Wir möchten Marc Leonard von der Carleton Immersive Media Studio danken für kompetente technische Unterstützung bei der Video-Produktion und-Bearbeitung und Dr. Martin Bertrand von der Carleton Immersive Media Studio / Neural Regeneration Labor für visuelle Modell Unterstützung. Die Autoren danken der Sachverständigengutachten von Dr. Marilyn Keaney und alle ihre engagierte Mitarbeiter an der University of Ottawa Animal Care und Veterinärwesen. Diese Arbeit wurde von der kanadischen Institute of Health Research (CIHR, MOP 62826) um SALB, der CIHR Institute of Aging and Strategic Training Initiative in Health Research / CIHR Training Program in Neurodegenerative Lipidomics (TGF 96.121) an SALB und SF, Canadian Foundation finanziert für Innovation zu SF, Ontario Innovation Trust SF und Autodesk Forschung zur SF. ACM erhält eine CIHR Banting und Best Promotion Award. NV erhält eine post-professionellen Stipendium Institute of Aging und CIHR Training Program in Neurodegenerative Lipidomics.

Ein. Herstellung von Reagenzien <ol><li> Für sterile vaginalen Lavage, autoklavieren doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O) und an einem fest verschlossenen Behälter bei Raumtemperatur bis benötigt. </li><li> Für zytologische Beurteilung mit 0,1 g Kristallviolett Pulver zu 100 ml ddH 2 O. Gut mischen. Kristallviolett Fleck (0,1%) in einem dicht verschlossenen Behälter bei Raumtemperatur gelagert werden, bis sie benötigt. </li></ol> 2. Sammeln Vaginal Cells (Vaginal Lavage) <ol><li> Legen Sie eine Latexball am Ende einer sterilen 200 ul Spitze und erarbeiten rund 100 ul sterilem ddH 2 O mit den Abstufungen an der Spitze als Volumen Leitlinie. </li><li> Heben Sie die Maus aus ihrem Käfig und platzieren Sie sie auf dem Käfig Trichter (Deckel) mit ihren Hinterbeinen / Heck zu Ihnen. </li><li> Fassen Sie den Schwanz und heben das Heck. Die Maus wird jetzt nur noch ihren Vorderpfoten Ergreifen des Trichters. An diesem Punkt der Maus kann urinieren. Falls ja, Bis Wasserlassen Haltestellen warten. Sollte es Urin bei der Einfahrt zum Vaginalkanals übrig sein, können Sie die Öffnung mit einem Überschuss ddH2O mit einem separaten Spitze (dh, nicht Ihre Probenentnahme Spitze) spülen. </li><li> Legen Sie das Ende des ddH 2 O gefüllten Spitze an der Öffnung des Vaginalkanals darauf achten, dass nicht durch die Öffnung als vaginale (und Gebärmutterhalskrebs) Stimulation kann Scheinträchtigkeit bei Ratten 1,2 induzieren. Jüngste Berichte deuten Mäuse sind weniger anfällig für diesen Effekt jedoch darauf geachtet werden sollte, um den Grad der Invasivität in wiederholten Analysen 3 zu minimieren. </li><li> Vorsichtig drücken Sie die Lampe, um ein Viertel bis die Hälfte des Volumens von Wasser (~ 25-50 ul) bei der Eröffnung der vaginalen Kanal zu vertreiben. Die Flüssigkeit wird spontan in den Kanal absaugen ohne Spitze Insertion. Langsam den Druck auf den Kolben ausgeübt wird. Die Flüssigkeit wird sich zurückziehen wieder in die Spitze. Vermeiden Druckentlastung zu schnell, um eine Aspiration von Flüssigkeit zu verhindernin den Kolben. Eine gefilterte Spitze kann für diesen Zweck nützlich. </li><li> Wiederholen der vorhergehenden Schritt 4-5 mal mit der gleichen Spitze, Birne, und