Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Ellison Medical Foundation (SDP unterstützt <a href="http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp" target="_blank">http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp</a> ), NIH K01AG031917 (NJL, <a href="http://www.nih.gov" target="_blank">http://www.nih.gov/</a> ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) und NIH R01AG030593 (SDP). Diese Arbeit verwendet die Ressourcen des Drosophila Aging Core (DAC) der Nathan Shock Center of Excellence in der Biologie des Alterns von der National Institute of Aging P30-AG-013.283 (gefördert <a href="http://www.nih.gov" target="_blank">http://www.nih.gov/</a> ). Die Autoren möchten die Pletcher Labor für hilfreiche Diskussionen und vor allem Brian Chung für die kritische Durchsicht des Manuskripts danken. Wir möchten Nick Asher und Kathryn Borowicz für die Unterstützung bei der Datenerhebung zu bestätigen.

Wir empfehlen die Lagerung experimentellen Lebensmittel, Hefepaste und Trauben Agarplatten, die im Protokoll erscheinen bei 4 ° C und mit ihnen innerhalb von 1-2 Monaten, solange Form und Trockenheit nicht in. Norm Umgebungsbedingungen sowohl für die Larven und erwachsenen gesetzt inszenieren beinhalten Wartung von Fliegen in einem Brutschrank bei 25 ° C mit einem 12:12 h Licht-Dunkel-Zyklus und 60% relativer Luftfeuchtigkeit. Ein. Vorbereitung für Experimentelle Küche <ol><li> Für Larvenwachstum, verwenden wir eine modifizierte Caltech Medium 5, das abgekürzt wird in diesem Protokoll als CT. </li><li> Wir empfehlen eine Ernährung für erwachsene Drosophila (SY), das aus Zucker (Saccharose) und Hefe (lyophilisiert ganzen Bierhefe) in einer 2% Agar-Basis, die gekocht worden ist, mit Antibiotika und Anti-Pilz-Mittel ergänzt besteht, und verteilt (10 ml pro Fläschchen) 6. Lebensmittel sollten erstarren gelassen und verdampfen für 12-24 Stunden vor der Lagerung werden. Weil der Nährstoff-Umgebung kann substanWesentlichen Einfluss Langlebigkeit, Konsistenz Garverfahren ist sowohl innerhalb eines Experiments und zum Vergleich zwischen den Experimenten unerlässlich. </li><li> Wenn ein pharmakologisches Mittel ist, um zu der erwachsenen Lebensmitteln zugesetzt werden, kann dieses Arzneimittel in einer kleinen Charge von Nahrungsmitteln und geschichtet (2 ml) auf die Nahrungsmitteloberfläche mit Kontrollfläschchen Empfangen enthaltenden Schichten Vehikel gemischt werden. </li></ol> 2. Vorbereitung einer Live Hefepaste Kombinieren Sie 5-6 ml Wasser mit 3 g Trockenhefe und gut mischen. Die Konsistenz des Hefepaste muss die für eine glatte Erdnussbutter sein. 3. Vorbereitung eines Grape Agarplatte <ol><li> Fügen Sie ein Paket von einer Traube Agar Vormischung in 500 ml destilliertem Wasser in einem 1.000 ml-Flasche und folgen Sie den Anweisungen auf der Packung, um die Trauben Agar Mix auflösen. </li><li> Füllen Sie vorsichtig eine dicke Schicht des Gemisches in 100 mm Petrischalen unter Vermeidung Blasenbildung. Ein Paket von Premix produziert rund 14 grape Agarplatten. </li><li> Lassen Sie die Medien abkühlen und erstarren bei Raumtemperatur mit Deckel für 15 min. Platten können bei 4 ° C aufbewahrt werden, eingewickelt in Plastikfolie oder sofort verwendet werden. </li></ol> 4. Sammlung Synchronisiertes Eggs Alle Medien in diesem Protokoll verwendet, dh Hefe, Trauben Agarplatten, CT und 10% SY Lebensmittel sollte Raumtemperatur haben. <ol><li> Verteilen Sie eine 2-3 cm Durchmesser aus Hefe auf einer Traube Agarplatte fügen und beiseite stellen. </li><li> Legen Sie ein großes Ei Sammlung Käfig auf einer CO 2-Pad mit dem Mesh-side down, um die Fliegen zu betäuben. Stickstoff-Narkose ist eine Alternative zu CO 2, von einigen Laboratorien, die qualitativ hochwertige Ergebnisse können 7. </li><li> Mit einem Trichter, übertragen 150-200 Paar fliegt in der Eizellenentnahme Käfig. </li><li> Legen Sie die Trauben Agarplatte das offene Ende des Käfigs an und sichern mit einer Endkappe. </li><li> Legen Sie den Käfig auf seiner Seite, bis Fliegen aufwachen.Dann halten Sie den Käfig, Trauben Agarplatte Seite nach unten in den Inkubator über Nacht. </li><li> Am nächsten Tag, tauschen die Traube Platte mit einem neu enthefte Trauben Platte. Nur setzen ca. 1 cm Durchmesser von Hefe Paste auf die Oberfläche der Platte. Entsorgen Sie den 1. Tag Trauben Platte. </li><li> Erlauben Embryonen auf der Oberfläche