Arbeiten durchgeführt im Lécuyer Labor wird durch Mittel aus dem Nationalen Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), dem kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) und dem Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) unterstützt. Fabio Alexis Lefebvre und Gaël Moquin-Beaudry von NSERC Undergraduate Research studentships unterstützt, während Carole Iampietro vom Angelo Pizzagalli Postdoc-Stipendium unterstützt wird.

Ein. RNA Probe Vorbereitung Übersicht: Der folgende Abschnitt beschreibt die erforderlichen Schritte zum Digoxigenin (DIG)-markierten RNA-Sonden für FISH machen. Der erste Schritt beinhaltet das Klonen oder PCR Amplifikation einer Sequenz entsprechend der transkribierten Region eines Gens von Interesse, die verwendet werden, um eine Sequenz-spezifische Sonde erzeugt wird. Dies kann durch Klonieren der erste Genabschnitt in ein Plasmid, in dem die multiple Klonierungsstelle von Bakteriophagen Promotorelemente (T7, T3 oder SP6), die dann als Matrize für eine PCR mit flankierenden Primer dienen, die die Promotor-Sequenzen flankiert wird integrieren können erreicht werden , wodurch eine lineare PCR-Produkt mit unterschiedlichen Promotorsequenzen an jedem Ende (1A). Alternativ, den Klonierungsschritt zu vermeiden, kann man auch eine PCR-Amplifikation von genomischer DNA oder cDNA unter Verwendung von Oligonukleotiden, die T7-, T3 oder SP6-Sequenzen an ihrem 5&#39;-Enden (zB T7 umfassen:5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 &#39;; T3: 5&#39;-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3&#39;; Sp6: 5&#39;-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 &#39;). Die lineare PCR-Produkte werden dann als Matrizen verwendet, um Dig-markierten Sense oder Antisense-RNA-Sonden durch Abfließen in vitro-Transkription mit der geeigneten Polymerase (1B) zu machen. Bei der Sonden für spezifische Gene, bereiten wir sowohl Sense-und Antisense-RNA-Sonden empfehlen verschiedene Polymerasen, die hilfreich sein für die Beurteilung der FISH-Signal Spezifität (dh, wenn das Gen von Interesse in Antisense-Orientierung transkribiert wird, wird die RNA-Sonde zeigen, die Pegel der Hintergrundgeräusche Signal). In all der folgenden Schritte aus, sollte man große Sorgfalt, um potenzielle Abbau durch Kontamination Ribonukleasen (RNasen) zu vermeiden, indem Sie zunächst die Reinigung aller Bank Flächen und Geräte mit 70% Ethanol oder kommerzielle RNAse Dekontaminationslösungen und durch die Verwendung RNAse-freie Versorgung (zB Wasser, Tipps, Mikrozentrifugenröhrchen). MaMaterialien <ul><li> 1,5 ml Reaktionsgefäße (Abgene, Rochester, NY, USA Cat. No 0900) </li><li> Gel-Extraktions-Kits (QIAGEN, Mississauga, ON, Canada;. Art.-Nr. 28706). </li><li> RNAse freiem Wasser (Wisent, Inc. Cat. Nr. 809-115-CL) </li><li> RNA-Polymerasen (T7, T3 oder SP6). (20 U / ul, Fermentas Biosciences. Cat. No EP0101, EP0111, EP0131). </li><li> RNAse-OUT Ribonuclease-Inhibitoren (40 U / ul) (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. Nr. 10777-019). </li><li> Digoxigenin (DIG) Nukleotid Mixe (DIG-11-UTP, Roche Applied Biosciences, Laval, QC, Kanada. Cat. No.11209256910). </li></ul> Ausrüstung <ul><li> Tischplatte Mikro-Zentrifuge </li><li> Gel-Elektrophoresegerät </li></ul><ol><li> PCR amplifizieren genspezifischen Sequenz aus genomischer DNA, cDNA, oder Plasmid-DNA, um eine lineare PCR-Produkts durch Bakteriophagen