This work has been supported by NINDS, RO1NS52699 and MH84874 to SA. 
We would like to thank Dr. Dave Featherstone (Department of Biological Sciences, University for Illinois at Chicago) for providing us with the suture glue used in the immunohistochemistry work. We thank Michael Alpert for his comments and proofreading of the manuscript.

1. Herstellung von Poly-D-Lysin-Hydrobromid <ol><li> Vorbereitung 1 mg / ml Poly-D-Lysin-Hydrobromid in 0,1 M Boratpuffer (pH 8,5). </li><li> Aliquoten und bei -20 ° C. </li></ol> 2. Poly-Lysin-Beschichtung von Deckgläser Hinweis: Führen Sie alle Reinigungs und Beschichtungsschritte in einer laminaren Strömungskammer. <ol><li> Deck Ort in eine Petrischale mit 1 N Salzsäure (HCl) für 2 Stunden. </li><li> Saugen Sie alle HCl und spülen mit 70% Ethanol (EtOH) 2-3 x. </li><li> Lassen Sie in 70% EtOH für 1 Stunde. </li><li> Saugen Sie alle 70% EtOH und spülen Sie mit 100% EtOH 2-3x. </li><li> Lassen Sie in 100% EtOH für 2 Stunden. Saugen Sie alle EtOH. </li><li> Trocken tupfen und mit Filterpapier an der Luft trocknen für ein paar Sekunden. </li><li> Ort O / N auf 1 mg / ml Poly-Lysin-Lösung. </li><li> Spülen Deckgläser nächsten Tag mit Millipore-Wasser 4-5x. </li><li> Luft trocknen Poly-Lysin beschichtete Deckgläser auf Glasrollen in einer sauberen Petrischale. </li><li> Für immunohistochemistry, verwenden 35 x 10 mm Petrischale Deckel. Bereiten Sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) ausgekleidet Gerichte durch Gießen PDMS (Elastomer und Härter 10: 1 nach Gewicht) in die Schüssel zu einer Dicke von 0,3 cm und lassen bei 30 ° CO / N eingestellt. Sobald dies eingestellt, schneiden Sie ein 2 cm x 1 cm in die PDMS eingelassen. Sauber und Beschichtung der Einsatz mit Poly-Lysin folgenden wie oben erwähnt für Deck die gleichen Schritte. </li><li> Shop poly-Lysin beschichtete Deckgläser und Geschirr in der Laminar-Flow-Kammer bedeckt bis zur Verwendung (bis zu 2 Wochen, aber erzielen beste Ergebnisse Klebstoff durch die Vorbereitung regelmäßig alle 3-4 Tage). </li><li> Bereiten Sie eine PDMS-Block, der in der vibrierenden Gewebe Slicer Pin das Rückenmark. Mischung Elastomer A und Elastomer B 1: 1 beträgt. Gießen Sie in einer 100 x 15 mm Petrischale und lassen Sie O / N bei 30 ° C eingestellt. Schneiden Sie ein rechteckiges Stück der PMDS und kleben Sie es auf die Schneidegrundplatte mit Epoxy-Kleber. Lassen Sie den Kleber zur Festsetzung der PDMS in Kraft gesetzt und in Scheiben schneiden mehrere dünne Schnitte von der Oberfläche eine Wohnung zu erhaltenOberfläche, um das Gewebe zu fixieren. </li></ol> 3. Akute Dissoziation von Neunauge Rückenmark zu Isolierte retikulospinale Axone Ausbeute <ol><li> Betäuben eine ammoecoete oder Erwachsener Neunauge (Petromyzon marinus) mit Tricaine Methansulfonats (MS-222; 100 mg / L). Narkose hinzufügen in das Wasser, in einen Plastikbecher mit einem Deckel abgedeckt, die das Neunauge geopfert werden. </li><li> Enthaupten Neunauge in kaltem (4 ° C) Ringer-Lösung der folgenden Zusammensetzung (in mm): 130 NaCl, 2,1 KCl, 2,6 CaCl 2, 1,8 MgCl 2, 4 HEPES, 4 Dextrose (pH-Wert 7,6, die Osmolarität 270 mOsm) und nehmen Körper Wandmuskulatur Rückenfläche des Rückenmarks aus. </li><li> Hirnhaut entfernen Primitiva von der dorsalen Oberfläche des Rückenmarks mit einer feinen Pinzette. Sie ventralen Hirnhaut Primitiva in diesem Stadium nicht entfernen. </li><li> Geschnitten Rückenmark in 1 cm lange Stücke