Fluid, um eine ausreichende Anzahl von Zellen in einer einzelnen Probe zu erhalten. </li><li> Legen Sie die Flüssigkeit auf Objektträger aus Glas, und lassen Sie die Schmierschicht vollständig bei Raumtemperatur trocknen. Nach dem Trocknen können diese Östrus Abstriche sofort gefärbt oder gespeichert werden und gefärbt zu einem späteren Zeitpunkt. </li></ol> 3. Zytologische Färbung mit Kristallviolett * 4 <ol><li> Setzen Sie den trockenen Folie in einer Coplin (oder andere vergleichbare Färbung Gefäß) mit dem Kristallviolett für 1 min färben. </li><li> Entfernen Sie mit einem zweiten Glasküvette mit ddH 2 O. Waschen Sie den Schlitten mit ddH 2 O für 1 min. Wiederholen. </li><li> Entfernen Sie das überschüssige ddH 2 O von den Rändern der Folie mit einem leichten Gewebe Scheibenwischer, Vermeidung von Kontakt mit dem gefärbten Abstrich. </li><li> Pipette etwa 15 ul von Glycerin auf der Schmierschicht und Deckelrutschen. Alternativ können auch andere Reagenzien histologischen Montage genutzt werden, um eine dauerhafte, nicht-diffundierenden Farbstoff erhalten. </li></ol> * Die Färbung hier beschriebenen Verfahren ist die einfachste Verfahren, das in jedem Labor durchgeführt werden kann. Andere Methoden können zusätzliche Details. Zum Beispiel, mit Papanicolaou-Färbung, kann die Laufzeit von kernhaltige Epithelzellen mit weniger reifen Zellen gefärbt Türkis und reiferen Zellen pink-oder orange-gefärbten unterschieden werden. Diese Unterschiede können verwendet werden, um früh oder spät Proöstrus inszenieren. 4 4. Vaginalzytologie <ol><li> Untersuchen Sie die Schmierschicht unter dem Lichtmikroskop zu bestimmen Zelltypen vor. Die mikroskopische Untersuchung sollte sofort nach der Färbung als die Kristallviolett wird von den Zellen im Laufe der Zeit diffundieren bei Verwendung von Glycerin zum Eindecken durchgeführt werden. Mikrofotografien sollten zum Zeitpunkt der Analyse entnommen werden zur Zytologie dokumentieren. </li><li> Beginnen Sie mit der Überprüfung der entire-Abstrich bei einer niedrigeren Vergrößerung. Wählen Sie einen repräsentativen Bereich und auf eine höhere Vergrößerung. Sie werden sehen, verhornten Plattenepithel Epithelzellen, Leukozyten und / oder kernhaltige Epithelzellen (repräsentative Ergebnisse, 1A-C). Das Verhältnis der vorhandenen Zellen ermöglicht es Ihnen, die Östrus Stadium der Maus zum Zeitpunkt der Probennahme (repräsentative Ergebnisse, 1D-G) und ihre unmittelbaren hormonellen Status (Diskussion, Abbildung 2) zu bestimmen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Zytologie: Drei primäre Zelltypen in Vaginalabstrich Proben nachgewiesen werden: (1) kernhaltige Epithelzellen (Abbildung 1A), (2) verhornten Plattenepithel Epithelzellen (Abbildung 1B), und (3) Leukozyten (1C). Kernhaltige Epithelzellen haben einen leicht gefärbten Zytoplasma, dunkler gefärbten Plasmamembran, und einen ovalen Kern ( <strong&gt; Abbildung 1A). Verhornten Plattenepithelzellen gleichmäßig gefärbte, mehr polygonale Form als ihre kernhaltige Epithelzellen Vorgänger, und es fehlt ihnen einen Kern (1B). Polymorphkernigen Leukozyten aus Epithelzellen durch ihre unregelmäßige Form, dunkel gebeizt polymorphe Kerne, und die geringe Größe (1C, schwarze Pfeile) unterschieden