T7, T3 oder SP6-Promotor flankiert erzeugen. Folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers für die PCR-Bedingungen. </li><li> Überprüfen Sie die Qualität und size des PCR-Produkts durch Agarosegelelektrophorese. Verbrauchsteuern und reinigen PCR-Produkt mit einem Standard-Gel-Extraktions-Kit nach den Herstellern Empfehlungen und eluieren das Produkt in 50 ul Puffer. </li><li> Fällung des PCR-Produkt durch Zugabe von 5 ul 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 150 pl eiskaltem 100% Ethanol, und legen die Röhrchen bei -70 ° C über Nacht. Zentrifugenröhrchen bei 13.000 xg für 10 min bei 4 ° C waschen und das Pellet mit 70% Ethanol. Spin wieder zu entfernen alle Spuren von Ethanol und Luft trocknen das Pellet. Resuspendieren in 25-50 ul RNAse-freiem Wasser. </li><li> Transkribieren Dig-markierten Sonde mit 200-500 ng gereinigtes PCR-Produkt in einem 20 ul Reaktion wie folgt: 2 ul 10X T7 Transkription Puffer (Invitrogen), 1 ul (20 U / ul) RNAse-Inhibitor, 2 ul Dig-NTP-Mix und 2 ul T7-RNA-Polymerase (20 U / ul). Bringen Sie das Endvolumen 20 ul mit RNAse-freiem Wasser. Die Transkription bei 37 ° C für 3-4 Stunden. </li><li> Passen TRANSCription Mix zu 50 ul mit RNAse-freies Wasser und Ausfällen des Dig-markierten RNA-Sonde, wie in Schritt 4 beschrieben. Resuspendieren der gewaschenen RNA-Pellet in 100 ul RNAse-freiem Wasser. Bewahren Sie die resuspendierten Proben bei -70 ° C. </li><li> Quantifizierung der Sonde mit einem nanodrop Spektralphotometer. Um die Sonde Qualität zu überprüfen, führen Sie eine 1-2 ul Probe auf einem 1-2% igen Agarosegel mit Ethidiumbromid gefärbt. </li></ol> 2. Sammlung und Fixierung von Drosophila-Embryonen Übersicht: Dieser Abschnitt beschreibt die Schritte für die Ernte und Verarbeitung inszeniert Drosophila-Embryo. Abhängig von der Anzahl von Embryonen Bedarf können Fliegen in Käfigen Population verschiedener Größe aufrechterhalten werden. Die folgenden Schritte sind für Sammlungen durchgeführt mit 900 cm 3 zylindrischen Käfige mit 100mm Apfelsaft Sammlung Platten. Ordnungsgemäße Fixierung erfordert die Entfernung von zwei Schutzschichten umgibt den Embryo: die äußere und die innere Chorion Vitelline Membran 13. Nach der Ernte werden die Embryonen werden zunächst in einem 50% Bleichlösung auf das Chorion entfernen getaucht, dann werden sie in einer zweiphasigen Lösung mit Heptan (permeabilisiert die Vitellin-Membran) und PBS mit 3,7% Formaldehyd versetzt. Die Membran wird dann Vitellin rissig und entfernt durch Übertragen der Embryonen in einem zweiphasigen Gemisch aus Heptan und Methanol. Ordnungsgemäße Embryo Fixierung und Entfernen des Dotterhaut ist kritisch für den Erfolg des stromabwärtigen FISH-Verfahren. Materialien <ul><li> Apfelsaft Agarplatten (40% Apfelsaft, 4% Saccharose, 3,5% Agar, 0,3% Methylparaben) mit Dime-Größe Hefepaste (Bäckerhefe mit Wasser auf Butterkonsistenz gemischt) </li><li> Powdered Paraformaldehyd (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA;. Art.-Nr. 19208) </li><li> Heptan </li><li> Methanol </li><li> 3% Bleach-Lösung </li><li> 20 ml Glasszintillationsröhrchen (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada;. Best.