schneiden. </li><li> PIN eines Rückenmarkstück mit feinen Insektenstifte, dorsale Seite nach oben, auf ein PDMS ausgekleidet Schneiden BODENPLAte (siehe 2.12) in einer vibrierenden Gewebe Schneidemaschine Kammer mit eiskalter Ringer-Lösung. </li><li> Entfernen eines zentralen Abschnitts der dorsalen Säule des Rückenmarks durch Schneiden entlang der rostro-kaudalen Achse mit der Klinge, hinter intakte Rückenstützenabschnitte am rostralen und kaudalen Enden dienen als während der Dissoziation 2a und 2b behandelt. Verwenden langsamste Geschwindigkeit Einstellung, die das Schneiden und eine Tiefeneinstellung, die nur die dorsalen Säule Verlassen des zugrunde liegenden retikulospinale Axon Spalte unbeschädigt entfernt 2b ermöglicht. </li><li> Inkubieren Scheiben geschnitten Rückenmark Stücke bei RT für 45 min in einem Cocktail von 1 mg / ml Protease (Typ XIV aus Streptomyces griseus) und 1 mg / ml Kollagenase in Ringer-Lösung (Typ IA aus Clostridium histolyticum) (aus El Manira &amp; Bussières angepasst 1997 17). </li><li> Pin Enzym-behandelten Rückenmark Stücke mit feinen Nadeln in einem PDMS ausgekleidet Petrischale Containing Kälte (4 ° C) Ringer-Lösung. </li><li> Ventralen Hirnhaut entfernen Primitiva mit feinen Pinzette. </li><li> Geschnitten seitlichen Flächen des Rückenmarks mit einem Skalpell in der Mitte des geschnittenen Rückenabschnitt Verlassen der Mittelsäule retikulospinale Axone intakt in das Rückenmark 2d. </li><li> Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf dem Objektiv. </li><li> Legen Sie die Poly-Lysin beschichtete Deckglas (3a, Oberteil, rotes Rechteck) in den Schlitz der Aufnahmekammer 3 und Vakuum Fett auf alle Kanten (Raum zwischen roten und blauen Rechtecke in 3a, um eine Dichtung zu erleichtern. Schraube die oben einrasten. Setzen Sie die Kammer in dem Einsatz auf der Aufzeichnungs rig. </li><li> Hinzufügen Ringer-Lösung in die Aufzeichnungskammer unter Verwendung einer Pasteurpipette. </li><li> Schließen Sie den Abfluss Schlauch der Druckflasche mit Frostschutzmittel in die thermoelektrische Kühlvorrichtung Eingangsschlauch. Schließen Sie den Ausgut Schlauch der thermoelektrischen Kühlvorrichtung mit dem Eingangsende des Außenkühlmantel und dem Ausgangsende zu dem Reservoir 3b. </li><li> Legen Sie ein Stück des Rückenmarks zu einer Zeit, in der Aufnahme Kammer und sanft trennen das Rückenmark Aufrechterhaltung es entlang der Deckglas zu allen Zeiten mit Teflon beschichtet Pinzette bis Axone isoliert 2e und 2f. </li><li> Bringen des Aufzeichnungslösungstemperatur auf 10 ° C durch Leiten des unter Druck (Stickstoffgas in die Flasche geschoben) Frostschutzmittellösung (durch Verschiebung), über die thermoelektrische Kühlvorrichtung, durch die äußere Kühlmantel der Aufnahmekammer 3b. </li><li> Ermöglichen Axone für 1 h nach der Dissoziation bei 10 ° C erholen. </li></ol><img alt="Figur 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig2highres.jpg" width="400" /> <strong&gt; Abbildung 2. Schematische Darstellung der Dissoziation Protokoll für die Isolierung der Axone retikulospinale. (A) Entfernung von dorsalen Säule. Der Pfeil zeigt die Richtung des Schneidens des Gewebes. Die Rückenwirbel werden durch das Alphabet D (red Schriftfarbe) gekennzeichnet, während die ventralen Hörnern des Alphabets V (roter Schrift Farbe). (B) dorsalen Säule in dem zentralen Abschnitt des Rückenmarks Aussetzen der retikulospinale Axone entfernt (grüne Linien ). Die ventralen