Als Organismus mit kurzer Schwangerschaft sind die Embryonen von Drosophila melanogaster erstklassige Studienobjekte, um die Verteilung und Lokalisation von Proteinen und ihren Regulatoren während der Entwicklung zu untersuchen. Aufgrund ihrer lipidreichen Embryonen und ihres chitinreichen Chorions ist ihr Nutzen jedoch durch die Schwierigkeit begrenzt, Embryonen auf Glasoberflächen zu montieren. In dieser Arbeit stellen wir eine praktische Methode vor, die die Bindung von Drosophila-Embryonen auf Objektträgern signifikant verbessert und unsere Methoden für eine erfolgreiche Histochemie, Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierung detailliert beschreibt.
Vor den hier gezeigten Schritten sollten die Objektträger mit Reinigungsmittel gewaschen und dann in Leitungswasser und destilliertem Wasser gespült werden, bevor sie zum Trocknen in den Ofen gestellt werden. Trockenobjektträger sollten 24 Stunden lang vorsichtig in Kaliumdichromat einweichen, bevor sie erneut gespült und getrocknet und dann mindestens zwei Stunden lang in 95% Ethanol gegeben werden. In diesem Schritt können Sie weitere Objektträger oder die Chrom-Alaun-Gelatine nach unseren Methoden vorbereiten.
Gelatine kann dann vor Gebrauch in 60 Grad Badewasser gelagert werden. Um Objektträger zu beschichten, lassen Sie eine kleine Menge Gelatine auf einen Rand des Objektträgers fallen. Verwenden Sie dann einen weiteren Glasschieber, um die Gelatine langsam und gleichmäßig über die Oberfläche des zu beschichtenden Objektträgers zu ziehen.
Dadurch entsteht eine dünne, gleichmäßige Schicht. Bevor es in ein Gestell oder eine Trocknungsvorrichtung gelegt wird, um in einem Ofen gelagert zu werden, um eine weitere Trocknung über Nacht oder 48 Stunden zu ermöglichen. Embryonen werden mit einer Traubensaft-Agarplatte gesammelt, sobald sie fertig sind, kann die Traubensaft-Agarplatte dann entfernt werden.
Überfluten Sie die Platte mit PBS und bürsten Sie vorsichtig mit einer weichen Bürste, um alle angeschlossenen Embryonen zu entfernen. Entfernen Sie den PBS-haltigen Embryo in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und lassen Sie ihn auf Eis ruhen. Sobald sich die Embryonen auf Eis abgesetzt haben, entfernen Sie vorsichtig den überstehenden PBS.
Achten Sie darauf, den Embryo am Boden der Röhre nicht zu stören. 1 ml 50% Bleichmittel in die Probe geben und zwei Minuten lang vorsichtig schütteln. Entfernen Sie das Bleichmittel durch Filtration und waschen Sie die Embryonen dreimal in PBS.
Bereiten Sie n-Heptan vor. Sobald Sie fertig sind, waschen Sie die Embryonen aus dem Filterpapier in n-Heptan, indem Sie das Filterpapier vorsichtig in der Lösung schütteln. Lassen Sie die Embryonen sich am Boden der n-Heptanplatte niederlassen und sammeln Sie dieses n-Heptan in einem neuen 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Fügen Sie einen Milliliter Methanol in die Tube hinzu, lassen Sie die Lösung ausfallen und saugen Sie dann das n-Heptan-Methanol ab. Waschen Sie den Embryo drei- bis fünfmal in PBS, um Restmethanol zu entfernen. Entfernen Sie dieses zusätzliche PBS und fügen Sie Bouins Fixiermittel hinzu und lassen Sie es 30 bis 60 Minuten einwirken, um die Embryonen zu fixieren.
Entfernen Sie Bouins Fixiermittel und waschen Sie die Embryonen dreimal erneut in PBS. Bereiten Sie 1,2% Agarose in PBS vor und halten Sie es in einem 60-Grad-Wasserbad warm, dann bereiten Sie die Embryonen für die Einbettung vor, indem Sie vorsichtig zusätzliches PBS absaugen, in dem sie gelagert wurden. Achten Sie darauf, die Embryonen am Boden nicht zu stören, und saugen Sie dann den Embryostopfen am Boden der Lösung ab und legen Sie ihn vorsichtig in eine Flaschenverschlussform.
Saugen Sie zusätzliches PBS aus dieser Form ab, bevor Sie 1,2% Agarosegel hinzufügen. Bereiten Sie eine PBS-Lösung vor, um diese Agarose-Plugs zu lagern. Sobald sich die Agarose verfestigt hat, können einzelne Stecker zur Lagerung in dieses PBS verschoben werden.
