Diese Arbeit wurde von R01 AI32556 (NIAID, National Institute of Health) unterstützt. Diese Arbeit wurde zum Teil auch von Louisiana Vaccine Center und South Louisiana Institute for Infectious Disease Research von der Louisiana Board of Regents gesponsert unterstützt.

1. Vaginal Inokulation mit Candida albicans <ol><li> Drei Tage vor der Inokulation, während einstweilige das Tier auf den Bauch setzen, injizieren 100 ul Sesamöl mit 0,1-0,5 mg des β-Estradiol subkutan in den Unterleib. Schieben Sie die Nadel über 5 bis 10 mm seitlich an der Haut, um das Auslaufen aus der Injektionsstelle zu minimieren. Die subkutane Verabreichung von Östrogen in den Unterleib ist in diesem Modell aufgrund der Nähe zu den Genitaltrakt optimal. Effektive Dosen kann durch Mausstämme, Alters-oder Östrogen-Derivate variieren. In früheren Studien mit CBA-J (H-2 κ), C3H/HeN (H-2 κ), C57BL / 6 (H-2 b), Balb / c (H-2 d), DBA / 2 (H- 2 d), SJL (H-2 s) Mäuse bei 6-8 Wochen alt, 0,1 mg/100 ul gefunden wurde wirksam belegt durch Verdickung der Scheidenwand, reduziert Vaginalschleim underhöhte Epithelzelle Häutung. Mäuse oben mit Östrogen bei dieser Konzentration behandelt weisen konsistente vaginale Besiedlung mit Candida. Zur Inokulation in Mäusen anderer Stämme und Alter, ist ein Pilot-Studie wurde empfohlen, um die Wirksamkeit von Östrogen unter den veränderten Bedingungen zu gewährleisten und steigern die Östrogen-Dosis, falls erforderlich. Die Östrogen-Lösung sollte frisch jedes Mal am Tag der Injektion vorbereitet werden. Um eine vollständige Löslichkeit von Östrogen in Sesamöl, gründlich mischen die Lösung mit dem Vortex-Mixer und Wärme zeitweise bei 37 ° C. Wiederholen Sie die Injektion pro Woche während der gesamten Studiendauer. </li><li> Zur Vorbereitung des Inokulums, fügen Sie eine Öse C. albicans Blastokonidien aus einer aktuellen Subkultur Vorbereitung auf Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA) in 10 ml Phyton-Pepton-Bouillon mit 0,1% Glucose. Inkubieren Sie die Bouillonkultur bis zur stationären Phase für 18 h bei 25 ° C in einem Schüttel-Wasserbad. </li><li> Nach der Inkubation, sammeln the Bouillonkultur in einem 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren bei 800 xg für 5 min. Waschen des Pellets zweimal mit sterilem PBS. </li><li> Enumerate lebensfähig Blastokonidien auf einer Zählkammer nach Trypanblau Ausgrenzung. Passen Sie die Zellkonzentration auf 2,5 x 10 6 / ml (oder zu einem gewünschten Inokulumkonzentration) in sterile PBS. </li><li> Zur Stabilisierung der Maus, halten Sie die Basis des Schwanzes mit zwei Fingern und heben Sie die Hüfte nach oben, so dass die vaginale Öffnung zu Ihnen (Abbildung 1A) Gesichter. Es ist ideal, wenn die Maus auf einer ebenen Oberfläche gerieben (zB Käfig oben) platziert, so dass die Maus kann der Widerstand gegen das Heck Zurückhaltung geben. </li><li> Je 20 ul (oder eine gewünschte Lautstärke nicht bis 20 ul überschreiten) der Inokulumsuspension, indem Sie die Pipettenspitze ca. 5 mm tief in die Scheide Lumen (Abbildung 1B). Führen Sie diesen Schritt so schnell und schonend wie möglich, dass Ängste in der Maus zu minimieren. </li></ol> 2. Vaginal Spülflüssigkeiten <ol><li> Nach Euthanasie (oder Anästhesie), halt die Maus nach unten durch die Basis des Schwanzes mit zwei Fingern, so dass die vaginale Öffnung freigelegt wird. </li><li> Lavage die vaginale Lumen, indem 100 ul sterilem PBS mit wiederholter Aspiration und Rühren mit einer Pipettenspitze. Die Pipettenspitze kann verstopft werden mit Zellen. Wenn dies geschieht, verzichten die Behinderung Zellen und weiterhin lavaging mit den verbleibenden PBS in der Vagina. Sammeln Sie die Spülflüssigkeit in ein Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Alternativ können vaginal Spülungen an narkotisierten Mäusen, die mit Isofluran inhalant Betäubung durchgeführt werden. Dafür setzen die Mäuse zu verdampfende Isofluran, bis sie vollständig sind sediert (~ 30 sek.). Halten Sie die Maus nach unten durch die Basis des Schwanzes und sanft Spülung der Vaginallumen mit 50 ul sterilem PBS. Achten Sie darauf, harte Rühren mit einer Pipettenspitze zu vermeiden Verletzungen der Vagina zu minimieren während dieses Vorgangs. Sedated Mäuse sollten aus der Narkose innerhalb von 30 Sekunden der Exposition gegenüber Umgebungsluft erholen. Isoflurankann verdampft mit einem Isofluran Verdampfer und O 2 (bevorzugt) oder eine Standard-Drop-System geschlossen Betäubung Kammer ohne Verdampfer-System (erfordert eine enge Überwachung des Tieres während sediert, um Atemnot zu vermeiden). Vaginal Spülungen an narkotisierten Mäusen sollte die Methode der Wahl für Längs-Lavage-Proben auf dem gleichen Mäusen werden. Fortlaufende lavaging hat keinen Einfluss auf Einschätzung von Pilz-Belastung im Laufe der Zeit 41. </li><li> Für Nass-Mount-Präparaten, Transfer 10 ul der Spülflüssigkeit auf einen Objektträger und beobachten