Wir möchten Drs anzuerkennen. Ping Jun Zhu und Susumu Koyama für ihre Unterstützung während der ersten bis die Technik gesetzt, und Dr. Veronica Alvarez für die Unterstützung bei der Formatierung der schriftlichen Manuskript. Diese Studie wurde von der Abteilung für Interne Klinische und biomedizinische Forschung von NIAAA finanziert.

1. Vorbereitung Flame-Sealed Glasmikropipette <ol><li> Mit Mikroelektroden aus Glas, ziehen eine Standard-Patch-Clamp-Mikropipette auf einem Flaming-Brown oder gleichwertig Mikropipette Abzieher (Spitzendurchmesser ~ 2 um). Legen Sie Mikropipette in die Flamme eines Bunsen-Brenner für ~ 2 Sekunden, bis eine Kugel verschmolzen Formen mit einem Durchmesser von 200-300 mu m Spitze. </li><li> Legen Flamme versiegelt Patchpipette in der Halterung auf einem Mikromanipulator, die schnell vibriert kann von Seite zu Seite (Wegstrecke 100-200 um) mit einem piezoelektrischen Bimorph, Relais, oder äquivalent effektives Gerät. </li></ol> 2. Vorbereitung Hirnschnitten von P1-P21 Ratten oder Mäuse <ol><li> Bereiten künstlichen Liquor (aCSF) mit folgender Zusammensetzung (in mM): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3 und 10 D-Glucose. Bubble-Lösung mit 95% Sauerstoff / 5% CO 2-Gas für ca. 15 min, dann fügen Sie 2 mM CaCl 2 und 1 mM MgCl 2. </li><li> Cutting Hirnschnitten: <ol><li> Anesthetize Tier mit Halothan oder Isofluran. Enthaupten Tier - entfernen Gehirn - blockieren Gehirn in der gewünschten Ausrichtung (koronal, parasagittal, quer, etc.), Regionen von Interesse sind. </li><li> Befestigen Sie den gesperrten Gehirn auf die Bühne eines schwingenden Gehirn Allesschneider in aCSF untergetaucht - Abschnitt des Gehirns bei 250-400 mu m Dicke - statt Scheiben in aCSF sprudelte mit Carbogen in einem &quot;Vorinkubation&quot; Kammer zur Verrechnung, die für Flüssigkeit / Gas-Exposition auf allen Oberflächen ermöglicht - erlauben Scheiben in diesem Medium für mindestens eine Stunde ausgleichen. </li></ol></li></ol> 3. Vibrodissociation <ol><li> Füllen Sie eine 35 mm Durchmesser Kulturschale mit HEPES-gepufferte Salzlösung der folgenden Zusammensetzung (mM): 150 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 MgCl 2, 2,5 CaCl 2, 10 D-Glucose mit pH-Wert eingestellt auf 7,4 mit NaOH und Osmolarität auf ~ 300 mOsm mit Saccharose eingestellt. Kulturschalen können Aufhängung Gerichte, Standard Zellkulturschalen Kulturschalen mit Deckglas Einsätze, oder Gerichte mit, z. B. Poly-L-Lysin-beschichtete, in Abhängigkeit von der Notwendigkeit einer stärkeren Zelle Einhaltung der Schalenboden werden. </li><li> Platzieren Sie die Scheibe in der Kulturschale und visualisieren mit einem Seziertisch Stereoskop bei 250 x. Halten Scheibe auf den Boden mit einem gebogenen Platindraht (0,5 mm Durchmesser) auf der Oberseite der Scheibe platziert, um so ein Gewicht zu handeln. </li><li> Positionieren Sie die Spitze der Flamme versiegelt Mikropipette auf der Schnittfläche in die gewünschte Region des Gehirns. Aktivieren Mikromanipulator an die Spitze seitlich vibrieren bei 10-30 Hz, mit Exkursion Entfernung ~ 100 um. Mit dem Mikromanipulator, bewegen Sie die Spitze tiefer in die Scheibe Gewebe, so dass es durch das ganze Stück in ~ 30 sec geht. Wiederholen Sie diesen Schritt als notwendig, um die Anzahl der isolierten Neuronen, erhältlich aus einer bestimmten Region des Gehirns zu maximieren. </li><li> Entfernen Sie die Spitze von der Scheibe - Abholung der Scheibe mit einer Pinzette und schütteln Sie sie vorsichtig, während noch in Lösung - dann entfernen Scheibe komplett und entsorgen. </li><li> Lassen Sie die dissoziierten Zellen zu lösen und den Schalenboden haften für mindestens 10 min. </li></ol> 4. Elektrophysiologische Recording <ol><li> Die Schale mit Neuronen auf der Bühne eines inversen Mikroskops und visualisieren mit 10 x 63 x Ziel. Geben Sie für Neuronen mit einer glatten Patent Membran, keine Blasenbildung und einer nachweisbaren, aber nicht überdimensioniert Kern. Wenn Phasenkontrast-Optik verwendet werden, für die Phase-hellen Neuronen Look mit einem gelblich-Tönung, nicht zu blau. Superfuse Zellen mit extrazellulären Lösung mit gewünschten Salze, Nährstoffe, Rezeptor-Antagonisten, etc. (unser Standard der HEPES-gepufferte Salzlösung erwähnt wird (Abschnitt 3.1)), oft mit 5 uM 2,3-Dioxo-6-nitro-1 ergänzt, 2,3,4-tetrahydrobenzo [f] chinoxalin-7-Sulfonamid Dinatrium (NBQX) und 25-100 uM D-2-Amino-5-phosphonopentanoic Säure (AP5) zu ionotropen Glutamat-Rezeptoren, die für die Isolierung von schnellen GABA ermöglicht Block A-Rezeptor-vermittelten IPSCs 1,2. </li><li> Ziehen Sie einen Standard-Patch-Mikropipette