werden. Sollte Urin Verunreinigung der Schmierschicht sein werden Harnsäurekristallen leicht durch ihre kristalline Strukturen unähnlich alle erwarteten Zelltypen (Abbildung 3) detektiert. Sollte dies geschehen, und obskuren Erfassung der vorherrschenden Zelltyp, sollte der Abstrich verworfen und nicht für die Inszenierung verwendet. Inszenierung: Das relative Verhältnis von Zelltypen in Schlieren beobachtet werden verwendet, um die Phase des Östrus-Zyklus der Maus am Tag der Probennahme (1D-G) zu identifizieren. Während Proöstrus sind Zellen fast ausschließlichCluster von runden, wohlgeformten kernhaltige Epithelzellen (1D, repräsentative Zelle durch weißen Pfeil angedeutet). Während Brunst, werden die Zellen überwiegend Plattenepithelzellen, in dicht gepackten Clustern (1E, repräsentative Zelle durch Pfeilspitze angezeigt) verhornten. Während Metöstrus überwiegen kleine dunkel gefärbte Leukozyten (1F, repräsentative Zelle durch schwarzen Pfeil angedeutet). Verhornten Plattenepithelzellen kann beobachtet werden, oft in Fragmente, (1F, repräsentative Zelle durch schwarze Pfeilspitze angegeben). Während Diöstrus, seltene verhornten Plattenepithel Epithelzellen noch vorhanden sein können (Abbildung 1G, repräsentativen Zelle durch schwarze Pfeilspitze angezeigt), aber Leukozyten noch überwiegen (1G, repräsentative Zelle durch schwarzen Pfeil angedeutet). Metöstrus aus Diöstrus durch das Auftreten von kernhaltige Epithelzellen in Diöstrus (unterschieden werden <stron<html> g&gt; 1G, angegeben repräsentativen Zelle weißer Pfeil). <img src="/files/ftp_upload/4389/4389fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Zytologische Beurteilung Vaginalabstrichen kann zur Östrus Stufe identifizieren Drei Zelltypen sind in Vaginalabstrich Proben nachgewiesen:. (A) kernhaltige Epithelzellen, (B) verhornten Plattenepithelzellen und (C) Leukozyten. Das Verhältnis dieser Zelltypen in der Schmierschicht verwendet, um Mäuse in (D) Proöstrus, (E) Östrus, (F) Metöstrus, oder (G) wie in Diöstrus repräsentative Ergebnisse beschrieben identifizieren. Schwarze Pfeilspitzen in E, F und G-Punkt repräsentativ verhornten Plattenepithel Epithelzellen. Schwarze Pfeile in C, F und G-Punkt repräsentativ leykocytes. Weiße Pfeile in D und G Highlight repräsentativen kernhaltige Epithelzellen. . Jpg &quot;alt =&quot; Bild 2 &quot;/&gt; Abbildung 2. Vaginal-Abstrich Zytologie spiegelt zugrunde liegenden endokrinen Veranstaltungen. Details sind auch in der Diskussion zur Verfügung gestellt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4389/4389fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img src="/files/ftp_upload/4389/4389fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Harnsäurekristallen vorliegen können folgende Kristallviolettfärbung von Urin kontaminierten Proben sein. (A) Kristalle transparent sind und in verschiedenen Größen (Pfeile und verpackt Region (B) vergrößert) sein. Keine Zellen vorhanden sind in diesem Bereich. Sollte Harnsäure Kristall Kontamination innerhalb der Felder für die zytologische Färbung verwendet vorhanden sein, kann es schwierig sein, genau zu identifizieren Zelltypen vorhanden und der Abstrich sollte verworfen werden. Maßstabsbalken = 50 um.