-Nr. 03-337-15). </li></ul> Ausrüstung <ul><li> Bevölkerung Käfigen </li><li> Sammelkörbe (hergestellt unter Verwendung eines Nitex mesh und den oberen Teil des Schnittes 50 ml Polypropylen-Rohr, in dem ein Loch im Deckel geschnitten worden ist). </li><li> Kleinen Pinsel </li><li> Tischplatte Wirbel </li></ul><ol><li> Pre-Clear wohlgenährten Bevölkerung Käfige mit einem frischen Apfelsaft / Hefe Platte für 1 Stunde bei 25 ° C. </li><li> Fügen Sie einen neuen Apfelsaft / Hefe Platte an den Käfig, um Embryonen im Frühstadium zu ernten. Inkubieren den Käfig für 4 Stunden bei 25 ° C (beachten Sie, dass Abholzeiten eingestellt werden je nach den gewünschten Stufen werden). </li><li> Eine frische 37% Formaldehyd-Lösung durch Kombinieren 3,7 g Paraformaldehyd Pulver, 70 ul 2N KOH und 7,3 ml Milli-Q Wasser in einem Glasszintillationsröhrchen unter einer chemischen Haube. Kochen Sie die Lösung bis der Paraformaldehyd Pulver vollständig gelöst ist, dann auf Raumtemperatur abkühlen und filtriert in neue Szintillationsfläschchen. </li><li> Bereiten Sie eine biphasische Fixierung LösungKombinieren 2,25 ml 1X PBS mit 250 ml 37% Formaldehyd in einem Szintillationsfläschchen, dann Zugabe von 7,5 ml Heptan. </li><li> Ernten den Apfelsaft Platte aus dem Käfig und sammeln die Embryonen, die durch Zugabe von ein wenig Raumtemperatur Leitungswasser und zart Bürsten der Embryonen aus der Platte mit dem Pinsel. Übertragen Sie die resuspendierten Embryonen in einem Korb und mit lauwarmem Leitungswasser. </li><li> Dechorionate Embryonen für 90 sec durch Baden die Sammlung Körbe in Bleichlösung, dann gründlich mit lauwarmem Leitungswasser (bis Bleiche Geruch verschwunden ist). </li><li> Demontieren Sie den Auffangkorb, sammeln Embryonen vorsichtig mit einem Pinsel und übertragen sie in der zweiphasigen Fixierung Lösung. Die Embryonen werden an der Grenzfläche zwischen dem PBS und Heptan Schichten anreichern. </li><li> Seal Szintillationsgefäße und befestigen zu einem Vortex-Mischer. Schütteln für 20 min am niedrigsten Einstellung. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie die meisten der unteren PBS und oberen Heptan Phasen mit einer Pasteurpipette. Aspirierendie verbleibende PBS / Heptan / Embryonen Mischung in die Pipette. In tropfenweise, entsorgen Sie die unteren PBS-Phase aus der Pipette, kümmert sich nicht um die Embryonen zu beseitigen. Hinterlegen die Embryonen in ein 1,5 ml Röhrchen, das eine zweiphasige Lösung von 500 ul Heptan (obere Phase) und 500 ul Methanol (untere Phase). </li><li> Schütteln Rohre von Hand kräftig für 30-45 Sek. vitelline Membranen zu knacken. Einmal geknackt, werden die Embryonen in die Methanol sinken. </li><li> Entsorgen Sie die oberen Heptanphase und ungerissenen Embryonen im Heptan / Methanol Interphase, und 500 ul Methanol. Schütteln für 5 sek. </li><li> 3 x waschen mit Methanol und speichern die Embryonen bei -20 ° C (an dieser Stelle Embryonen können für Wochen / Monate gespeichert werden). </li></ol> 3. Postfixierung Processing, Hybridisierung und Post-Hybridisierung Washes Übersicht: In diesem Abschnitt werden die Bearbeitungsschritte für den Embryo Permeabilisierung vor FISH, pre-HybridisierungHybridisierung mit den Sonden und RNA Posthybridisierung Wäschen. Für die anfänglichen Schritte Permeabilisierung die Embryonen als Pool in einem einzigen Rohr (Schritte 1-9 unter dem Ziel für 10-15 ul ständiger Embryonen / Probe) gehandhabt, aber sie werden in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte PCR aliquotiert bevor mit der Vorhybridisierung Schritt (Schritt 10). Dies hilft, die gleichmäßige Bearbeitung aller