mit einem Flaming-Brown oder gleichwertig Abzieher. Pipettenspitze Widerstand sollte 2-4 MOhm (je nach Zielzelle Größe) werden, wenn mit einem Cl gefüllt - - basierte Lösung. </li><li> Stellen Sie eine whole-cell recording von einem visualisiert Neuron mit Standard elektrophysiologische Techniken. </li><li> Rekord spontane postsynaptische Ströme (sPSCs) mit einem lückenlosen Datenerfassung Protokoll. Bewerben 0,2-1 uM Tetrodotoxin und / oder niedrige Ca 2 + - haltigen extrazellulären Lösung Miniatur postsynaptischen Ströme (mPSCs) aufnehmen. </li><li> Lösungen und pharmakologische Wirkstoffe können direkt auf Zellen angewendet werden. Wir verwenden lokale Superfusion aus geschmolzenem Quadrat-bestückte Glasröhrchen mit Lösung Austausch mit seitliche Bewegung des Rohres montiert auf einem Stepper-Motor angetrieben Mikromanipulator. Diese allowurde zur Herstellung Austausch in 10s bis 100s von ms auf den raschen Wandel in extrazellulären Inhalte, Anwendung der Rezeptor-Agonisten, etc. zu erreichen </li><li> Akaike und seine Kollegen haben Techniken zur Stimulierung einzelner präsynaptischen boutons 3,4 entwickelt. Eine Mikropipette in der Nähe eines visualisiert bouton platziert und Anregung gegeben ist (negative Impulse Ströme von 5-10 uA, 0,1-0,2 ms Dauer). Unitary IPSCs aufgezeichnet werden, und Methoden wie die Methode der Ausfälle können verwendet werden, um Veränderungen in präsynaptische und postsynaptische Funktion zu untersuchen. </li></ol> 5. Imaging präsynaptischen <ol><li> Postsynaptischen Neuronen können mit verschiedenen Farbstoffen über den Patch-Pipette gefüllt werden. Neuronen können auch von Mäusen, die fluoreszierenden Proteinen (FPs) wie grün fluoreszierende Protein (GFP) in ausgewählten Zellpopulationen vorgenommen werden. </li><li> Präsynaptischen visualisiert werden auf vibrodissociated Neuronen von Mäusen, dass FPs insbesondere Interneuron Bevölkerung zum Ausdruck gemacht. Zum Beispiel, Mäusen, die GFP durch die Glutamat-Decarboxylase 65 (GAD65)-Promotor zeigen grüne Somata und Prozesse im Hippocampus Korbzellen und andere Interneurone angetrieben. Vibrodissociated Pyramidenneuronen aus der hippocampalen CA1 Region haben GFP-positive Axonterminalen apposed ihre Somata und proximalen Dendriten (Abbildung 1A). Pyramidenneuronen vibrodissociated von Mäusen, die ausdrückliche synaptopHlourin (a pH-sensitive GFP-Mutante, fusioniert an die synaptischen Vesikel-assoziierten VAMP2 Protein) unter der Kontrolle der Thy1 Promoter haben auch FP-positive befestigt boutons, dass pH-sensitive Fluoreszenz (Abbildung 1B) zu zeigen. </li><li> Präsynaptische boutons kann mit Kalzium-Indikator Farbstoffe und andere fluoreszierende Moleküle mit AM-veresterten Verbindungen 5 geladen werden. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für das Laden mit dem Kalzium-Indikator-Farbstoff Fluo4-AM. Erstens, 1-2 um AM-veresterte Farbstoff zu Neuronen bei 37 ° C 10 min aufgetragen. Dye in die intrazelluläre Umgebung, wo spalten Esterasen das Molekül eindringen, wobei das freie, Zell-impermeante und ungelöschten Farbstoffs. Dieser Ansatz Lasten sowohl prä-und postsynaptischen zellulären Elementen. Nach dem Laden werden die Zellen mit HEPES-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und aufbewahrt bei 37 ° für weitere 10 min. Vor Abgabe eines GOhm-Dichtung mit einer Glaspipette Elektrode werden die Zellen 3 mal mit externen gepufferten Lösung gespült. </li><li> A whole-cell recording wird dann eingerichtet mit einem Farbstoff-freie intrazelluläre Lösung. Nach 2-5 min von der Aufnahme wird der Farbstoff vor allem aus den postsynaptischen Neuron entfernt, so dass Visualisierung von Fluo-4-geladenen synaptischen boutons. Diese Technik wurde von Ye et al 5 Pionierarbeit. </li><li> Der Farbstoff-beladenen boutons können dann visualisiert werden mit einer hohen Vergrößerung, hoher numerischer Apertur Ziel entweder mit einer Kamera-oder Multiphotonen-Mikroskop. Gleichzeitige whole-cell recording und Kalzium-Imaging kann mit Hilfe eines Setup wie in Abbildung 3 gezeigt. Die Bilder des Neurons und boutons in Abbildung 2C dargestellt wurden mit einem Elektronenmikroskop Multiplikation charge coupled device (EMCCD) Kamera eingefangen. Die Macht der Lichtquelle für die Anregung wurde abgeschwächt auf 1,2% mit einem neutralen Dichte 1,0-Filter und eine Iris-Filter angepasst, um 12% ausgegeben. Calcium-Transienten von der grünen präsynaptischen boutons beobachtet und aufgezeichnet werden in Echtzeit gemessen und offline. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Spontane und Current Injection-evozierte Firing von Vibrodissociated Neurons Aufnahmen von einem typischen vibrodissociated hippocampalen CA1 Pyramidenzellen Neuron sind in Abbildung 4A gezeigt. Spontane Überschießen Aktionspotentiale können in pyramidalen Neuronen losgelöst von Ratten basolateralen Amygdala, Hippocampus und VTA 1,5 beobachtet werden. Während Current-Clamp-Aufnahmen von CA1 pyramidalen Neuronen, hyperpolarisierenden Stromeinspeisung produziert typische Spannung Reaktionen während depolarisierende Ströme von ausreichender Größe zu entlocken Überschießen Aktionspotentiale mit den typischen verzögerten Zündung Muster mit mäßiger derzeitigen Niveau und Nicht-Aufnahme Aktionspotentiale in Reaktion auf stärkere Stromeinspeisung ( Abbildung 4B). Spontane und Miniature GABAergen inhibitorischen postsynaptischen Ströme in Vibrodissociated Neurons Während Voltage-Clamp-Aufnahmen mit einer CsCl-basierte intrazelluläre Lösung sind spontane synaptische Ströme beobachtet werden (Abbildung 5A). Diese Ereignisse sind in niedrigen Kalzium-haltigen Lösung 2,6 eliminiert und in den meisten neuronalen sind vollständig durch GABA A-Rezeptor-Antagonisten wie Bicucullin oder gabazine (Abbildung 5B, C), was darauf hinweist, dass diese sIPSCs von GABA-Freisetzung und Aktivierung vermittelt werden blockiert dieser ionotropen Rezeptor-Subtyp. Doch im Prinzip Neuronen aus Hirnregionen wie der Amygdala basolateralen 2 und dem ventralen Tegmentum 5,7, GABA A-Rezeptor-Blockadezeigt kürzere Dauer EPSCs durch glutamaterge Aktivierung von AMPA-Typ-Rezeptoren vermittelt. Interessanterweise reduziert Anwendung der TTX bei Konzentrationen, die spezifisch für Blockade der Toxin-sensitive spannungsabhängigen Natrium-Kanäle sind die Frequenz und Amplitude der sIPSCs in vibrodissociated Neuronen aus verschiedenen Hirnregionen (Abbildung 6A) 2,4,7 beobachtet. So beteiligt sich Natrium-Kanal-Aktivität in GABA-Freisetzung in die eingeklemmte off synaptischen boutons. Es ist noch nicht klar, ob ausgewachsene Natrium Aktionspotenziale in diesen Anschlüssen auftreten. Es ist erwähnenswert, dass der Eingangswiderstand gut verschlossen 1 uM Durchmesser Axonterminal wahrscheinlich bis weit in die GOhm Bereich liegen wird. So könnte Eröffnung sogar eine kleine Anzahl von Natrium-Kanäle ausreichen, um Terminals depolarisieren die Kalzium-Kanäle, die Erregung Sekret Kopplung vermitteln zu aktivieren. Zum Thema dieser Kalziumkanäle, deutet einiges darauf hin, dass N-und P / Q-Typ-Kanäle in Release an GABAergen Terminals in der vibrodissociated Zubereitungen aus hippocampalen CA1 und anderswo 8 teilnehmen. Modulation und Plastizität der Übertragung durch eine Reihe von Neurotransmittern und Rezeptoren untersucht wurde mit vibrodissociated Neuronen 3,4,9. Die Neurotransmitter gezeigt, wie modulatorische Aktionen haben Adenosin, GABA, Serotonin, Endocannabinoide, etc 2,6,10,11,12. Darüber hinaus hat kurzfristige synaptische Plastizität, wie Endocannabinoid-abhängige Depolarisation induzierte Unterdrückung der Hemmung (DSI) auch in dieser Zubereitung 2,11 beschrieben worden. Diese Ergebnisse zeigen, dass viele Formen der Rezeptor-vermittelten und trans-synaptische Signalisierung durch endogene Neuromodulatoren intakt in die vibrodissociated Vorbereitung sind. Calcium Transienten und Vesicular Veröffentlichung in Axon-Terminals in der Vibrodissociated Vorbereitung Mit dem EMCCD ausgestattete inverse Mikroskop oben beschrieben, haben wir Kalzium Transienten in präsynaptischen in der vibrodissociated Neuron-bouton Vorbereitung untersucht. Abbildung 2 zeigt Beladung der Zellen mit AM-veresterte Fluo-4 und anschließende postsynaptische Farbstoffverdünnungskurve in hippocampalen CA1 Pyramidenzellen Neurons. Spontane Kalzium Transienten sind in einigen Farbstoff gefüllten boutons als Regions of Interest (ROI) in 6B gezeigt, beobachtet. Anwendung von 1 uM Tetrodotoxin (TTX) beseitigt diese spontanen Übergänge, was darauf hinweist, dass sie durch die Aktivierung von spannungsgesteuerten Natriumkanäle Strömungen, die sich spontan in boutons aktiviert vermittelt werden, was zu weiteren Calcium steigt. Steigende extrazellulären KCl von 10 mm bis 40 mm mit schnellen Lösung Austausch produziert erhöhte Fluoreszenz in ROIs, die präsynaptischen (Abbildung 7A) entsprechen gemessen. Gleichzeitige Aufnahme aus dem postsynaptischen Neuron wird verwendet, um sIPSCs überwachen und festzustellen, ob bei Frequenz von High-K + Depolarisation (Abbildung 7B) erhöht wird. Zur Visualisierung Vesikelfusion in der präsynaptischen boutons wir Mäusen, die synaptopHlourin unter der Kontrolle des Thy1 Promotor (beschriftet spH21 Mäuse) Konstrukt verwendet haben. SynaptopHluorin in ein