Hier zeigen wir den sequentiellen Dehydratisierungsprozess. Erlaubt jedes Mal 15 Minuten für die Inkubation. Dann entfernen Sie das 100% ige Ethanol und fixieren Sie es in einer Eins-zu-Eins-Lösung aus Ethanol und Xylol für weitere 15 Minuten.
Nach dem Entfernen aus dieser Eins-zu-Eins-Lösung für eine Minute in reines Xylol entfernen. Jetzt ist die Gewebeprobe bereit, in eine erwärmte Eins-zu-Eins-Xylolparaffinlösung gebracht zu werden. Vor der endgültigen Einbettung in 100% Paraffin 30 Minuten ruhen lassen.
Bewegen Sie sich zum ersten von 100% Paraffin und ruhen Sie sich zwei Stunden aus. Wiederholen Sie diesen Vorgang in seinen zwei und drei Paraffinen. Die Probe ist nun bereit, in eine Form gebracht und die Form mit Wachs gefüllt zu werden, um den Einbettungsprozess abzuschließen.
Einbettung von Drosophila-Embryonen. Legen Sie vorbereitete Paraffinabschnitte von Drosophila-Embryonen für 15 Minuten in einen 60-Grad-Ofen. Legen Sie sie in eine 100% ige Lösung von Xylol.
Wir beginnen dann mit der Rehydratation. Platzieren Sie die Folien in jeder dieser Lösungen für jeweils drei Minuten. Sobald sich der Objektträger in destilliertem Wasser befindet, geben Sie ihn zwei Minuten lang in die Hämatoxylinlösung.
Stellen Sie nach Abschluss sicher, dass Sie so viel wie möglich von der Lösung aus dem Objektträger abtropfen lassen. Sobald der Objektträger in destilliertem Wasser gewaschen wurde, färben Sie den Objektträger eine Minute lang in Eosin. Zum Schluss den Schieber aus dem Eosin nehmen und in destilliertem Wasser waschen.
Sobald diese Folie sauber ist, beginnen wir nun mit unserem letzten Dehydratisierungsprozess. Schließlich für fünf Minuten in 100% Xylol gegeben. Dieser Vorgang wird in zwei neuen Lösungen von 100% Xylol wiederholt und lässt eine kleine Menge neutralen Kaugummis entlang einer Kante des Objektträgers fallen.
Nehmen Sie diesen Abdeckschlitten und positionieren Sie ihn vorsichtig auf einer Kante des Objektträgers. Deparaffinisieren Sie zuerst die Objektträger, indem Sie sie in 100% Xylol legen. Sobald die Objektträger aus destilliertem Wasser entfernt wurden, sollten sie mit 1% periodischer Säurelösung bedeckt werden.
Wir entsorgen dann die überschüssige Lösung und spülen sie in destilliertem Wasser ab. Indem Sie den Objektträger direkt in eine vorgewärmte Lösung legen. Sobald dies abgeschlossen ist, spülen wir den Objektträger in destilliertem Wasser ab und färben die Lösung dann mit 0,2% Goldchlorid für ein bis zwei Minuten.
Als nächstes fixieren wir das Gewebe mit 3% Natriumthiosulfat für drei Minuten mit destilliertem Wasser. Und dann Flecken mit Hämatoxylin entgegenwirken. Nach dem Gegenfärben kann der Fleck mit beiden Röhrchen destilliertem Wasser gewaschen werden, wie hier gezeigt.
Dann gehen wir zum Dehydratisierungsprozess über. Befolgen Sie dies, indem Sie die Dias direkt in 100% Xylol legen und dann eine kleine Menge neutralen Kaugummis auf die Ecke der Folie auftragen. Vorsichtig mit einem Deckglas abdecken.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Dias wie zuvor durch Deparaffinisieren und Xylol. Und dann in Eins-zu-eins-Xylol-Ethanol. Sobald die Objektträger deparaffinisiert sind, beginnen wir, ihr Gewebe zu rehydrieren und schließlich in PBS.
Legen Sie die Objektträger für 10 Minuten in 0,3% Wasserstoffperoxid aus Methanol. Dann werden die Objektträger mit 20 ml Zielabruflösung bedeckt. Die Dias können dann in die Färbebox gelegt werden.
Legen Sie die Färbebox in einen Dampfgarer, um sicherzustellen, dass keine Lösung entweicht und die Dias noch vollständig abgedeckt sind. Beachten Sie, dass der Deckel der Fleckenbox nicht vollständig geschlossen werden sollte, damit während des Dämpfvorgangs Wasserdampf entweichen kann. Und dann dreimal vorsichtig in PBS-T spülen.