bei 400-1000facher Vergrößerung unter dem Lichtmikroskop. Darüber hinaus können Zellfraktionen der Spülflüssigkeit gefärbt, um Zell-und Kern-Morphologie zu untersuchen. Für Abstrichpräparaten, Transfer 10 ul der Spülflüssigkeit auf einen Objektträger und sanft verteilt über die Außenwand einer Pipettenspitze. Erhalten Sie den Abstrich-Proben mit CytoPrep Fixiermittel und Flecken von der Norm Papanicolaou-Technik (Pap-Abstrich). Beachten Sie bei 400-facher Vergrößerung unter dem Lichtmikroskop. </li></ol> 3. Die Quantifizierung von vaginalen Pilzinfektionen Belastung <ol><li> In einer 96-Well Rundboden-Platte, übertragen Sie die Spülflüssigkeit in einen Brunnen in der obersten Zeile und 180 ul sterilem PBS in den folgenden 5 Brunnen dieser Spalte (auf der Platte). </li><li> Machen 1.10 serielle Verdünnungen der vaginalen Lavage durch die Übertragung der 20 ul der Flüssigkeit zum nächsten Brunnen in der Spalte. Nach gründlichem Mischen durch wiederholte Aspiration vor jeder Übertragung. Serielle Verdünnungen von bis zu 12 Lavage-Proben (eine volle horizontale Reihe) können gleichzeitig durchgeführt werden mit einem 12-Kanal-Pipette. </li><li> Beginnend mit der niedrigsten Verdünnung, Transfer 10 ul der Probe auf Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA). Plating von bis zu 36 Proben können auf 1 Platte mit SDA in eckigen Petrischalen mit Gitter und einen einstellbaren Abstand Mehrkanalpipette vorbereitet durchgeführt werden. </li><li> Enumerate Kolonie bildenden Einheiten (KBE) nach Inkubation bei 34 ° C foder 48 h. </li></ol> 4. Vaginal Gewebeentnahme <ol><li> Nach der vaginalen Lavage Verfahren, lag die eingeschläfert Maus auf den Rücken und sättigen die Leistengegend mit 70% Ethanol. Mit einer Pinzette, heben Sie den Urin Öffnung nach oben, so dass die vaginale Öffnung freigelegt wird. </li><li> Legen Sie ein Paar gebogenen Pinzette in die Vaginallumen und suchen Sie den Gebärmutterhals. Unter Beibehaltung fest im Griff mit der Zange, extrahieren Sie die Zervix durch die Vagina (Abbildung 2a-c). </li><li> Excise der Scheide an der Basis der vaginalen Öffnung und entfernen Sie dann den Muttermund aus der Scheide mit chirurgischer Schere. Denken Sie daran, dass der vaginalen Gewebe zurückgebildet wird (innere Epithel-Seite der Vagina nach außen ausgesetzt ist). Das Gewebe kann entweder seitlich umgedreht werden, um die ursprüngliche Ausrichtung der Vagina zu erhalten oder geöffnet in eine Folie, indem Sie einen seitlichen Schnitt. Abgeschnittene vaginalen Gewebe kann für 1 verwendet werden) Lymphozyten Extraktion folgende Collagenase Verdauung (~ 1 × 10 4 / Maus) 40, 2) epithelialen Zell-Isolierung nach Dispase Verdauung (~ 5 × 10 4 / Maus) 28, 3) eingefroren oder in Paraffin eingebetteten Präparate für die histologische Analyse 25. </li></ol> 5. Lumbar Lymphknoten Exzision <ol><li> Nach der vaginalen Lavage Verfahren, lag die eingeschläfert Maus auf den Rücken und sättigen den Bauch mit 70% Ethanol. Machen Sie einen seitlichen Einschnitt ausgehend von der unteren Bauch, die Brust und setzen die inneren Organe. Mit einer Pinzette in beide Hände, bewegen Sie den Darm nach oben, so dass die zentrale Blutgefäße sichtbar werden. </li><li> Suchen Sie die untere Hohlvene und Bauchaorta. Normalerweise kann ein Paar von lumbalen Lymphknoten identifiziert benachbart zu der abdominalen Aorta, liegt etwa auf halbem Weg zwischen der Herkunft der Nieren-und iliacae communes 39. Diese Lymphknoten können optisch von Fettgewebe werden durch die elastische Textur unterscheidenund sind leichter und undurchsichtig in der Farbe im Vergleich zum Fettgewebe (Abbildung 3). Diese Lymphknoten sind deutlich größer in infizierten Tieren im Vergleich zu ungeimpften Tieren. </li><li> Excise den Lymphknoten, indem microforceps unter dem Knoten und ziehen Sie dann sanft vom umgebenden Gewebe zu trennen. </li></ol> 6. Isolierung von lymphoiden Zellen in Einzel-Zellsuspensionen <ol><li> Transfer-Lymphknoten auf eine sterile Drahtgitter (ca. 3 x 3 cm 2 in der Größe) in einem sterilen Glas-Petrischale mit ~ 10 ml balanced salt Hanks &#39;Lösung (HBSS) (Abbildung 4) platziert. </li><li> Mit der Petrischale leicht nach, drücken Sie die Lymphknoten vor dem Bildschirm mit einem Spritzenkolben Kopf. Achten Sie darauf, alle Lymphknoten zu brechen, so dass die zellulären Inhalt der Knoten durch das Sieb passieren, während die nicht-zellulären Komponenten der Knoten (dh Membranen, Stroma-, Fett) auf dem Bildschirm bleiben. </li><li> Mit dem gleichen Kolben und Spritze absaugen ter HBSS enthaltenden Zellen. Waschen Sie den Bildschirm mit ~ 5 ml HBSS und sammeln Sie die restliche Flüssigkeit in einen 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifugation bei 800 xg für 10 min. Saugen Sie keine Fettablagerungen an der Spitze der Flüssigkeit mit einer Pipette vor Verwerfen der Flüssigkeit. Waschen Sie die Zellpellet dreimal mit HBSS. Das Pellet in 1 ml HBSS und aufzählen lebensfähigen Zellen durch Trypanblau Ausgrenzung. