungen und dendritischen Dorn Morphologie geeignet und lässt sich mit herkömmlichen Immunfärbung kombiniert werden, wenn Waschmittel bei einer geringen Konzentration gehalten werden.

DiOLISTIC Labeling von Neuronen aus Nager und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

diolistic-labeling-neurons-from-rodent-non-human-primate-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.8K Aufrufe.  NIH. Wir demonstrieren den Einsatz der Gen-Kanone, um fluoreszierende Farbstoffe, wie DII, zu Neuronen in Hirnschnitten von Nagern und Primaten verschiedener Altersstufen einzuführen. In diesem speziellen Fall, verwenden wir erwachsenen Mäusen (3-6 Monate alt) und Erwachsenen cynomologus Affen (9-15 Jahre alt). Diese Technik, die ursprünglich von dem Labor von Dr. Lichtman beschrieben (Gan Et al., 2000), ist gut für die Untersuchung der dendritischen Verzwei...

Serie: DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Herstellung von nichtmenschlichen Primaten Hirngewebe für die Pre-Einbettung Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

Anwendung von automatisierten Bild-geführten Patch-Clamp für die Studie von Neuronen in Gehirn-Scheiben

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

Bewertung der Synapse Dichte im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) is a promising approach when pharmacological treatment fails or neurosurgery is not recommended. Acute brain slices coupled to microelectrode arrays (MEAs) represent a valuable tool to study neuronal network interactions and their modulation by electrical stimulation. As compared to conventional extracellular recording techniques, they provide the added advantages of a greater number of observation points and a known inter-electrode distance, which allow studying the propagation path and speed of electrophysiological signals. However, tissue oxygenation may be greatly impaired during MEA recording, requiring a high perfusion rate, which comes at the cost of decreased signal-to-noise ratio and higher oscillations in the experimental temperature. Electrical stimulation further stresses the brain tissue, making it difficult to pursue prolonged recording/stimulation epochs. Moreover, electrical modulation of brain slice activity needs to target specific structures/pathways within the brain slice, requiring that electrode mapping be easily and quickly performed live during the experiment. Here, we illustrate how to perform the recording and electrical modulation of 4-aminopyridine (4AP)-induced epileptiform activity in rodent brain slices using planar MEAs. We show that the brain tissue obtained from mice outperforms rat brain tissue and is thus better suited for MEA experiments. This protocol guarantees the generation and maintenance of a stable epileptiform pattern that faithfully reproduces the electrophysiological features observed with conventional field potential recording, persists for several hours, and outlasts sustained electrical stimulation for prolonged epochs. Tissue viability throughout the experiment is achieved thanks to the use of a small-volume custom recording chamber allowing for laminar flow and quick solution exchange even at low (1 mL/min) perfusion rates. Quick MEA mapping for real-time monitoring and selection of stimulating electrodes is performed by a custom graphic user interface (GUI).

We illustrate how to perform recording and electrical modulation of 4-aminopyridine-induced epileptiform activity in rodent brain slices using microelectrode arrays. A custom recording chamber maintains tissue viability throughout prolonged experimental sessions. Live electrode mapping and selection of stimulating pairs are performed by a custom graphical user interface.

Aufnahme und Modulation der Epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben gekoppelt mit Mikroelektrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...