molekulares Konstrukt, in dem Ekliptik pHlourin (a GFP-Mutante mit verbesserter pH-Empfindlichkeit) 12 ist es, die Vesikel associated membrane protein (VAMP2) 13 verbunden. Diese Anordnung situiert pHlourin Motiv in die Vesikel Lumen, wo der relativ sauren Milieu die Fluoreszenz. Nach Vesikelfusion dieses Motiv ist es, die eher neutralen extrazellulären Umgebung mit einem daraus resultierenden Anstieg der Fluoreszenz bei puncta, die Vesikel / präsynaptischen entsprechen ausgesetzt. Vibrodissociation von Neuronen im Hippocampus von Mäusen spH21 ermöglicht Visualisierung von fluoreszierenden puncta der Größe und Lage für GABAerge Terminals (Abbildung 8A) erwartet. Die Anwendung der High-K + - mit externen Lösung erhöht Fluoreszenz in diesen Anschlüssen, und dieser Effekt ist in Gegenwart von einer externen Lösung, in der extrazellulären Calcium bis 0,2 mm (Abbildung 8B) reduziert wird blockiert. Somit scheint die Depolarisation induzierte Anstieg der Fluoreszenz zu Anregungs-Sekretion Kopplung an GABAergen Synapsen in der Neuron-bouton Vorbereitung widerspiegeln. Die Fähigkeit zur präsynaptischen Calcium-Transienten und Vesikelfusion in Axonterminalen der Neuron-bouton Vorbereitung Maßnahme ermöglicht es uns, Auswirkungen von Neuromodulatoren, Drogen und synaptische Plastizität auf präsynaptische Mechanismen in Anregungs-Sekretion Kupplung und Exozytose / Endozytose beteiligt zu untersuchen. Diese Techniken können auch mit anderen molekularen Werkzeugen und gentechnisch veränderten Mäusen kombiniert werden, um die Rollen von bestimmten Proteinen in präsynaptischen Funktion und Modulation / Plastizität zu untersuchen. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Vibrodissociated Neuronen aus dem Hippocampus CA1-Region (A) zusammengefügte Bild der DIC einnd grüne Fluoreszenz Bilder von einem GAD65 Maus. DIC Bild verschmolzen zu zeigen deutlich die Standorte der grünen Klemmen (B) Fluoreszenz Bild aus einer synaptophluorin (spH21) Maus. Maßstab = 10 pm <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2 Calcium-Indikator-Ladevorgang: (A) ganze Zelle ist mit AM-veresterte Farbstoff beladen; (B) whole-cell recording verdünnt Farbstoff, (C)-Terminals werden visualisiert als Regions of Interest (Pfeilspitzen).. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus für die gleichzeitige whole-cell recording und Kalzium-Imaging in präsynaptischen auf vibrodissociated Neuronen. EMCCD = Elektron Multiplikation charge coupled device. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Representative Wellenformen zeigt (A) spontane Aktionspotentiale von einem vibrodissociated CA1 Neuronen und (B)-Membran Spannung Antworten auf Hyperpolarisation und depolarisierende Strominjektionen in Current-Clamp-Aufnahmen von einer CA1 Neurons. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. (A) Repräsentative Signale der spontanen IPSCs aus CA1-Pyramidenzellen Neurons. Oder Bicucullin (20 uM; C); (BC) Die IPSCs wurden entweder gabazine (B 10 M) blockiert. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. TTX hemmt spontane GABAergen synaptischen Transmission und beseitigt präsynaptischen Calcium-Transienten im vibrodissociated Hippocampus Vorbereitung. (A) Aufnehmen von einem vibrodissociated Neuron vor und während der TTX-Anwendung. Beachten Sie die Abnahme der Frequenz und Amplitude der sIPSCs. (B) Calcium-Transienten in einem Fluo-4-geladen präsynaptischen Terminal auf einem vibrodissociated Neuron vor und während der TTX-Anwendung beobachtet. Beachten Sie den vollständigen Verlust von Transienten. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7. Gleichzeitige Calcium-Indikator Bildgebung und sIPSC whole-cell recording zeigt Auswirkungen der hohen K + Stimulation. (A) Fluoreszenz im Laufe der Zeit aus einer präsynaptischen Bouton mit Fluo-04.00 Farbstoff beladen gemessen. (B) bei gleichzeitiger Erhöhung der sIPSC Frequenz und Amplitude bei hohen K +-Anwendung. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig8.jpg" alt="Abbildung 8" /> Abbildung 8. Ca 2 +-abhängige High-K +-Antwort in präsynaptischen boutons von spH21 pyramidalen Neuronen aus dem Hippocampus CA1 Region. (A) Fluoreszenzbild einer vibrodissociated Neurons. (B) High-K +-Anwendung (durch schwarze Balken) führte zu einem anhaltenden Anstieg der Fluoreszenz in Gegenwart von unserer normalen extrazellulären Ca 2 +-haltigen Lösung (2 mM Ca2 +). Keine Fluoreszenz Anstieg war bei niedrigen extrazellulären Ca 2 + (0,2 mM Ca 2 +) zu beobachten. Daten in der Grafik wurden vor High-K +-Fluoreszenz wieder normalisiert, und zeigen durchschnittliche Antwortzeit von 3 boutons.