Hörner, die nach dem Schneiden Prozess intakt bleiben, werden durch das Alphabet V (rot Schriftfarbe) gekennzeichnet. (C) 45 min Behandlung mit Protease und Kollagenase Enzymen Cocktail (1 mg / ml). (D) Schneiden von Seitenbahnen des Rückenmarks; die die Position, Richtung und Ausmaß der seitlichen Schnitt. (e) mechanische Dissoziation des Rückenmarks. Pfeile zeigen Position der Zange und die Richtung der Trennkraft während Dissoziation. (F) Vertreve Beispiel dissoziiert retikulospinale Axon Vorbereitung. Grüne Pfeile markieren Bereiche mit akut dissoziiert retikulospinale Axone ohne postsynaptischen Prozesse. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Schematische Darstellung der Aufnahme Kammer für die Elektrophysiologie Experimente. Maße vorgesehenen Zoll. In basepiece Diagramm (a) gezeigt rote Rechteck zeigt Positionierung des Deckglases in dem Deckglas Nut in der basepiece. Der Bereich zwischen der roten und blauen Rechteck, in dem basepiece Diagramm (a) gezeigt ist, wo die Hochvakuumfett angewendet wird. (B) zeigt die Aufnahme Kammer montiert. 4. Kennzeichnung und Identifizierung von präsynaptischen Enden mit FM 1-43 <ol><li> Beschriften Sie präsynaptischen Terminals, durch den Einbau von FM 1-43 in vesicles während der synaptischen exo-Endozytose in der Hoch K + Depolarisation. Perfundieren Vorbereitung mit 5 uM FM 1-43 (in 5 ml Ringer-Lösung, die 30 mM KCl). </li><li> Perfusion Präparat mit 1 mg / ml Advasep-7 (in 5 ml Ringer-Lösung), um überschüssigen Farbstoff FM) 18 zu entfernen. </li><li> Perfusion Zubereitung mit Ringerlösung für 15 Minuten, um jede Remant Farbstoff und dem Advasep auszuwaschen. </li><li> Bild mit 100 × Ölimmersionsobjektiv (NA 1,25) an einem invertierten Fluoreszenzmikroskop, in Verbindung mit einer digitalen CCD-Kamera und Bildaufnahme-Software Mikromanager unter Verwendung von Standardfluoreszenzbildgebungsprotokolle. </li><li> Identifizieren fluoreszenzmarkierten präsynaptischen Enden für die Aufnahme 4c und 4d Ziel. </li></ol> 5. Immunhistochemie von isolierten retikulospinale Axone <ol><li> Füllen Gericht Einsatz (Protokoll Abschnitt 2.10.) Mit zweiwertigen Ionen (Ca 2 + und Mg 2 +) kostenlosRinger-Lösung. </li><li> Fertigen Patch-Pipetten in einem P-87-Mikropipette Puller. Legen Sie eine kleine Menge von Nahtkleber an einem Ende des Poly-Lysin-Einschub mit einer Patch-Pipette (1,5 mm Durchmesser Glasaußen) und Absaugung (mit einem Silikonschlauch 0,89 mm Innendurchmesser mit einer Mikropipette Spitze an der Ansaugseite beigefügt). </li><li> Führen Sie Dissoziationen mit dem gleichen Verfahren wie in Abschnitt 3 Protokoll 2 erwähnt. Platzieren Sie ein Ende des Rückenmarks auf der Naht Kleber und drücken Sie vorsichtig mit einer Pinzette, um sie stark an der Oberfläche haftet. Legen Sie einen Tropfen Leim Naht am anderen Ende des Einsatzes und sanft dehnen das Rückenmark bis Axone dissoziiert sind und sich die freie Ende des Rückenmarks, indem Sie sie vorsichtig über die Nahtkleber. Fixieren durch sanftes Herunterdrücken mit der Zange. </li><li> Austausch zweiwertigen Ringerlösung mit regelmäßigen Ringer-Lösung durch Perfusion. </li><li> Axone erlauben, für 20 min nach dissoc erholeniation bei 10 ° C aufweist. </li><li> Fix dissoziiert Axone in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min {in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, (mM) NaCl 137, KCl 2,7, Na 2 HPO 4 10 KH 2 PO 4 1,8, pH 7,4) hergestellt}. Filtern