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Die Zellfraktionen der vaginalen Lavage von&gt; 4-Tages-inokulierten Mäusen bestehen typischerweise aus Candida-, Epithel-Zellen und zelluläre Infiltrate (Abb. 5). Durch nasse-mount-Mikroskopie kann Candida visuell durch das Vorhandensein von Hyphen sowie Hefe (5A) identifiziert werden. Smear Vorbereitungen der vaginalen Lavage kann durch Papanicolaou-Technik angefärbt werden, um Epithelzellen und Leukozyten infiltriert, von denen die wichtigsten Zellen sind Neutrophile durch die tri-Keimbildung identifiziert untersuchenar Lappen (Abbildung 5B). Sehr wenige Neutrophile, wenn überhaupt, in ungeimpften Mäusen (Abbildung 5C) 41 ​​erkannt. Ein Beispiel für vaginale Pilzinfektionen Belastung ist in Abbildung 6 dargestellt. Vaginal Spülflüssigkeit zu bestimmten Zeitpunkten erhoben werden für die CFU-Enumeration (Abbildung 6A) kultiviert. Vaginal Kolonisierung / Infektion mit Candida weiterhin für Wochen in Östrogen-behandelten Mäuse geimpft (6B), während Candida nicht vaginal Besiedlung in nicht-Östrogen-behandelten Mäuse geimpft (Abbildung 6C) zu etablieren. Östrogen-behandelten Mäusen unbeimpfte bleiben Candida negativ im Laufe der Zeit (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus können vaginal Spülungen entweder durchgeführt werden einmal auf separaten Mäusen zu jedem Zeitpunkt oder in Längsrichtung in den gleichen Mäusen unter Narkose. Die lumbale Lymphknoten sind die primären Lymphknoten im Genitalbereich und die wichtigsten Standort für systemische Immunantwort auf eine vaginale Herausforderung zu bewerten. Note, dass diese Lymphknoten können vergrößert werden, in geimpften Mäusen, während sie normalerweise erscheinen recht klein in ungeimpften Mäusen. Leukocyte zellulären Erholungen typischerweise im Bereich von 8 x 10 5 / unbeimpfte Maus bis 5 × 10 6 / geimpft Maus. Neben lumbalen Lymphknoten können Leisten-, Kniekehlen-und mesenterialen Lymphknoten ebenfalls verwendet werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig1.jpg" /> Abbildung 1. Vaginal Inokulation mit Candida. A) Eine Maus für die Impfung zurückhaltend. Die Maus befindet sich auf einem Drahtkäfig einfügen gelegt und durch die Basis des Schwanzes, leicht nach oben, um die Beine heben und setzen die vaginale Öffnung. Die Hüfte der Maus kann mit der gleichen Hand stabilisiert werden, wie es um den Schwanz Zurückhaltung zu widerstehen versucht. B) Die Einführung des Inokulums in die vaginale Lumen. Eine Pipettenspitze vorsichtig ca. 5 mm tief in die Scheide Lumen eingesetzt. Die Suspension Inokulum wird dann abgeschieden. Abbildung 2. Vaginal Gewebeentnahme. AB) Extraktion des Gebärmutterhalses. Der Gebärmutterhals ist mit einer gebogenen Pinzette entfernt und nach außen durch die Vagina ausgesetzt. Einmal aus der Vagina, ist der Muttermund weiter nach außen gezogen, um vollständig freizulegen der Vagina. C) Extraktion der Vagina. Die Vagina ist aus der Vulva mit der Schere ausgeschnitten. Einmal abgetrennt, entfernen Sie die Zervix von der Vagina. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig3.jpg" /> Abbildung 3. Identification der Lenden-Lymphknoten. Die Lage der Lenden-Lymphknoten unter den umliegenden Organe / Blutgefäße in der Nähe des Beckens wird angezeigt. A, Bauchaorta. B, Harnblase. C, A. iliaca communis. I, Darm. L-, Leber. R, Rektum. S, Milz. U, Uteri. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig4.jpg" /> Abbildung 4. Die lumbale Lymphknoten auf einem Drahtgitter angebracht. Die Lymphknoten sind auf den Bildschirm in eine Petrischale mit HBSS gelegt gebündelt. Die Lymphknoten sind gegen den Bildschirm mit einem Spritzenkolben an lymphoiden Zellen in Einzel-Zell-Suspensionen zu erhalten gedrückt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig5.jpg" /> Abbildung 5. Zellfraktionen der vaginalen Lavage von geimpften Mäusen. A) Wet-mount und B) Pap-Abstrich Vorbereitungen der vaginalen Lavage-Proben gesammelt 4 Tage nach der Inokulation und C) von ungeimpften Mäusen. Die Bilder werden bei 1000 × (A) oder 400 gezeigt × (B, C) Vergrößerung. Der Einsatz in B zeigt die nukleare Morphologie der vaginalen Neutrophilen bei 1000 ×. Candida Hefe (Y) und Hyphen (H), Epithelzellen (EC) und neutrohils (N) angegeben sind. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig6.jpg" /> Abbildung 6. Detection von vaginalen Pilzinfektionen Belastung. A) Repräsentative C. albicans Kolonien auf einem SDA Platte gewachsen. Neat (N) Lavage-Proben aus sechs verschiedenen geimpft Mäusen (obere Reihe) wurden seriell verdünnt und für CFU-Enumeration. B) Quantifizierung der vaginalen Pilzinfektionen Belastung in Östrogen-behandelten und C) nicht-Östrogen-behandelten Mäusen. CFU/100 ul der Spülflüssigkeit aus geimpften Mäusen wurde am angegebenen Zeitpunkten bewertet.