Embryonen in den ersten Phasen des Experiments zu gewährleisten. Beim Einrichten einer FISH Experiments ist es wichtig, negative Kontrollen umfassen, um den Pegel des Hintergrundsignals in einzelnen Experimente bestimmen. Hierzu empfehlen wir auch ein &quot;no-Sonde&quot; Probe und, wie in Abschnitt 1, eine Probe mit dem &quot;Sinn&quot;-RNA-Sonde, die in der Regel geben ein Signal vergleichbar mit der &quot;no-Sonde&quot; Bedingung hybridisiert festgestellt. Materialien: <ul><li> Methanol </li><li> Phosphatgepufferte mit 0,1% Tween-20 (PBT) Kochsalzlösung </li><li> Proteinase-K 1 mg / ml Stammlösung (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Kanada. Katalog Nr. P2308) </li><li> Glycine (20 mg / ml Stammlösung) </li><li> Hybridisierungslösung: 50% Formamid, 5X SSC, 0,1% Tween-20, 100 g / ml gescherte Lachssperma-DNA, 100 ug / ml Heparin. </li><li> 0,2 ml halfskirted 96-well PCR-Platten, Abgene, Rochester, NY, USA Cat. Kein 0900) </li></ul> Ausrüstung <ul><li> Hybridisierungsofen, digitale Heizblock oder Wasserbad einstellbaren bis 56 ° C, 80 ° C oder 100 ° C, oder eine PCR-Maschine. </li><li> Mehrkanalpipetten (empfohlen Waschschritte vereinfacht) </li><li> Taumelmischer </li></ul><ol><li> Spülen der Embryos in Methanol, dann in einem 1:1-Gemisch von Methanol: PBT, und dann zweimal in PBT. </li><li> Fixierung der Embryonen für 20 min in 1 ml PBT mit 3,7% Formaldehyd (frisch zubereitet, wie in Schritt 11 beschrieben) mit konstanter Schaukeln auf einem Kolbenpendel. </li><li> Waschen Embryonen für 3 mal 2 min in PBT, während schaukeln. </li><li> Bereiten Sie eine Lösung von 3 g / ml Proteinase K (PK) in PBT verdünnt und fügen500 ul Lösung, um Proben. Inkubieren Proben für 10 min bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Mix Embryonen alle 2 min durch Strahlen mit einer Pipette oder durch vorsichtiges Umdrehen der Rohre. </li><li> Übertragen Embryonen Proben auf Eis für 1 Stunde. </li><li> Bewegen Proben auf Raumtemperatur und entfernen PK Lösung. Waschen 2 mal für 2 min mit 1 ml PBT + 2 mg / ml Glycin. </li><li> Fix Proben 20 min in 1 ml PBT + 3,7% Formaldehyd mit Schaukeln. Spülen Embryonen 5 mal in PBT. </li><li> Spülen Embryonen mit 1 ml einer 1:1-Mischung von PBT und Hyb Lösung. Ersetzen mit 0,5-1 ml 100% Hyb Lösung (bei diesem Schritt werden die Embryonen können für mehrere Tage / Wochen bei -20 ° C gelagert werden). </li><li> Aliquot Embryonen in einzelnen Wells einer 96-Well-Platte (Ziel für ~ 10-15 ul angesiedelt Embryonen / well, kümmern sich um große Blende Tipps verwenden, um eine Beschädigung der Embryonen). </li><li> Kochen Sie 100 ul / Stichprobe von Hyb-Lösung für 5 min und dann kühl auf Eis für 5 min. Diese Lösung wird für die Probe vor Hybridisierung verwendet (Pre-Hyb). </li><li> Fügen Sie 100 ul / Stichprobe von Pre-Hyb-Lösung und Inkubation für mindestens 2 Stunden bei 56 ° C. </li><li> Für jede Probe verdünnen ~ 100 ng Sonde in 100 ul Hyb Lösung. Wärme bei 80 ° C für 3 min, dann cool auf Eis für 5 min (beheizte Sonden können auf Eis für mehrere Stunden aufbewahrt werden). </li><li> Entfernen Sie die Pre-Hyb-Lösung aus den Embryonen und ersetzen mit dem RNA-Sonde Lösung. </li><li> Hybridisieren bei 56 ° C für 12-16 Stunden. </li><li> Pre-warm die folgenden Waschlösungen bei 56 ° C: (A) 200 ul / Stichprobe von Hyb Lösung; (B) 100 ul / Probe einer 3:1 Mischung aus Hyb: PBT; (C) 100 ul / Probe ein 1:1-Mischung