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Erfolgreiche vibrodissociation verlangt, dass Scheiben gesunden Neuronen enthalten und die Zwischenräume sind so flexibel, dass Neuronen, die Scheibe ohne toxische Schädigung zu beenden. So funktioniert die Technik optimal auf frühen postnatalen Alters (P1-21) bei gesunden Scheiben mit weniger Gliazellen / interstiatial Material als bei erwachsenen Hirnschnitten gefunden gemacht werden können. Nach unserer Erfahrung ist jedoch, die Optimierung der Scheibe Vorbereitung auf das neuronale Überleben in der Scheibe selbst als kontraproduktiv für die vibrodissociation Technik kann. Während wir routinemäßig vorzubereiten Scheiben für in-situ-Messung mit kaltem geändert aCSF, in denen Saccharose für einen Großteil der extrazellulären Na + und Ca 2 + ersetzt wurde, Scheiben für vibrodissociation hergestellten kann (z. B. Schnitt) in unserer normalen Aufnahme aCSF werden. Bei der Vorbereitung Scheiben für die Aufnahme von einzelnen Neuronen in den Scheiben selbst legen wir auch Scheiben im normalen aCSF bei 35 ° C kurz nach Schneiden und lassen Sie sie für 30-60 min bei dieser Temperatur, bevor sie dann wieder auf Raumtemperatur. Allerdings sind Scheiben für vibrodissociation vorbereitet sofort auf Raumtemperatur nur nach dem Schneiden bewegt. Diese Verfahren liefern eine höhere Ausbeute an gesunden Neuronen nach vibrodissociation, vielleicht wegen des Mangels an festen interstitiellen Gewebe, das Neuronen leichter geschüttelt werden locker von der Scheibe selbst erlaubt. Wir haben nicht erschöpfend Scheibe Vorbereitung Bedingungen untersucht, wie erhalten wir regelmäßig ausreichend Neuronen für unsere Aufnahme-und Imaging-Experimente an einem bestimmten Tag. Es ist möglich, dass zusätzliche Modifikationen, wie zum Beispiel Änderungen in Schichtdicke oder preincubaton Verfahren gemacht hätte, um die Ausbeute von gesunden Nervenzellen zu erhöhen. Sehr mild Protease-Behandlungen haben in dem Bemühen, die Zelle Ausbeute zu erhöhen und sich die Technik, bei älteren Tieren zu arbeiten versucht. Doch immer noch mild Protease-Behandlung scheint Synapse Funktion zu stören. Während also die Kombination von Protease-und mechanische Dissoziation kann noch gefunden zu arbeiten hat es nicht bewährt bisher in Vorderhirn Neuronen werden. Es sollte auch die relativ geringe Ausbeute von gesunden Neuronen festgestellt werden, nachdem vibrodissociation bedeutet, dass die Technik vor allem zur Untersuchung von reichlich neuronalen Subtypen, vor allem Projektion Neuronen. Die Verfügbarkeit von GFP-exprimierenden Mäusen, bei denen kleine neuronale Subpopulationen leicht identifiziert werden kann, erhöht die Chance, das Studium dieser selteneren Neuronen. Allerdings, es sei denn neuronalen Ertrag verbessert werden kann wesentlich Ansammlung von Daten auf diesen Neuronen ist wahrscheinlich relativ langsam. Mehrere Schritte haben sich als entscheidend für das erfolgreiche Laden von Neuronen mit Calcium-sensitiven Farbstoffen. Die Exposition gegenüber AM-veresterte Farbstoff wird bei 37 ° C durchgeführt, und wir haben bei dem Versuch, Farbstoff-Last bei niedrigeren Temperaturen erfolglos. Die Konzentration der Farbstoffe zu optimieren unter Berücksichtigung sowohl der Ladezeit und der Temperatur, da sie eine höhere Konzentration an Farbstoff-loading senkt Calcium-Konzentration in der präsynaptischen boutons erscheint. Wir haben beobachtet, dass das Laden mit höheren Konzentrationen sinkt die Frequenz und die Amplitude der sIPSCs. Beim Laden von Calcium-sensitiven Farbstoffe in präsynaptischen Endigungen vibrodissociated Neuronen, muss darauf geachtet werden, da die Pufferkapazität des kleinen präsynaptischen boutons kann anders sein als im Soma und die Größen der boutons sind nicht konsistent. Neuron-haltigen Speisen werden mit HEPES-gepufferte externe Lösung folgender Farbstoff-loading gewaschen, und die Recovery-Zeit nach dem Waschen ist entscheidend. Darüber hinaus, um eine gute Abdichtung für whole-cell recording machen, müssen die Zellen gründlich gewaschen werden, um loszuwerden, nicht verinnerlicht Farbstoffmoleküle aus der äußeren Zellmembran. Neben der Verwendung vibrodissociated Neuronen für Elektrophysiologie und Live Cell Imaging, können immunzytochemische Techniken auch für diese Zellen 11,12 angewendet werden. Die Zellen können leicht behoben werden und gefärbt mit einer Vielzahl von Antikörpern und anderen Zell-Markern. Die Verwendung dieser Zellen stellt eine saubere Vorbereitung für die Visualisierung der Proteinexpression in GABAergen präsynaptischen. Mit Mäusen, dass fluoreszierende Proteine ​​exprimieren unter der Kontrolle von Promotoren spezifische GABAerge Neuronen ermöglicht dem Forscher die einzelnen synaptischen Terminals in der die vibrodissociated Vorbereitung (Abbildung 1) zu identifizieren. Imaging Fluoreszenzmarker dieser Art können für die morphologische Messungen in den Terminals mit Hilfe von Laser-basierte Mikroskopie und neuere Techniken wie STED (Stimulation Emission Depletion-Mikroskopie) zu ermöglichen. Visualisierung mit Farbstoffen, die synaptischen Vesikel Radfahren Bericht ist auch mit diesem Präparat möglich. Akaike und Mitarbeiter haben GABAergen Terminals mit der Styryl-Farbstoff, FM1-43 markiert, um Anschlüsse in Wohn Zellen 4 visualisieren. Es sollte auch möglich sein, Single-Cell-Reverse-Transkriptase-PCR zum Profil RNA-Expression führen in vibrodissociatedNeuronen. Diese Technik wird routinemäßig enzymatisch gespalten Neuronen und Neuronen in Zellkultur gezüchtet angewendet.