Verwerfen Sie die überschüssige Lösung und wiederholen Sie den Vorgang, diesmal mit PBS. Als nächstes inkubieren wir die Objektträger in einem Peroxidblock für fünf bis 10 Minuten und spülen dann mehrmals wieder in PBS-T und dann in PBS. Bereiten Sie den Antikörper vor und lassen Sie ihn direkt auf das Gewebe fallen.
Diese Gewebe können dann vier Stunden lang oder bei Raumtemperatur inkubiert werden. Der sekundäre Antikörper sollte bei Raumtemperatur für 90 Minuten inkubiert werden, was zwei bis 10 Minuten lang mit 5% DAB färbt. Nachdem die entsprechende Farbe erhalten wurde, spülen Sie sie in destilliertem Wasser ab und bekämpfen Sie dann die Flecken in Hämatoxylin.
Nach dieser Hämatoxylinfärbung können die Objektträger dann nacheinander dehydriert werden. Legen Sie die Dias in 100% Xylol und lassen Sie sie drei Minuten einweichen. Lassen Sie dann kleine Mengen neutralen Kaugummis auf einen Rand des Objektträgers fallen.
Sobald ein Kaugummi platziert wurde, nehmen Sie die Diaabdeckung und legen Sie sie vorsichtig von einer Kante des Objektträgers ab. Fügen Sie ein Mikrogramm gereinigte linearisierte Vorlagen-DNA zu einer sterilen RNase-freien Reaktionsdurchstechflasche hinzu. Dann fügen Sie genügend steriles RNase-freies DEPC-behandeltes doppelt destilliertes Wasser hinzu, um ein Gesamtprobenvolumen von 13 Mikrolitern zu erhalten.
Dann kurz zentrifugieren und zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Für RNase-Schutzexperimente empfehlen wir, 15 Minuten lang mit zwei Mikrolitern Dnase-1, RNase-frei, zu inkubieren, um Template-DNA zu entfernen. Sobald der Inkubationsschritt abgeschlossen ist, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie zwei Mikroliter 0,2 molare EDTA bei einem pH-Wert von acht hinzufügen.
Vor den Schritten, die hier gezeigt werden, wurden die Dias nach unserem zuvor demonstrierten Protokoll deparaffinisiert und rehydriert. Nach der Rehydratation inkubieren Sie die Objektträger in 0,01 Mol pro Liter PBS bei einem pH-Wert von 7,4 für jeweils fünf Minuten, um die fixierende Lösung aus dem Gewebe zu entfernen. Nach dem Spülen in PBS spülen wir als nächstes zweimal fünf Minuten lang mit 100 Millimolar pro Liter Glycinlösung, um freie Aldehydgruppen aus dem Gewebe zu entfernen.
Nach diesem Schritt spülen Sie die Objektträger fünf Minuten lang mit PBS ab. Als nächstes inkubieren Sie in PBS mit 0,3% Triton X-100 für 15 Minuten vor dem Spülen und inkubieren Sie dann erneut mit einem Mikrogramm pro Mikroliter Proteinase K.Als nächstes fixieren Sie Objektträger mit 4% Paraformaldehyd und PBS bei einem pH-Wert von 7,2 für drei Minuten. Dann waschen Sie die Objektträger vor der Inkubation mit 0,1 molaren Triethanolamin-Puffer pH 8, der 0,25% Essigsäureanhydrid enthält.
Sie können die Box zu diesem Zeitpunkt kippen, um eine vollständige Abdeckung der Lösung zu gewährleisten. Die Box wird durch Zugabe von 20% Glycerin oder DEPC-Wasser auf den Boden einer trockenen Hybridisierungsbox hergestellt. Als nächstes bedecken Sie die Objektträger in 20 Mikrolitern Vorhybridisierungslösung.
Lachssperma DNA in einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter zu jedem Objektträger. Und dann vier Stunden bei 42 Grad Celsius inkubieren. Dies geschieht in einer vorgefertigten befeuchteten Box, um sicherzustellen, dass die Lösung während dieses Prozesses nicht trocknet.