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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrous+cycle+modulates+ovarian+carcinoma+growth.">Estrous cycle modulates ovarian carcinoma growth.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 15, 2971-2978 (2009).</li><li>Jemiolo, B., Harvey, S., Novotny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+the+Whitten+effect+in+female+mice+by+synthetic+analogs+of+male+urinary+constituents.">Promotion of the Whitten effect in female mice by synthetic analogs of male urinary constituents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4576-4579 (1986).</li></ol>

Die Autoren erklären, keinen Interessenkonflikt. Alle Experimente an Tieren wurden in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der University of Ottawa Animal Care Committee und des Canadian Council on Animal Pflegeset durchgeführt.

Diese Veränderungen in der Zelle Typologie sind indikativ der zugrunde liegenden endokrinen Veranstaltungen. Die Phase des Proöstrus Östrocyclus entspricht der menschlichen follikulären Phase des Menstruationszyklus 5 und wird durch einen präovulatorischen Erhöhung des zirkulierenden 17-β-Estradiol Ebenen 6, sowie einem kleinen Anstieg der Prolaktin 7 (Abbildung 2 definiert, Proöstrus, links). Die Zunahme der 17-β-Estradiol stimuliert indirekt Gonadotropin-Releasing-Hormon-Neuronen im Hypothalamus und Septum, das wiederum aktivieren reagierenden Zellen im Hypophysenvorderlappen zu Luteinisierungshormon und Follikel-stimulierendes Hormon in den Kreislauf 8,9 freisetzen (Abbildung 2 , Proöstrus, links). In Vaginalabstrichen von Tieren in Proöstrus genommen, sind die Zellen fast ausschließlich oval kernhaltige Epithelzellen (1D, Bild 2, Proöstrus, rechts). Der Peak im Follikel-stimulierendes HORMein Ebenen-Signale Eisprung und Eintrag in die Brunst 10,11. Während Brunst, 17-β-Östradiol Niedergang und Prolaktinspiegel peak 6,7 (Abbildung 2, Estrus, links). Vaginalabstrichen werden von fast ausschließliche Detektion von unregelmäßig geformten verhornten Plattenepithel Zellen oft in Klumpen (1E, Bild 2, Estrus, rechts) gekennzeichnet. Einstieg in Metöstrus fällt mit einem kontinuierlichen Anstieg der Progesteron Hormonspiegel 6 und entspricht dem Beginn der menschlichen Lutealphase 12 (Abbildung 2, Metöstrus, links). Da Progesteron beginnen zu steigen, und es gibt eine kleine Zunahme der 17-β-Estradiol in Reaktion auf Gelbkörper Aktivierung 6,13,14 (Abbildung 2, Metöstrus, links). Die Zelltypen in Vaginalabstrichen während dieser Phase sind fragmentiert, verhornten Epithelzellen und kleinere dunklere Flecken Leukozyten (Figure 1F, Bild 2, Metöstrus, rechts). Schließlich tritt Eintritt in Diöstrus in Mäusen und Zirkulieren Progesteronspiegel Peak 6, entsprechend dem menschlichen späten Lutealphase 12. Regression des Corpus luteum führt zu einer weiteren starken Rückgang der Progesteron-Spiegel 15,16 (Abbildung 2, Diöstrus, links). Leukozyten überwiegen in Abstrichen beim Diöstrus. Die Häufigkeit von verhornten Epithelzellen verringert und kernhaltige Epithelzellen beginnen, unmittelbar vor dem Übergang zu Proöstrus (Figur 1G, Bild 2, Diöstrus, rechtes Feld) detektiert werden. Zusammenfassend kann diese einfachen, routinemäßigen Protokoll zur täglichen hormonelle Schwankungen schätzen und zu etablieren Östrus Bühne in Versuchsmäusen ohne Änderung reproduktiven Status, wenn die folgenden Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden. Die Probenahme sollte nicht mehr als einmal täglich mit dem nicht-invasiven Protokoll desc durchgeführt werdenhier wiederholt das Eindringen des Vaginalkanals, Aspiration, und Agitation gegenüber ribed. Dies kann dazu führen, vaginale Reizung was zu einer entzündlichen Reaktion resultierende 17 in Leukozyten und anderen Zelltypen vorhanden sein, die in Abstrichen zytologische Beurteilung verwirren kann. Außerdem, selbst in Kolonie untergebracht Weibchen, ist es normal, erweiterte Diöstrus und Östrus Stufen in verschiedenen Mäusen sowie Induktion von Anöstrus 18 und diese Identifikation ist nützlich bei der Interpretation der hormonelle Auswirkungen im Bereich der reproduktiven, Geschlecht und Krankheit Studien zu sehen. Variabilität in der Zykluslänge wird auch mit dem Alter und vom Gehäuse Unterschiede innerhalb Kolonien (Einzelperson oder Gruppe-Gehäuse) der Frauen 7,19-21 eingeführt. Frauen in nur weibliche Kolonien untergebracht aufhören kann Radfahren und in einen Zustand der längeren Diöstrus 18,22,23 obwohl Radfahren kann durch die Einwirkung von Käfigen vorbehandelt mit männlichen Urin zum Radfahren 24,25 entlocken wieder eingesetzt werden. Somit festzustellen individual Zykluslängen für eine bestimmte Maus, ist es empfehlenswert, dass die nicht-invasive Beurteilung hier beschriebenen täglich durchgeführt werden, mit Sorgfalt, bis zwei komplette Zyklen beobachtet werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td></tr><tr><td> Sterile 200 ul Pipettenspitzen </td><td> Diamed </td><td> E340901 </td></tr><tr><td> Latexball (1 ml) </td><td> Fischer </td><td> 03-488-21 </td></tr><tr><td> Glasobjektträger </td><td> Fischer </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Kristallviolett färben (25 g) </td><td> Fischer </td><td> C581-25 </td></tr><tr><td> Leichte Tissue Scheibenwischer </td><td> VWR </td><td> 82003-820 </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Fischer </td><td> BP229-1 </td></tr><tr><td> Mikroskop Deckglas (22x30) </td><td> Fischer </td><td> 12-544A </td></tr></tbody></table>

performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification

Ein schnelles Mittel zur Bewertung Reproduktionsstatus bei Nagern dient nicht nur bei der Untersuchung von reproduktiven Funktionsstörungen, sondern auch für die Herstellung von neuen Mausmodellen von Krankheiten und Untersuchungen über die hormonelle Regulation der Gewebedegeneration (oder Regeneration) nach pathologischen Herausforderung erforderlich. Proöstrus Brunst, Metöstrus und Diöstrus: Der murine reproduktiven (oder Östrus-Zyklus) ist in 4 Stufen aufgeteilt. Definierte Schwankungen der zirkulierenden Spiegel der ovariellen Steroide 17-β-Östradiol und Progesteron, luteinisierendes die Gonadotropine und Follikel-stimulierende Hormone, und die luteotropic Hormons Prolaktin Signalwechsel durch diese reproduktiven Stadien. Änderungen in der Zelle Typologie im murinen Vaginalkanals spiegeln diese zugrunde liegenden endokrinen Veranstaltungen. Täglich Beurteilung des relativen Verhältnisses der kernhaltige Epithelzellen, verhornten Plattenepithelzellen und Leukozyten in Vaginalabstrichen kann zum murinen Östrus identifizierenStufen. Der Grad der Invasivität jedoch beim Sammeln diese Proben können Reproduktionsstatus verändern und eine entzündliche Reaktion hervorzurufen, die zytologische Beurteilung der Abstriche verwirren können eingesetzt. Hier beschreiben wir eine einfache, nicht-invasive Protokoll, das verwendet, um die Phase des Östrus Zyklus von einer weiblichen Maus ohne Änderung ihrer reproduktiven Zyklus zu bestimmen. Wir beschreiben, wie zwischen den vier Stufen des Östrus Zyklus durch Sammlung und Analyse der vorherrschenden Zelle Typologie Vaginalabstrichen und wir zeigen, wie diese Änderungen gegenüber endokrinen Status interpretiert werden können differenzieren.

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Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

Hier beschreiben wir, wie auf der Bühne des murinen reproduktiven (Proöstrus Brunst, Metöstrus oder Diöstrus) durch einfache, nicht-invasive Erfassung und zytologische Beurteilung der vaginalen Abstrich Proben zu identifizieren. Wir beschreiben weiterhin, wie Vaginalzytologie zirkulierenden Hormonspiegel zugrunde liegenden Übergang durch die murine reproduktiven Zyklus widerspiegelt.

Durchführen Vaginal Lavage, Kristallviolettfärbung und Vaginal zytologische Beurteilung für Maus Zyklusstand Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

110.1K Aufrufe.  Neural Regeneration Laboratory and Ottawa Institute of Systems Biology. Hier beschreiben wir, wie auf der Bühne des murinen reproduktiven (Proöstrus Brunst, Metöstrus oder Diöstrus) durch einfache, nicht-invasive Erfassung und zytologische Beurteilung der vaginalen Abstrich Proben zu identifizieren. Wir beschreiben weiterhin, wie Vaginalzytologie zirkulierenden Hormonspiegel zugrunde liegenden Übergang durch die murine reproduktiven Zyklus widerspiegelt.