PFA Lösung vor, indem sie durch einen 0,2 um-Spritzenfilter verwenden. </li><li> Auswaschen der PFA durch Perfusion 0,1 M Glycin (in PBS) für 10 min. </li><li> Inkubieren in 0,1% Triton-X (in PBS) für 10 min. </li><li> Durch Perfusion PBS für 20 min waschen. </li><li> Blockieren mit 5% fettfreier Milch (in PBS) für 6 Stunden bei 4 ° C ist. </li><li> Fügen Sie in primären Antikörpers an VGCC von Interesse (1: 200-Verdünnung in PBS) und Inkubation für 20 h bei 4 ° C. </li><li> Durch Perfusion PBS für 20 min waschen. </li><li> Blockieren mit 5% fettfreier Milch (in PBS) für 10 min bei 4 ° C ist. </li><li> Fügen in sekundären Antikörper (1: 400-Verdünnung in PBS) und Inkubation in Dunkelheit für 2 h bei 4 ° C ist. </li><li> Durch Perfusion mit PBS für 20 min waschen. </li><li> Block mit 1% Rinderserum Albumin (in PBS) für 20 min. </li><li> Fügen Sie in Alexa Fluor 488 Phalloidin (5 Einheiten / ul Arbeitskonzentration; Lager in Methanol 200 Einheiten / ml) hergestellt. </li><li> Durch Perfusion mit PBS für 20 min waschen. </li><li> Bild mit 100X Wasserimmersionslinse auf konfokalen Mikroskop. </li></ol> 6. Elektrophysiologische Aufnahme <ol><li> Herzustellen Aluminosilicatglas Patch-Pipetten (2-5 Pipettenwiderstand MQ) in einem P-87-Mikropipette Puller. Design Patch-Pipette, so dass Pipettenspitze umfasst ganze präsynaptischen Terminal Durchmesser. </li><li> PDMS Mantel Patchpipetten durch Eintauchen der Patch-Pipette unter 50-60 psi Druck in PDMS 23 (Anschluss Silikonschlauch, 0,89 mm Innendurchmesser, mit einem Stickstoffgaszylinder verbunden ist, um das hintere Ende der Patch-Pipette) und Trocknen unter Verwendung einer Heiß Pistole. Alternativ manuell Beschichtung der Pipette mit PDMS, eine Beschichtung, so nahe an der Spitze, wie möglich, unter einer zusammengesetzten Mikroskop. </li><li> Feuerpolitur Patch-Pipetten mit einem MICRoforge (a custom built Platin Filament auf die Bühne einer Verbindung Mikroskop montiert). </li><li> Identifizieren isoliert Axone zeigen beschriftet präsynaptischen Enden durch Fluoreszenzmikroskopie. </li><li> Füllen Aufzeichnungslösung (Ca 2 + entwickelt, um Ströme zu isolieren; 10 mM CaCl 2 oder 90 mM BaCl 2 als Ladungsträger, gepufferte HEPES pH 7,6, Osmolarität 270 mOsm) in der Patch-Pipette mit einer Spritze. </li><li> Legen Patch-Pipette in die Pipettenhalter und Position über Bad mit einem motorisierten Manipulator MP225. Senken Sie die Patch-Pipette in das Bad und die Position gegen das Gesicht eines fluoreszenz identifiziert präsynaptischen Terminal. </li><li> Schieben Sie den Patch-Pipette langsam, bis ein Kontakt mit der Membran gemacht. Zu diesem Zeitpunkt erreicht eine Gigaohm Dichtung durch sanftes Saugen Mund durch einen Schlauch der Pipettenhalter befestigt. </li><li> Um die für die Aufnahme einzelner Kanal Ca2 + Ströme benötigt extrem niedrigen Hintergrundgeräuschpegel zu erreichen, benötigen Sie ein Axopatch 200B mit einer gekühlten heads für die Aufnahmen. Beispieldaten bei 20-50 kHz und Filter mit einem 5 kHz Bessel-Filter. Führen Sie die Datenerfassung mit Hilfe eines Axograph X. </li><li> Verwenden Sie ein Standard-Schritt-Protokoll, in Schritten von 10 mV als Stimulus. Enthalten einen Vorimpuls in dem Protokoll, vor der Schritt-Protokoll, um eine maximale Aktivierung von Ca 2 +-Kanäle zu gewährleisten. Integrieren Sie eine 10 mV Leck Schritt in die Schritt-Protokoll für die post-Analyse Subtraktion der Leckströme. </li></ol>