<table border="1"><tbody><tr><td> Artikel </td><td> Firma </td><td> Catalog # </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Vibrating Tissue Slicer </td><td> Leica Microsystems Inc. </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Zellkulturschale (35 mm) </td><td> BD Falcon </td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td> Glass Bottom Dishes </td><td> Willco-Gericht </td><td> GWSB-5040 Oder GWSB-3522 </td><td> 0,16-0,19 mm Glasdicke für die Bildgebung </td></tr><tr><td> Piezoelektrische Manipulator </td><td> Exfo-Burleigh </td><td> LSS-3000 </td><td> Könnte auch Relais, etc. </td></tr><tr><td> SD9 Rechteckimpuls Stimulator </td><td> Grass Technologies </td><td> SD9K </td><td> Zur Ansteuerung piezoelektrischer Manipulator </td></tr><tr><td> Dissecting Stereoskop </td><td> Wild Heerbrugg </td><td> TYP 374590 </td><td> Könnte auch jedes Stereoskop </td></tr><tr><td> Flaming / Brown Mikropipette puller </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Dünnes Glaskapillaren </td><td> World Precision Instruments </td><td> TW-150F-4 </td><td> Für zugeschmolzen Glasmikropipette-und Patch-Mikropipette </td></tr><tr><td> Sechs-Kanal-Perfusion Valve Control System </td><td> Warner Instruments </td><td> VC-6 oder VC-6M </td><td></td></tr><tr><td> Perfusion Fast-Step </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-77B </td><td></td></tr><tr><td> Inverses Mikroskop mit 20-63x Ziele </td><td> Nikon </td><td> TS200 Diaphot </td><td></td></tr><tr><td> EMCCD Kamera </td><td> Andor Technology </td><td> iXon EM + DU-888 </td><td></td></tr><tr><td> Excite Fluoreszenz Beleuchtungslichtquelle </td><td> EXFO Photonics Solutions Inc. </td><td> X-Cite 120PC </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4, AM Calcium-Indikator </td><td> Molecular Probes </td><td> F14201 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibrodissociation of neurons from rodent brain slices to study synaptic transmission and image presynaptic terminals