Serie: Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

Eine reversible, nicht-invasive Methode für Airway Resistance-Messungen und bronchoalveolären Lavage Sampling in Mäuse

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Forschung

Biologie

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Evaluation der Brustdrüse Entwicklung und Funktion in Mausmodellen

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

Live Cell Cycle Analysis von<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe mit dem Attune Acoustic Fokussierung Cytometer und Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. The advantages of pyrosequencing for microbiology applications include rapid and reliable high-throughput screening and accurate identification of microbes and microbial genome mutations. Pyrosequencing involves sequencing of DNA by synthesizing the complementary strand a single base at a time, while determining the specific nucleotide being incorporated during the synthesis reaction. The reaction occurs on immobilized single stranded template DNA where the four deoxyribonucleotides (dNTP) are added sequentially and the unincorporated dNTPs are enzymatically degraded before addition of the next dNTP to the synthesis reaction. Detection of the specific base incorporated into the template is monitored by generation of chemiluminescent signals. The order of dNTPs that produce the chemiluminescent signals determines the DNA sequence of the template. The real-time sequencing capability of pyrosequencing technology enables rapid microbial identification in a single assay. In addition, the pyrosequencing instrument, can analyze the full genetic diversity of anti-microbial drug resistance, including typing of SNPs, point mutations, insertions, and deletions, as well as quantification of multiple gene copies that may occur in some anti-microbial resistance patterns.

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains, and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. In this video, the procedure for microbial amplicon generation, amplicon pyrosequencing, and DNA sequence analysis will be demonstrated.

Pyrosequencing für Mikrobielle Identifizierung und Charakterisierung

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary changes. In particular, the adult stage is a rich source of morphological traits for interspecific comparison, including wing pigmentation comparison. To study developmental differences among species, detailed observation and appropriate staging are required for precise comparison. Here we describe protocols for staging of pupal periods and quantification of wing pigmentation in a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera. First, we describe the method for detailed morphological observation and definition of pupal stages based on morphologies. This method includes a technique for removing the puparium, which is the outer chitinous case of the pupa, to enable detailed observation of pupal morphologies. Second, we describe the method for measuring the duration of defined pupal stages. Finally, we describe the method for quantification of wing pigmentation based on image analysis using digital images and ImageJ software. With these methods, we can establish a solid basis for comparing developmental processes of adult traits during pupal stages.

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Protocols for staging pupal periods and measurement of wing pigmentation of Drosophila guttifera are described. Staging and quantification of pigmentation provide a solid basis for studying developmental mechanisms of adult traits and enable interspecific comparison of trait development.

Methoden zur Inszenierung Pupal Perioden und Messung der Flügel Pigmentierung der Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-innere Zelle Masse Injektion von embryonalen Stammzellen führt zu höheren Chimerism Raten

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

Quantifizierung der Lipid-Fülle und Bewertung von Lipid Verteilung in Caenorhabditis Elegans von Nil-rot und Öl rot O Färbung

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, uncoupling of metabolism to generate heat, and secretion of adipokines to regulate whole-body homeostasis and immune responses. Emerging research is identifying important regional differences in the developmental, molecular, and functional profiles of adipocytes located in discrete depots throughout the body. Different properties of the depots are medically relevant since metabolic diseases often demonstrate depot-specific effects. This protocol will provide investigators with a detailed anatomic atlas and dissection guide for the reproducible and accurate identification and excision of diverse mouse adipose tissues. Standardized dissection of discrete adipose depots will allow detailed comparisons of their molecular and metabolic characteristics and contributions to local and systemic pathologic states under various nutritional and environmental conditions.

Adipocytes exist in discrete depots and have diverse roles within their unique microenvironments. As regional differences in adipocyte character and function are uncovered, standardized identification and isolation of depots is crucial for advancement of the field. Herein, we present a detailed protocol for the excision of various mouse adipose depots.

Identifizierung und Zerlegung von diversen Maus-Adipose-Depots

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...