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The authors do not have any competing financial interests or other conflicts of interest to disclose.

Unsere Dissoziation Protokoll ist durch Abgabe isoliert retikulospinale Axonen frei von Projektionen postsynaptischen 2f signifikant, aber dennoch funktionellen präsynaptischen 4c und 4d zu behalten. Das Fehlen von postsynaptischen Prozesse gegen die präsynaptischen Terminal ermöglicht den direkten Zugriff auf die Aufnahme der präsynaptischen Membran Trennfläche bei Einzel präsynaptischen Terminals, die zuvor in zentralen Synapsen nicht möglich ist und in nur zwe...

Synaptischen Übertragung ist eine extrem schnelle und präzise Prozess. Aktionspotential Invasion der präsynaptischen Terminal führt zum Öffnen VGCCs in der Trennfläche Membran, die daraus resultierende Erhöhung der präsynaptischen Ca2 + als Auslöser für die Fusion von Vesikeln und die Freisetzung von Neurotransmittern 1 wirkenden entfernt. Alle diese Schritte werden innerhalb von hundert Mikrosekunden 2, und erfordern daher enge räumliche Kopplung von VGCCs auf die Fusion von Vesikeln Maschinen 3. Präsynaptischen Ca2 + Flüsse wurden in erster Linie durch bildgebende Ansätze mit Ca2 +-sensitiven Farbstoffen 4 gekennzeichnet. Einbau Ca 2 +-Puffer, die Ca 2 + modulieren präsynaptischen Neuronen wurde verwendet, um indirekt zu charakterisieren, die die Beziehung zwischen präsynaptischen Calcium und Neurotransmission 3. Darüber hinaus Modulation der präsynaptischen Ca2 +-Konzentration frei von Uncaging Ca 2 + 5 oder Aufnahme macroscopic Ca 2 + Strömungen in Verbindung mit Maßnahmen der Fusion von Vesikeln und / oder Freisetzung verwendet; wie Kapazitätsmessungen 6 oder postsynaptischen Antworten 2, um die gleiche Frage anzugehen. Allerdings Charakterisierung Ca2 + Ströme direkt an der Trennfläche, die Fachgruppe der präsynaptischen Membran, wo Depolarisation der Membran ist in Ca 2 + übersetzt Ströme Auslösung synaptischen Vesikel Fusion und Freisetzung von Neurotransmittern, ist integraler Bestandteil erhalten eine genaue Messung der Ca 2 + Voraussetzung für die synaptischen Vesikel Fusion. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, direkt zu charakterisieren Ca2 + Ströme an einzelnen präsynaptischen Enden, verbunden mit genauen gleichzeitige Messungen Vesikelverschmelzung und Freisetzung ermöglicht eine genaue Erläuterung der zeitlichen Beziehung zwischen dem Zeitverlauf des Aktionspotentials, präsynaptischen Ca 2 + Strom, Fusion von Vesikeln und loslassen. Zugriff auf die Trennfläche Membranist nicht in der Mehrheit der präsynaptischen Enden durch Anlagerung von den postsynaptischen Dendriten zu schließen. Diese Unzugänglichkeit ist ein großes Hindernis bei der Charakterisierung von VGCCs, da es verhindert, dass direkte Messungen von Strom an einzelnen präsynaptischen Terminals. Direkte Charakterisierung der präsynaptischen Ca2 + Ströme bei einzelnen präsynaptischen bisher nicht im Zentrum von Synapsen möglich und wurde nur in zwei Kelchtyp präsynaptischen erreicht worden; Kelch-Typ-Synapse der Küken Ciliarganglion 7-10 und Ratten Kelche 11,12. In allen anderen präsynaptischen einschließlich der riesigen retikulospinale Synapse in der Neunauge Rückenmark 13, hat der Mangel an Zugang zu der präsynaptischen Membran Trennfläche die Verwendung der indirekten Ansätze notwendig, wie Ca 2 +-Bildgebung zu präsynaptischen Ca2 + Flüsse zu studieren. <img alt="Figur 1" fo: content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Abbildung 1. Neunauge Riesen retikulospinale Synapse. (A) Querschnitt von Neunauge Rückenmark zeigt dorso-ventralen Ausrichtung. Retikulospinale Axone sind mit grünen Stern markiert. (B) 3-D-Rekonstruktion des retikulospinale Synapse im Rückenmark, die Neunauge präsynaptischen Axon retikulospinale machen zahlreiche en passant Kontakte (durch grüne Pfeile markiert) auf der postsynaptischen Neuron 13. Präsynaptischen Terminals wurden mit Alexa Fluor 488 Hydrazid Phalloidin (grün) markiert worden, während der postsynaptischen Neuron mit Alexa Fluor 568 Hydrazid (rot) gefüllt wurde. Neunauge Riesen retikulospinale Axone, in der ventralen Region des Rückenmarks parallel zur rostral-kaudale Achse 1a, Form mehrerer en passant synaptische Kontakte liegt auf Neuronen desVorderhorn des Rücken 14 1b 13. Makroskopischen Ganzzell Ca2 + Ströme wurden von retikulospinale Axone im Rückenmark intakt 13,15 aufgezeichnet. Allerdings vorherigen Blindversuche direkte Messung von Ca2 + Ströme in retikulospinale Axone im Rückenmark intakt Neunauge mit Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik erfolglos 13 aufgrund fehlender Zugang zu der präsynaptischen Membran Trennfläche durch den gegenüberliegenden postsynaptischen Prozesse bewährt Abbildung 1b. Die Trennfläche Membran zuvor zugänglich durch Entfernen der postsynaptischen Neuron 11, mechanische Störung des Synapse vor der Aufzeichnung 12 oder enzymatische Behandlung in Verbindung mit mechanischer Dissoziation 16 hergestellt. Angesichts der komplexen Organisation des Rückenmarks, kann es äußerst schwierig sein würde, die postsynaptischen Neuron identifizieren und zurückgezogen werden mechanisch oder stören the Synapse. Daher haben wir beschlossen, enzymatische Behandlung 17, gefolgt von mechanischen Dissoziation zu verwenden. Mit diesem Ansatz haben wir eine akut dissoziierten Vorbereitung der Neunauge Rückenmark, das lebensfähig isoliert retikulospinale Axone mit funktionellen präsynaptischen ohne jegliche postsynaptischen Prozesse ergibt entwickelt, wodurch eine uneingeschränkte Zugriff auf die einzelnen präsynaptischen Terminals. In Verbindung mit einem Standard-Umkehrmikroskop und Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht es uns zu erkennen und gezielt einzelne fluoreszenz identifiziert präsynaptischen Terminals, mit einer Patch-Pipette, die eine Aufzeichnungslösung, die Ca 2 + Ströme 4c und 4d-Isolate, für die Aufnahme mit zell angebracht Voltage-Clamp-Technik. Ca 2 + Ströme wurden direkt an der präsynaptischen Membran Trennfläche der einzelnen präsynaptischen 4f aufgezeichnet. Dies ist eine significaNT im Bereich der synaptischen Übertragung Durchbruch, da es die erste derartige Aufnahme bei zentralen Synapsen durchgeführt werden soll.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="713">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:211px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td style="width:211px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">22x60 mm coverslips</td>