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Immun. 70, 7081-7081 (2002).</li><li>Pietrella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beta-glucan-conjugate+vaccine+and+anti-beta-glucan+antibodies+are+effective+against+murine+vaginal+candidiasis+as+assessed+by+a+novel+in+vivo+imaging+technique.">A beta-glucan-conjugate vaccine and anti-beta-glucan antibodies are effective against murine vaginal candidiasis as assessed by a novel in vivo imaging technique.</a> Vaccine. 28 (7), 1717-1717 (2010).</li><li>Redondo-Lopez, V., Cook, R. N., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+Lactobacilli+in+the+control+and+maintenance+of+the+vaginal+bacterial+microflora.">Emerging role of Lactobacilli in the control and maintenance of the vaginal bacterial microflora.</a> Rev Infect Dis. 12 (5), 856-856 (1990).</li><li>Saavedra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+production+of+chemokines+during+experimental+vaginal+candidiasis.">Local production of chemokines during experimental vaginal candidiasis.</a> Inf. Immun. 67, 5820-5820 (1999).</li><li>Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+epidemiology+of+vulvovaginal+candidiasis.">Pathogenesis and epidemiology of vulvovaginal candidiasis.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 544, 547-547 (1988).</li><li>Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+treatment+of+recurrent+vulvovaginal+candidiasis.">Pathogenesis and treatment of recurrent vulvovaginal candidiasis.</a> Clin. Infect. Dis. 14, S148-S153 (1992).</li><li>Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vulvovaginal+candidiasis:+Epidemiologic,+diagnostic,+and+therapeutic+considerations.">Vulvovaginal candidiasis: Epidemiologic, diagnostic, and therapeutic considerations.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 178 (2), 203-203 (1998).</li><li>Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+humoral+immune+responses+against+primary+and+repeat+Neisseria+gonorrhoeae+genital+tract+infections+of+17&#946;-estradiol-treated+mice.">Local and humoral immune responses against primary and repeat Neisseria gonorrhoeae genital tract infections of 17&#946;-estradiol-treated mice.</a> Vaccine. 26, 5741-5741 (2008).</li><li>Taylor, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+virulence+of+Candida+albicans+isolates+causing+mucosal+infections+in+people+infected+with+the+human+immunodeficiency+virus.">In vivo virulence of Candida albicans isolates causing mucosal infections in people infected with the human immunodeficiency virus.</a> J. Infect. Dis. 182, 955-955 (2000).</li><li>Taylor, B. N., Saavedra, M., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Th1/Th2+cytokine+production+during+experimental+vaginal+candidiasis.">Local Th1/Th2 cytokine production during experimental vaginal candidiasis.</a> Med. Mycol. 38, 419-419 (2000).</li><li>Tirabassi, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mucosal+vaccination+approach+for+herpes+simplex+virus+type+2.">A mucosal vaccination approach for herpes simplex virus type 2.</a> Vaccine. 29 (5), 1090-1090 (2011).</li><li>Broeck, W. V. a. n. d. e. n., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+descriptive+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: descriptive and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J. Immunol. Methods. 312 (1-2), 12-12 (2006).</li><li>Wormley, F. L., Chaiban, J., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+and+lymphocyte+activation+marker+expression+during+experimental+vaginal+candidiasis.">Cell adhesion molecule and lymphocyte activation marker expression during experimental vaginal candidiasis.</a> J. Immunol. Methods. 69, 5072-5072 (2001).</li><li>Yano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell-derived+S100+calcium-binding+proteins+as+key+mediators+in+the+hallmark+acute+neutrophil+response+during+Candida+vaginitis.">Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis.</a> Infect. Immun. 78 (12), 5126-5126 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Ein experimentelles Mausmodell für Candida Vaginitis wurde eingerichtet und historisch für den letzten Jahrzehnten zur Schleimhaut Host Reaktion auf Candida sowie Studien zur Prüfung von Antimykotika 3,4,11,13,16,17,19,21,24, 25,37. Die Protokolle hier vorgestellten integrieren effizienter und weniger arbeitsintensive Methoden und scheinen eine der optimierten Modell-Systeme von Candida Vaginitis bisher beschriebenen. Diese Techniken ermöglichen eine schnelle Quantifizierung von...