aus Hyb: PBT, (D) 100 ul / Probe von einer 1:3 Mischung aus Hyb: PBT, (E) 400 ul / Probe von PBT. </li><li> Spülen Proben mit 100 ul Waschlösung A, dann die Waschschritt mit 100 ul / Probe von Lösungen AD bei 56 ° C für 15 min jeden. Dann waschen Proben 4 mal für 5 min mit 100 ul / Probe der Lösung E bei 56 ° C. </li><li> Proben kühle auf Raumtemperatur. </li></ol> Übersicht: In diesem Abschnitt werden die Antikörper und Nachweisreagenzien zum Nachweis und zur Visualisierung der Verteilung der RNA Sondensignal folgende Hybridisierung. Diese Schritte sind schematisch in Abbildung 2 dargestellt. Hier präsentieren wir nur die Standard Nachweisreagenzien, die wir verwenden zur robusten Signalverstärkung, sondern es existiert eine Vielzahl im Handel erhältlichen Reagenzien, die als Alternativen verwendet werden können, vor allem beim Durchführen Doppel-FISH-Experimente zur Zusammenarbeit erkennen verschiedene RNAs gleichzeitig für Protein-RNA Doppel Färbung. Beispiele von Ergebnissen mit diesem Protokoll sind in der mRNA-Expression / Lokalisierung Muster Mosaik in Abbildung 3 dargestellt. Materialien <ul><li> HRP-konjugierten monoklonalen anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Cat. Nr. 200-032-156) </li><li> Biotin-konjugierten Maus-monoklonalen anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Cat. Nr. 200-062-156) </li><li> Streptavidin-HRP-Konjugat (Molecular Probes, Eugene OR, USA, Cat. No.S991) </li><li> Cy3-Tyramid Konjugate (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA, Cat. No SAT704A) </li><li> DABCO Montage Lösung: In einem 50-ml-Tube, verdünnen 1,25 g DABCO (1,4-Diazabicyclo [2.2.2] octan; Sigma D-2522) in 15 ml 1X PBS, dann fügen Sie 35 ml Glycerin und Mischung bis zur vollständigen homogen. Durch Vormischung mit PBS wird das DABCO Pulver löste sich sehr schnell. Shop Montage Lösung bei -20 ° C. </li><li> Objektträger, Deckgläser </li></ul> Ausrüstung <ul><li> Taumelmischer </li><li> Mehrkanalpipette </li><li> Fluoreszenzmikroskop </li></ul><ol><li> Planen PBTB Lösung, enthaltend PBT + 1% fettfreie Trockenmilch (üblicherweise 50 bis 100 ml ausreichend für alle Nachweisreagenz Inkubations-und Waschschritte). </li><li> Blockieren Proben für 10 min bei Raumtemp in 100 ul PBTB / Probe während Schaukeln auf Kolbenpendel. </li> &lt;li&gt; entfernen Blocking-Lösung aus Embryonen und inkubieren Proben für 1,5-2 Stunden bei Raumtemperatur mit 100 ul / Probe des monoklonalen Biotin Anti-DIG-Antikörper-Lösung (verdünnt 1/400 ab Lager in PBTB) mit Schaukeln. </li><li> Waschen Proben 6 mal für jeweils 5 min mit 100 ul PBTB / Probe mit Schaukeln. </li><li> Inkubieren 1,5 Stunden bei Raumtemperatur mit 75 ml / Probe von Streptavidin-HRP-Lösung (verdünnt 1/100 ab Lager PBTB, 10 ug / ml Endkonzentration) mit Schaukeln. </li><li> Waschen Proben 6 mal für 5 min Jeweils 100 ul PBTB / Probe mit Schaukeln (für die DNA-Gegenfärbung, verdünnter DAPI auf 1X Arbeitskonzentration in PBTB und diese Lösung im ersten Waschschritt). </li><li> Spülen Embryonen mit PBT, dann waschen 2 mal für 5 min mit PBS. </li><li> Inkubieren Proben für 2 Stunden bei Raumtemperatur auf der Kolbenpendel mit 50 ul / Probe von Cy3-Tyramid Lösung (verdünnt 1/50 in Tyramid Amplifikationspuffer). Von diesem Schritt auf, stellen Sie sicher, um Proben in einem Licht abgeschirmt Behälter halten. &lt;/ Li&gt; <li> Waschen Proben 6 mal für jeweils 5 min mit 