			<td style="width:211px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12545J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Advasep-7</td>
			<td style="width:211px;">Cydex Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">ADV7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A21070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Antifreeze</td>
			<td style="width:211px;">Prestone</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bright field light source</td>
			<td style="width:211px;">Dolan-Jenner</td>
			<td style="width:119px;">Fiberlite 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Collagenase Type IA from Cloristridium histolyticum</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Cover slip</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-545-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dextrose</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Digital CCD Camera</td>
			<td style="width:211px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C8484-03G01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection fine forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:211px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">Leica MZ 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection scissors</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15025-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection scissors fine</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection scissors ultra fine</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">FM 1-43</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T3163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">High vacuum grease</td>
			<td style="width:211px;">Dow-Corning</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:211px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">SA-56-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Immersion oil</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Industrial grade Nitrogen gas tank</td>
			<td style="width:211px;">Praxair</td>
			<td style="width:119px;">UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Insect pins</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Liquid suture glue</td>
			<td>Braun Veterinary Cair Division</td>
			<td style="width:119px;">8V0305</td>
			<td>The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">154903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Non-fat dry milk</td>
			<td style="width:211px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">9999S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">P-87 Micropipette puller</td>
			<td style="width:211px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Perfusion pump</td>
			<td style="width:211px;">Cole-Palmer</td>
			<td style="width:119px;">Masterflex C/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Petri dish 100x15 mm</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Petri dish 35x10 mm</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1024</td>
			<td>MW &#62; 300000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Primary antibodiesR-type calcium channel</td>
			<td style="width:211px;">Alomone Labs</td>
			<td style="width:119px;">ACC-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Protease Type XIV from Streptomyces griseus</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:211px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Schot Duran Preesure Bottle</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-841-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Silicone tubing for glue application</td>
			<td style="width:211px;">Cole-Palmer</td>
			<td>07625-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Slicing base plate</td>
			<td style="width:211px;">Leica Biosystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14046327404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Slicing chamber</td>
			<td style="width:211px;">Leica Biosystems</td>
			<td align="right">1.4046E+10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;">S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium tetraborate</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B3545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:211px;">Dow Corning&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD&#174; 160</td>
			<td>To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:211px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD&#174; 184&#160;</td>
			<td>To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Teflon coated forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11626-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine methanesulphonate</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Vibratome blades</td>
			<td style="width:211px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BLADES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Xenon lamp</td>
			<td style="width:211px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute dissociation of lamprey reticulospinal axons to enable recording from the release face membrane of individual functional presynaptic terminals