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Weibliche CBA / J-Mäusen </td><td> Charles River Laboratories </td><td> 01C38 </td><td> 5-6 Wochen alt </td></tr><tr><td> Candida albicans (3153A) </td><td> National Collection von pathogenen Pilzen, UK </td><td> NCPF3153 </td><td></td></tr><tr><td> Sesamöl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3547 </td><td> Braucht nicht vor dem Einsatz vor sterilisiert werden </td></tr><tr><td> Β-Estradiol 17-valerat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E1631 </td><td> 0,1-0.5mg in Sesamöl </td></tr><tr><td> Phyton Pepton </td><td> Becton Dickinson </td><td> 211906 </td><td> Supplement mit 0,1% Glucose </td></tr><tr><td> Trypanblau-Lösung </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td></td></tr><tr><td> Sabouraud-Dextrose-Agar </td><td> Becton Dickinson </td><td> 211584 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase Typ IV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5138 </td><td> 0,25% </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Invitrogen </td><td> 17105-041 </td><td> 1,7 U / ml </td></tr><tr><td> Maschendraht-Bildschirme </td><td> TWP </td><td> 060X060S0065W36T </td><td> Nr. 60 mesh, Edelstahl </td></tr><tr><td> Hanks &#39;balanced salt solution </td><td> Invitrogen </td><td> 24020-117 </td><td></td></tr><tr><td> CytoPrep Fixativ </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-570-10 </td><td> Behält Abstrich Dias </td></tr><tr><td> Papanicolaou-Färbung EA-65 </td><td> EMD Chemicals </td><td> 7054X-85 </td><td></td></tr><tr><td> Papanicolaou-Färbung OG-6 </td><td> EMD Chemicals </td><td> 7052X-85 </td><td></td></tr><tr><td> Harris &#39;Hämatoxylin Alum </td><td> EMD Chemicals </td><td> 638A-85 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Baxter Healthcare </td><td> NDC 10019-773-60 </td><td> Gebrauchte mit Isofluran Verdampfer oder in einem Drop-System geschlossen Betäubung Kammer </td></tr></table>