100 ul PBS / Probe auf Kolbenpendel. </li><li> Entfernen PBS und fügen 100-125 ul / Probe der Montage Lösung mit 70% Glycerin und 2,5% (DABCO). Proben bei 4 ° C. Diese Proben können für mehrere Jahre gelagert werden. </li><li> Mit einem breiten Bohrung Spitze, resuspendieren Embryonen durch vorsichtiges Pipettieren der Proben und übertragen 25 ul von Embryonen auf einen Objektträger aus Glas, dann ein Deckglas über die Embryonen und Dichtung auf dem Objektträger mit Nagellack. </li><li> Analysieren Embryos Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Für Sonde Syntheseschritte, wir erzeugen typischerweise Run-off-Antisense-RNA-Sonden durch in vitro Transkription von full-length Drosophila cDNAs von Plasmiden in der Drosophila Gene Collection (DGC), eine Ressource auf der folgenden Website detailliert gefunden amplifiziert: <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">http://www .fruitfly.org / DGC / index.html</a> 14,15. Dieser Ansatz wurde ausgiebig in großem Maßstab ISH Studium an Mapping-Genexpression u...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> T7, T3 oder SP6-RNA-Polymerase </td><td> Fermentas Life Sciences </td><td> EP0101, EP0111, EP0131 </td><td> Die Kits enthalten Reaktionspuffer. </td></tr><tr><td> DIG RNA Labeling Mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11 277 073 910 </td><td></td></tr><tr><td> RNAguard </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 27-0816-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3M Natriumacetat </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kalter 100% Ethanol. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kaltem 70% Ethanol. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chlorbleichlauge 1:1 mit Wasser verdünnt. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heptan </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada </td><td> Katalog Nr. P2308 </td><td></td></tr><tr><td> 40% Formaldehyd-Lösung, frisch zubereitet </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS-Tween-Lösung (PBT) </td><td></td><td> 1xPBS, 0,1% Tween-20 </td><td></td></tr><tr><td> Glycinlösung </td><td></td><td> 2 mg / ml Glycin in PBT </td><td></td></tr><tr><td> HRP-konjugierten Maus-monoklonalen anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc </td><td> 200-032 - 156 </td><td> (1/400 Verdünnung einer 1 mg / ml Stammlösung in PBTB </td></tr><tr><td> HRP-konjugiertem Schaf-monoklonalen anti-DIG </td><td> Roche Applied Science, Laval, QC </td><td> 1 207 733 </td><td> 1/500 Verdünnung der Stocklösung in PBTB </td></tr><tr><td> Biotin-konjugierten Maus-monoklonalen anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA </td><td> 200-062-156 </td><td> (1/400 Verdünnung einer 1 mg / ml Stammlösung in PBTB </td></tr><tr><td> Streptavidin-HRP-Konjugat </td><td> Molecular Probes, Eugene OR, USA </td><td> S991 </td><td> (1/100 Verdünnung einer 1 ug / ml Brühe </td></tr></tbody></table>

whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos

Beurteilung der Expression eines Gens, sowie der subzellulären Lokalisation Eigenschaften seiner transkribierte RNA, sind wesentliche Merkmale für das Verständnis seine biologische Funktion während der Entwicklung. RNA in situ Hybridisierung (RNA-ISH) ist eine leistungsfähige Methode zur Visualisierung von RNA Verteilung Eigenschaften verwendet, sei es bei den Organismen, Zellen oder subzellulären Ebene 1. RNA-ISH basiert auf der Hybridisierung einer markierten Nukleinsäure-Sonde (z. B. Antisense-RNA, Oligonukleotiden) komplementär zu der Sequenz eines mRNA oder eines nicht-kodierende RNA Ziel von Interesse 2 basiert. Da das Verfahren erfordert Primärsequenz Information allein zur sequenzspezifischen Sonden zu erzeugen, kann es allgemein zu einem breiten Spektrum von Organismen und Gewebeproben 3 angewendet werden. In der Tat, eine Reihe von großen ISH Studien durchgeführt wurden, um die Genexpression zu dokumentieren und RNA Lokalisation Dynamik in verschiedenen Modellorganismen hat sich auf das führteAufbau wichtiger Community-Ressourcen 4-11. Während eine Vielzahl von Sonden-Markierung und zum Nachweis Strategien im Laufe der Jahre entwickelt worden sind, bieten die kombinierte Verwendung von fluoreszenzmarkierten Nachweisreagenzien und enzymatische Signalverstärkung Schritte signifikante Verbesserungen der Empfindlichkeit und Auflösung des Verfahrens 12. Hier beschreiben wir eine optimierte Fluoreszenz in situ Hybridisierung Verfahren (FISH) unter Verwendung Tyramid Signalverstärkung (TSA), die RNA Expression und Lokalisation Dynamik inszeniert Drosophila-Embryonen zu visualisieren. Das Verfahren wird in 96-well PCR-Platte-Format, das erleichtert die gleichzeitige Verarbeitung einer großen Zahl von Proben durchgeführt.

Wenn erfolgreich durchgeführt, bietet dieses Verfahren eine auffallend erhöhtes Maß an Detail in der räumlich-zeitlichen Analyse von Genexpression und mRNA Lokalisation Dynamik in der frühen Drosophila Embryogenese. In der Tat, wie in 3A für die klassische Pair-rule-Gens runt (run) dargestellt, kann man dieses Protokoll, um die Genexpression Veranstaltungen über den Nachweis des entstehenden transcript Herde in Gruppen zum Ausdruck Kerne beobachten. Zusätzlich, wie im Embryo Mo...

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Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Hier beschreiben wir eine ganze-mount fluoreszierende<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)-Protokoll für die Bestimmung der Expression und Lokalisation Eigenschaften von RNAs während der Embryogenese in der Fruchtfliege ausgedrückt,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

whole-mount-rna-fluorescent-situ-hybridization-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

18.2K Aufrufe.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM). Hier beschreiben wir eine ganze-mount fluoreszierende In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll für die Bestimmung der Expression und Lokalisation Eigenschaften von RNAs während der Embryogenese in der Fruchtfliege ausgedrückt, Drosophila melanogaster.

Serie: Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Mit Whole Berg In situ Hybridisierung zu Molecular Biology und Organismal Link-

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung in whole mount Embryonen und Histologie für Marine Elasmobranchs Angepasst

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Hohe Auflösung Ganze Berge<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung innerhalb Zebrafischembryonen Gene Expression und Funktion zu untersuchen

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Die Analyse der Apoptose in Zebrafischembryonen von Whole-mount Immunfluoreszenz an aktivierte Caspase 3 Detect

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...