Synaptischen Übertragung ist ein extrem schnelles Verfahren. Aktionspotential angetrieben Einstrom von Ca 2 + in den präsynaptischen Terminal durch spannungsabhängige Kalziumkanäle (VGCCs) in der Trennfläche Membran befindet, ist der Auslöser für die Fusion von Vesikeln und die Freisetzung von Neurotransmittern. Entscheidend für die Schnelligkeit der synaptischen Übertragung ist die räumliche und zeitliche Synchronität zwischen der Ankunft des Aktionspotentials, VGCCs und der Neurotransmitter-Freisetzung Maschinen. Die Möglichkeit, direkt aufzeichnen Ca2 + Ströme von der Trennfläche Membran der einzelnen präsynaptischen ist zwingend notwendig für eine genaue Verständnis der Beziehung zwischen präsynaptischen Ca2 + und die Freisetzung von Neurotransmittern. Zugang zu der präsynaptischen Membran Trennfläche für elektrophysiologische Aufzeichnung ist nicht verfügbar in den meisten Präparaten und präsynaptischen Ca2 +-Eintrag wurde mit bildgebenden Techniken und makroskopischen Strom MeasureMe gekennzeichnetNTS - Techniken, die nicht über ausreichende zeitliche Auflösung zu Ca 2 +-Eintrag zu visualisieren. Die Charakterisierung der VGCCs direkt an einzelnen präsynaptischen war nicht in zentralen Synapsen möglich und wurde bisher erfolgreich nur in der Kelch-Typ-Synapse des Kükens Ciliarganglion und in Ratten Kelche erreicht. Wir haben erfolgreich in der Riesensynapse retikulospinale der Neunauge Rückenmark durch die Entwicklung einer akut dissoziierten Vorbereitung des Rückenmarks, die isoliert retikulospinale Axone mit funktionellen präsynaptischen frei von postsynaptischen Strukturen ergibt adressiert dieses Problem. Wir können fluoreszenzkennzeichnen und zu identifizieren einzelnen präsynaptischen und Ziel sie für die Aufnahme. Mit dieser Vorbereitung, wir haben VGCCs direkt an der Trennfläche der einzelnen präsynaptischen Enden mittels Immunhistochemie und Elektro Ansätze aus. Ca 2 + Ströme wurden direkt an der Trennfläche Membran o aufgezeichnetf einzelnen präsynaptischen Terminals, die erste derartige Aufnahme an zentralen Synapsen durchgeführt werden.