protocols for vaginal inoculation and sample collection in the experimental mouse model of candida vaginitis

Vulvovaginalkandidose (VVC), durch Candida-Arten verursacht werden, ist eine Pilzinfektion der unteren weiblichen Genitaltrakt, dass ca. 75% der ansonsten gesunden Frauen betrifft während ihrer reproduktiven Jahre 18,32-34. Prädisponierende Faktoren sind der Gebrauch von Antibiotika, unkontrollierte Diabetes und Störungen im Bereich der reproduktiven Hormone wegen Schwangerschaft, orale Kontrazeptiva oder Hormonersatztherapien 33,34. Wiederkehrende VVC (RVVC), als drei oder mehr Episoden pro Jahr festgelegt, wirkt sich eine separate 5 bis 8% der Frauen ohne prädisponierende Faktoren 33. Ein experimentelles Mausmodell der VVC wurde eingerichtet und verwendet werden, um die Pathogenese und Schleimhaut-Host-Reaktion auf Candida 3,4,11,16,17,19,21,25,37 studieren. Dieses Modell wurde auch eingesetzt, um potentielle Antimykotika in vivo 13,24 zu testen. Das Modell setzt voraus, dass die Tiere in einen Zustand der pseudoestrus für opt beibehalten werdenimal Candida-Besiedlung / Infektion 6,14,23. Unter solchen Bedingungen wird geimpften Tieren nachweisbare vaginale Pilzinfektionen Belastung für Wochen bis Monate. Frühere Studien zeigen eine extrem hohe Parallelität zwischen dem Tiermodell und menschliche Infektion in Bezug auf immunologische und physiologische Eigenschaften 3,16,21. Unterschiede, aber auch ein Mangel an Candida als normale Vaginalflora und eine neutrale vaginalen pH-Wert in den Mäusen. Hier zeigen wir eine Reihe von wichtigen Methoden in der Maus Vaginitis Modell, das vaginale Impfung schnelle Sammlung von vaginalen Präparate, die Beurteilung der vaginalen Pilzinfektionen zu reduzieren und das Gewebe Vorbereitungen für zelluläre Extraktion / Trennung beinhalten. Dies wird durch repräsentative Ergebnisse für Bestandteile der vaginalen Lavage-, Pilz-Belastung und Lymphknoten Leukozyten Erträge gefolgt. Mit dem Einsatz von Anästhetika kann Lavage-Proben zu mehreren Zeitpunkten auf dem gleichen Mäuse für Längs-Auswertung gesammelt werdenInfektion / Kolonisation. Darüber hinaus erfordert dieses Modell keine Immunsuppressiva auf eine Infektion zu initiieren, so dass immunologische Untersuchungen unter definierten Bedingungen Host. Schließlich stellte das Modell und jede Technik könnte hier möglicherweise zu der Methoden verwenden, um andere Infektionskrankheiten der unteren weiblichen Genitaltrakt (bakterielle, parasitäre, virale) und den jeweiligen lokalen oder systemischen Immunabwehr zu untersuchen.

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Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Key-Techniken, um bei der Auswertung der verwendet werden<em&gt; Candida</em&gt; Vaginitis in einem experimentellen Tiermodell beschrieben sind. Die Methoden werden schnelle Sammlung von vaginalen Proben und Lymphozyten aus Trockenlegung lumbalen Lymphknoten zu ermöglichen. Diese Techniken könnten zu Mausmodellen von anderen Krankheiten in der weiblichen unteren Genitaltraktes geben.

Protokolle für Vaginal Inokulation und Probenahme in der Experimental-Maus-Modell der Candida Vaginitis

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

protocols-for-vaginal-inoculation-sample-collection-experimental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

32.8K Aufrufe.  Louisiana State University Health Sciences Center. Key-Techniken, um bei der Auswertung der verwendet werden Candida Vaginitis in einem experimentellen Tiermodell beschrieben sind. Die Methoden werden schnelle Sammlung von vaginalen Proben und Lymphozyten aus Trockenlegung lumbalen Lymphknoten zu ermöglichen. Diese Techniken könnten zu Mausmodellen von anderen Krankheiten in der weiblichen unteren Genitaltraktes geben.

Serie: Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Experimentelle Metastasierung und CTL adoptiven Transfer Immuntherapie Maus-Modell

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

Vorbereitung der Maus Pituitary Immunogen für die Induktion der experimentellen autoimmunen Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Ein Mausmodell der Gruppe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf Biofilm-Entwicklung eines Modells mit Kammerdeckgläser

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of their morbidity. The liver immunopathology caused by HIV-1 remains elusive. Small xenograft animal models with human hepatocytes and human immune system can recapitulate the human biology of the disease&#39;s pathogenesis. Herein, a protocol is described to establish a dual humanized mouse model through human hepatocytes and CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) transplantation, to study liver immunopathology as observed in HIV-infected patients. To achieve dual reconstitution, male TK-NOG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) mice are intraperitoneally injected with ganciclovir (GCV) doses to eliminate mouse transgenic liver cells, and with treosulfan for nonmyeloablative conditioning, both of which facilitate human hepatocyte (HEP) engraftment and human immune system (HIS) development. Human albumin (ALB) levels are evaluated for liver engraftment, and the presence of human immune cells in blood detected by flow cytometry confirms the establishment of human immune system. The model developed using the protocol described here resembles multiple components of liver damage from HIV-1 infection. Its establishment could prove to be essential for studies of hepatitis virus co-infection and for the evaluation of antiviral and antiretroviral drugs.