Mechanische Dissoziation von Neuronen aus dem zentralen Nervensystem hat den Vorteil, dass präsynaptische boutons an der isolierten Neuronen des Interesses bleiben. Dies ermöglicht eine Untersuchung der synaptischen Übertragung unter Bedingungen, wo die extrazelluläre und intrazelluläre postsynaptischen Umgebungen gut kontrolliert werden kann. Eine Schwingung-basierte Technik ohne den Einsatz von Proteasen, wie vibrodissociation bekannt, ist die beliebteste Methode zur mechanischen Isolation. Eine Mikropipette, mit der Spitze feuerpolierte, um die Form einer kleinen Kugel, in einen Hirnschnitt aus einem P1-P21 Nagetier gemacht platziert. Die Mikropipette wird parallel zur Schnittfläche vibrierte und senkte durch die Schichtdicke sich in der Befreiung des isolierten Neuronen. Die isolierten Neuronen sind bereit für das Studium innerhalb von wenigen Minuten von vibrodissociation. Diese Technik hat Vorteile gegenüber der Verwendung von primären neuronalen Kulturen, Hirnschnitten und enzymatisch isolierten Neuronen ua: schnelle Produktion von lebensfähigen, relativ ausgereifte Neuronen für elektrophysiologische und bildgebende Verfahren; bessere Kontrolle der extrazellulären Umgebung frei von den Einflüssen der benachbarten Zellen; Eignung für gut kontrollierte pharmakologische Experimente mit schnellen Drug Application und insgesamt Zelle Superfusion und verbesserten Raum-Klemme in Ganzzellableitungen relativ zu Neuronen in Scheiben oder Zellkultur Vorbereitungen. Dieses Präparat kann zur synaptischen Physiologie, Pharmakologie, Modulation und Plastizität zu untersuchen. Real-time Bildgebung sowohl prä-und postsynaptischen Elemente in den lebenden Zellen und boutons ist auch mit vibrodissociated Neuronen. Charakterisierung der molekularen Bestandteile von prä-und postsynaptischen Elemente können auch mit immunologischen und Imaging-basierte Ansätze erreicht werden.