<html> Diese Dissoziation Protokoll Erträge gesunde und funktionelle isoliert retikulospinale Axonen frei von Projektionen postsynaptischen 2f, die aber dennoch behalten funktionellen präsynaptischen Enden der Lage, hervorgerufen synaptischen Vesikel Exo-und Endozytose 4c und 4d. Abschnitte der isolierten Regionen der retikulospinale Axone kann unter Lichtmikroskopie eindeutig identifiziert werden klar von anderen neuronalen Prozesse ermöglicht uneingeschränkten Zugr...

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Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Akute Dissoziation von Neunauge retikulospinale Axone in den Aufnahme von der Trennfläche Membran einzelner Funktions präsynaptischen aktivieren

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

acute-dissociation-lamprey-reticulospinal-axons-to-enable-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Aufrufe.  University of Illinois at Chicago. Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals. 

Serie: Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

Die Subventrikularzone En-face: Wholemount Färbung und Ependymale Durchfluss

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Forschung

Neurowissenschaften

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser-Nanochirurgie der Kleinhirn-Axone<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

Mess Spinal Präsynaptische Hemmung bei Mäusen durch Spinalgan Mögliche Aufnahme<em&gt; In Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Live-Imaging von Nikotin induzierte Calcium Signaling und Neurotransmitterausschüttung Zusammen Ventral Hippocampus Axone

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.