This protocol provides a reliable method to establish humanized mice with both human immune system and liver cells. Dual reconstituted immunodeficient mice achieved via intrasplenic injection of human hepatocytes and CD34+ hematopoietic stem cells are susceptible to human immunodeficiency virus-1 infection and recapitulate liver damage as observed in HIV-infected patients.

Etablierung des dualen humanisierten TK-NOG-Mausmodells für HIV-assoziierte Leberpathogenese

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight loss, depreciation of the animals&#39; leather and also can act as a vector of several pathogens. Due to the exorbitant costs to control these parasites, damage to the environment caused by the inappropriate use of chemical acaricides, and the increased resistance against traditional parasiticides, alternative control of ticks, by the use of entomopathogenic fungi, for example, has been considered an interesting approach. Nevertheless, few studies have demonstrated how the tick&#39;s immune system acts to fight these entomopathogens. Therefore, this protocol demonstrates two methods used for entomopathogen inoculation into engorged females and two techniques used for hemolymph collection and hemocytes harvesting. Inoculation of pathogens at the leg insertion in the tick female&#39;s body allows evaluation of females biologic parameters unlike the inoculation between the scutum and capitulum, which frequently damages Gen&#233;&#39;s organ. Dorsal hemolymph collection yielded a higher volume recovery than collection through the legs. Some limitations of tick hemolymph collection and processing include i) high rates of hemocytes&#39; disruption, ii) hemolymph contamination with disrupted midgut, and iii) low hemolymph volume recovery. When hemolymph is collected through the leg cutting, the hemolymph takes time to accumulate at the leg opening, favoring the clotting process. In addition, fewer hemocytes are obtained in the collection through the leg compared to the dorsal collection, even though the first method is considered easier to be performed. Understanding the immune response in ticks mediated by entomopathogenic agents helps to unveil their pathogenesis and develop new targets for tick control. The inoculation processes described here require very low technological resources and can be used not only to expose ticks to pathogenic microorganisms. Similarly, the collection of tick hemolymph may represent the first step for many physiological studies.

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Analysis of tick hemolymph represents an important source of information on how some pathogens cause disease and how ticks immunologically respond to this infection. The present study demonstrates how to inoculate fungal propagules and collect hemolymph from Rhipicephalus microplus engorged females.

Die Sammlung der Häkolymphe und die Inokulation von Metarhizium-Blastospores in Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Pathology Studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses

This protocol describes a footpad inoculation model used to study the initiation and development of neuroinflammatory responses during alphaherpesvirus infection in mice. As alphaherpesviruses are main invaders of the peripheral nervous system (PNS), this model is suitable to characterize the kinetics of viral replication, its spread from the PNS to CNS, and associated neuroinflammatory responses. The footpad inoculation model allows virus particles to spread from a primary infection site in the footpad epidermis to sensory and sympathetic nerve fibers that innervate the epidermis, sweat glands, and dermis. The infection spreads via the sciatic nerve to the dorsal root ganglia (DRG) and ultimately through the spinal cord to the brain. Here, a mouse footpad is inoculated with pseudorabies virus (PRV), an alphaherpesvirus closely related to herpes simplex virus (HSV) and varicella-zoster virus (VZV). This model demonstrates that PRV infection induces severe inflammation, characterized by neutrophil infiltration in the footpad and DRG. High concentrations of inflammatory cytokines are subsequently detected in homogenized tissues by ELISA. In addition, a strong correlation is observed between PRV gene and protein expression (via qPCR and IF staining) in DRG and the production of pro-inflammatory cytokines. Therefore, the footpad inoculation model provides a better understanding of the processes underlying alphaherpesvirus-induced neuropathies and may lead to the development of innovative therapeutic strategies. In addition, the model can guide research on peripheral neuropathies, such as multiple sclerosis and associated viral-induced damage to the PNS. Ultimately, it can serve as a cost-effective in vivo tool for drug development.

The footpad inoculation model is a valuable tool for characterizing viral-induced neuroinflammatory responses in vivo. In particular, it provides a clear assessment of viral kinetics and associated immunopathological processes initiated in the peripheral nervous system.

Maus Footpad Inokulation Modell zur Untersuchung viral-induzierte neuroentzündliche Reaktionen

This protocol describes a footpad inoculation model used to study the initiation and development of neuroinflammatory responses during alphaherpesvirus ...