In der Phase nach der Hybridisierung ist es sehr wichtig, dass die Hybridisierungslösung vollständig aus Ihren Proben gespült wird. Dies kann in aufeinanderfolgenden Spülungen von 15 Minuten bei 37 Grad erfolgen, wobei das Vierfache der Konzentration SSC, die zweifache Konzentration eine mal die Konzentration, die 0,5-fache Konzentration und die 0,1-fache Konzentration der SSC-Lösung verwendet wird. Jeder Inkubator für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Nachdem dies erledigt ist, waschen Sie mit PBS dreimal für jeweils fünf Minuten, bevor Sie den Waschpuffer hinzufügen. Der Waschpuffer sollte vor den nächsten Schritten eine Minute lang gespült werden Stellen Sie sicher, dass der Waschpuffer vollständig von den Objektträgern trocken ist, bevor Sie die nächste Lösung hinzufügen. Fügen Sie jedem Objektträger 100 Milliliter Blockierlösung hinzu und inkubieren Sie den Objektträger 30 Minuten lang.
Dies geschieht am besten in einer lichtfreien Umgebung, um eine gute Färbung zu gewährleisten. Als nächstes inkubieren Sie die Objektträger für 30 Minuten erneut in 20 ml Antikörperlösung. Tragen Sie die Antikörperlösung direkt auf Objektträger auf, um Ihr Gewebe vollständig abzudecken.
Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, tragen Sie 100 Milliliter Waschpuffer auf. Inkubieren Sie 15 Minuten lang unter lichtfreien Bedingungen, um ungebundene Antikörperkonjugate zu entfernen. Entfernen Sie den Waschpuffer.
Als nächstes 20 Milliliter Detektionspuffer auftragen und etwa vier Minuten inkubieren lassen. Entfernen Sie nach vier Minuten den Erkennungspuffer. Trocknen Sie die Objektträger, um sicherzustellen, dass keine zusätzliche Lösung gefunden wird, und fügen Sie 10 Milliliter frisch zubereitete Farbsubstratlösung hinzu.
Diese Reaktion beginnt innerhalb weniger Minuten, ist aber nach 16 Stunden abgeschlossen. Lassen Sie also für diesen Zeitraum in einem lichtfreien Zustand inkubieren. Sobald die gewünschten Stellen erkannt werden, waschen Sie den Objektträger mit 50 Millilitern TE-Puffer, um die Reaktion zu stoppen.
Und dann schließen Sie unseren zuvor gezeigten Trocknungsprozess und Montageprozess für neutrales Kaugummi ab. Die Abbildungen eins und zwei zeigen das Chromaluminiumgelatine-Beschichtungsverfahren für Paraffinschnitte und das Einbettungsverfahren für das Expressionsprofil von FKBP12 und DmFKBP12 bei der Entwicklung von Drosophila-Embryonen. Abbildung drei zeigt die Proteinverteilung des Antikörpers FKBP12 in den synzytialen zellulären Blastoderm-Stadien.
Aus diesen histochemischen Ergebnissen kann ersichtlich sein, dass die FKBP12-Expression im synzytialen Blastoderm weniger polarisiert ist und dann beginnt, sich innerhalb der Basalmembran unter dem Trophektodermepithel zu lokalisieren, informiert den Gradienten mit mehr Expression in den vorderen und hinteren Polen. Abbildung vier, die die frühen und späten Gasbeziehungsstadien des Drosophila-Embryos verfolgt, zeigt, dass das FKBP12-Protein auf bestimmte architektonische Komponenten des primitiven embryonalen Gewebes beschränkt wird. Mit geringerer extrazellulärer Verteilung als in frühen und späten gastronomischen Embryonalstadien.
Interessanterweise wird die oben beschriebene dynamische Proteinverteilung nicht von entsprechenden Veränderungen der MRT-Spiegel von FKBP12 begleitet, wie in Abbildung fünf zu sehen ist. Zeigt an, dass die Proteinexpression das Ergebnis eines noch unbekannten posttranskriptionellen molekularen Mechanismus ist. Die Ryanodinrezeptor-vermittelte Kalziumsignalisierung ist ein grundlegender Weg in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen von Wirbeltieren und wirbellosen Tieren.
Es ist bekannt, dass Mutationen in diesem Gen viele physiologische Störungen verursachen, die zu Krankheiten oder einem frühen Herztod führen. Die Rolle, die dieses Gen bei der frühen Entwicklung von Drosophila spielt, war jedoch schwer zu untersuchen. Als Transitkomponente des Embryos erschweren der lipidreiche Embryo und das chitinreiche Chorion Untersuchungen der Protein- und Embryonalexpression in der frühen Drosophila-Entwicklung.
Die in diesem Artikel beschriebene Objektträgerbeschichtung, Embryoeinbettung und immunhistochemische Techniken haben es uns ermöglicht, die dynamische Verteilung von Ryanodinrezeptorprotein und mRNA im Detail zu untersuchen. Wir teilen diese Techniken und die Hoffnung, dass sie es anderen ermöglichen werden, andere Proteine in frühen Entwicklungsstadien von Drosophila zu untersuchen.