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Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Dieser Bericht zeigt eine Technik zur mechanischen Isolation von einzelnen Neuronen lebensfähig halten befestigt präsynaptischen boutons. Vibrodissociated Neuronen haben die Vorteile der schnellen Produktion, ausgezeichnete pharmakologische Kontrolle und verbesserten Raum-Klemme, ohne Einfluss von benachbarten Zellen. Diese Methode kann für die Bildgebung der synaptischen Elementen und Patch-Clamp-Aufzeichnung verwendet werden.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

vibrodissociation-neurons-from-rodent-brain-slices-to-study-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.4K Aufrufe.  National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Dieser Bericht zeigt eine Technik zur mechanischen Isolation von einzelnen Neuronen lebensfähig halten befestigt präsynaptischen boutons. Vibrodissociated Neuronen haben die Vorteile der schnellen Produktion, ausgezeichnete pharmakologische Kontrolle und verbesserten Raum-Klemme, ohne Einfluss von benachbarten Zellen. Diese Methode kann für die Bildgebung der synaptischen Elementen und Patch-Clamp-Aufzeichnung verwendet werden.

Serie: Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Herstellung von oligomeren β-Amyloid 1-42 Und Induktion der synaptischen Plastizität Impairment auf Schnitten des Hippocampus

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Forschung

Neurowissenschaften

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

DiOLISTIC Labeling von Neuronen aus Nager und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and amphetamine), the role it plays in psychiatric illnesses (e.g. schizophrenia and Attention Deficit Hyperactivity Disorder), and its involvement in degenerative disorders like Parkinson's and Huntington's disease. Under normal physiological conditions, dopamine is known to regulate locomotor activity, cognition, learning, emotional affect, and neuroendocrine hormone secretion. One of the largest densities of dopamine neurons is within the striatum, which can be divided in two distinct neuroanatomical regions known as the nucleus accumbens and the caudate-putamen. The objective is to illustrate a general protocol for slice fast-scan cyclic voltammetry (FSCV) within the mouse striatum. FSCV is a well-defined electrochemical technique providing the opportunity to measure dopamine release and uptake in real time in discrete brain regions. Carbon fiber microelectrodes (diameter of ~ 7 &mu;m) are used in FSCV to detect dopamine oxidation. The analytical advantage of using FSCV to detect dopamine is its enhanced temporal resolution of 100 milliseconds and spatial resolution of less than ten microns, providing complementary information to in vivo microdialysis.

Using fast-scan cyclic voltammetry to measure electrically evoked presynaptic dopamine dynamics in striatal brain slices.

Präsynaptische Dynamics in striatalen Hirnschnitten mit Fast-Scan-Cyclovoltammetrie

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Akute Dissoziation von Neunauge retikulospinale Axone in den Aufnahme von der Trennfläche Membran einzelner Funktions präsynaptischen aktivieren

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analyse Synaptische Modulation von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorezeptoren nach der Einwirkung von Längerer Licht

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

Anwendung von automatisierten Bild-geführten Patch-Clamp für die Studie von Neuronen in Gehirn-Scheiben

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

Bewertung der Synapse Dichte im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...