Experimental Autoimmune Uveitis: An Intraocular Inflammatory Mouse Model

Experimental Autoimmune Uveitis (EAU) is driven by immune cells responding to self-antigens. Many features of this non-infectious, intraocular inflammatory disease model recapitulate the clinical phenotype of posterior uveitis affecting humans. EAU has been used reliably to study the efficacy of novel inflammatory therapeutics, their mode of action and to further investigate the mechanisms that underpin disease progression of intraocular disorders. Here, we provide a detailed protocol on EAU induction in the C57BL/6J mouse - the most widely used model organism with susceptibility to this disease. Clinical assessment of disease severity and progression will be demonstrated using fundoscopy, histological examination and fluorescein angiography. The induction procedure involves subcutaneous&#160;injection of an emulsion containing a peptide (IRBP1-20) from the ocular protein interphotoreceptor retinoid binding protein (also known as retinol binding protein 3), Complete Freund&#39;s Adjuvant (CFA) and supplemented with killed Mycobacterium tuberculosis. Injection of this viscous emulsion on the back of the neck is followed by a single intraperitoneal injection of Bordetella pertussis toxin. At the onset of symptoms (day 12-14) and under general anesthesia, fundoscopic images are taken to assess disease progression through clinical examination. These data can be directly compared with those at later timepoints and peak disease (day 20-22) with differences analyzed. At the same time, this protocol allows the investigator to assess potential differences in vessel permeability and damage using fluorescein angiography. EAU can be induced in other mouse strains - both wildtype or genetically modified - and combined with novel therapies offering flexibility for studying drug efficacy and/or disease mechanisms.

In this report we present a protocol that allows the investigator to generate a mouse model of intraocular uveitis. More commonly referred to as experimental autoimmune uveitis (EAU), this established model captures many aspects of human disease. Herein, we will describe how to induce and monitor disease progression using several readouts.

Experimentelle autoimmune Uveitis: Ein intraokulares entzündliches Mausmodell

Experimental Autoimmune Uveitis (EAU) is driven by immune cells responding to self-antigens. Many features of this non-infectious, intraocular ...

A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to the complex etiology and unknown pathogenesis, there are still no effective drug treatments. At present, the classic BA mouse model induced by rhesus rotavirus (RRV) is the most commonly used model for studying the pathogenesis of BA. This model is characterized by growth retardation, jaundice of the skin and mucosa, clay stools, and dark yellow urine. The histopathology shows severe liver inflammation and obstruction of the intrahepatic and extrahepatic bile ducts, which are similar to the symptoms of human BA. However, the livers of end-stage mice in this model lack fibrosis and cannot fully simulate the characteristics of liver fibrosis in clinical BA. The presented study developed a novel BA mouse model of chronic liver fibrosis by injecting 5-10 &#181;g of anti-Ly6G antibody four times, with gaps of 2 days after each injection. The results showed that some of the mice successfully formed chronic BA with typical fibrosis after the time lapse, meaning these mice represent a suitable animal model for the virus-induced liver fibrosis mechanistic study of BA and a platform for developing future BA treatments.

We established a mouse model of chronic liver fibrosis, which provides a suitable animal model for the virus-induced liver fibrosis mechanistic study of biliary atresia (BA) and a platform for future BA treatments.

Ein Mausmodell der chronischen Leberfibrose zur Untersuchung der Gallengangsatresie

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to ...

Etablierung eines Mausmodells für Candida albicans-Biofilm-bezogene PJI

A Periprosthetic Joint Candida albicans Infection Model in Mouse

Periprosthetic joint infection (PJI) is one of the common infections caused by Candida albicans (C. albicans), which increasingly concerns surgeons and scientists. Generally, biofilms that can shield C. albicans from antibiotics and immune clearance are formed at the infection site. Surgery involving the removal of the infected implant, debridement, antimicrobial treatment, and reimplantation is the gold standard for the treatment of PJI. Thus, establishing animal PJI models is of great significance for the research and development of new drugs or therapeutics for PJI. In this study, a smooth nickel-titanium alloy wire, a widely used implant in orthopedic clinics, was inserted into the femoral joint of a C57BL/6 mouse before the C. albicans were inoculated into the articular cavity along the wire. After 14 days, mature and thick biofilms were observed on the surface of implants under a scanning electronic microscope (SEM). A significantly reduced bone trabecula was found in the H&amp;E staining of the infected joint specimens. To sum up, a mouse PJI model with the advantages of easy operation, high successful rate, high repeatability, and high clinical correlation was established. This is expected to be an important model for clinical studies of C. albicans biofilm-related PJI prevention.

Autor im Rampenlicht: Vorantreiben der Forschung zu Candida albicans-Biofilm-assoziierten Gelenkprotheseninfektionen 

Periprosthetic joint infection (PJI) caused by dangerous pathogens is common in clinical orthopedics. Existing animal models cannot accurately simulate the actual situation of PJI. Here, we established a Candida albicans biofilm-associated PJI mouse model to research and develop new therapeutics for PJI.

Ein periprothetisches Gelenk-Candida albicans-Infektionsmodell in der Maus

Periprosthetic joint infection (PJI) is one of the common infections caused by Candida albicans (C. albicans), which increasingly concerns surgeons and ...