der Traube Agarplatte für 16-22 h sammeln. Ist das erledigt, sammeln die Trauben Agarplatte und entsorgen Sie die Muttergesellschaft Fliegen. </li><li> Waschen Sie die Oberfläche der Trauben Agarplatten mit 1x Phosphate Buffered Saline (PBS). Eier können durch vorsichtiges Schaben mit einem Wattestäbchen mobilisiert werden. Achten Sie darauf, nicht zu kratzen, Schäden oder kratzen dünne Stücke von Agar von der Oberfläche der Platte. Mit Hilfe eines Trichters, gießen die gewaschenen Eier in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Lassen Sie die Eier in den Boden des Röhrchens absetzen und giesst die überstehende, man aufpassen, nicht alle Eier verlieren. Das verbleibende Volumen sollte ca. 2-3 ml betragen. </li><li> Hinzufügen von 8 bis 10 ml PBS mit dem Rohr und die vorgenannten Schritte wiederholen 2-3 more mal gründlich zu waschen, die Eier, bis der Überstand klar ist. Loswerden von Resthefe ist der Schlüssel in diesem Schritt. </li><li> Nach dem Waschen, abtropfen alle Überstand bis Restvolumen beträgt 2 ml. Aliquot 32 ul von Eiern in CT-Flaschen mit einem breiten Bohrung Pipettenspitze. Eier in der Pipettenspitze sollte kompakt, mit wenig bis gar keine Flüssigkeit angesaugt. Dies kann durch Einführen der Pipettenspitze tief in das Ei Besiedlung und schnell freisetzende den Kolben zum Ansaugen erreicht werden. </li><li> Ort seeded CT Flaschen zurück in den Inkubator ganzen fly Entwicklung. </li></ol> 5. Sammlung Alter abgestimmten erwachsenen Fliegen <ol><li> Erwachsene werden in der Regel vom ersten Tag schlüpfen 9 weiter. Entsorgen Sie die Fliegen, die am ersten Tag und Ort Flaschen entstand wieder in den Inkubator über Nacht. Diese Praxis wird versehentliche Auswahl für Anfang Emergenzen vermieden werden und für die Sammlung von einer maximalen Anzahl von synchronisierten Fliegen. </li><li> 16-22 Stunden später, übertragen die Tage alten Erwachsenen fliegt into 10% SY Lebensmitteln Flaschen. Bei Bedarf können weitere Charge gesammelt am nächsten Tag. </li><li> Zurück fliegt zurück in den Inkubator und ermöglichen Fliegen bis zur Geschlechtsreife und paaren sich für zwei Tage zu erreichen. Notieren Sie sich den Tag der Überweisung auf 10% SY-Flaschen als der erste Tag des Erwachsenseins. </li></ol> 6. Sortierung Flies und Einrichten Longevity Experiment <ol><li> Anesthetize kleine Gruppen von Fliegen auf der Narkose-Pad, dann sortieren Männer und Frauen in zwei Gruppen mit einem Pinsel. Wenn unter Verwendung von CO 2 ist es kritisch, um die Exposition gegenüber möglichen langanhaltende Gesundheitsfragen, die die Integrität der Langlebigkeit Experiment kompromittieren kann verhindern minimieren. </li><li> Platz 30 Fliegen des gleichen Geschlechts in einzelne Ampullen. Vorausgesetzt, ohne Balancer-Chromosomen in der Bevölkerung und gesunde Nachkommen, sollte jede Flasche etwa 3-4 Fläschchen jedes Geschlecht zu produzieren. Aliquotieren Fliegen in einzelne Ampullen sollte nicht mehr als 3-4 min, so daß im gesamten, Fliegen nur auf die Anästhesie für maximal belichteten9-10 min. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte, bis 6,1-6,2 gibt es 8-10 Fläschchen Wiederholungen für jedes Geschlecht und experimentelle Therapie. </li></ol> 7. Einrichten der Excel-Tabelle, um die Langlebigkeit Experiment verfolgen <ol><li> Wir empfehlen Randomisieren Fläschchen Position anstatt Gruppieren Vials durch experimentelle Bedingung, um schräg in der Phiole Lage im Inkubator einhergehen, zu vermeiden und um das Fläschchen Identität zu der Experimentator verdunkeln. Dazu weisen Sie zunächst eine randomisierte numerische ID zu jedem Fläschchen in einem Tabellenkalkulations-Programm, dann ordnen Sie die Fläschchen in Schalen von ID-Nummer. Wenn Sie die dLife Experiment-Management-Software, befolgen Sie die Anleitung zum Versuchsaufbau, um die ID-Nummer für jedes Fläschchen zu generieren. </li><li> (Optional) Wenn Sie einen RFID-Leser oder Barcode-Leser in Zusammenarbeit mit dLife sind, schließen Sie einen RFID-oder Barcode-tag in jedes Fläschchen und ordnen Sie den Tag mit der Ampulle die numerische ID in dLife. Das Programm erkennt jedes Fläschchen, wenn sie mit einem Lesegerät gescanntund leiten ein, um die Daten an der richtigen Stelle in einer Tabelle aufgezeichnet. Die Nutzung eines Tag-Lesegerät in Verbindung mit dLife reduziert Datenerfassung Zeit und Fehler bei der Aufzeichnung. </li></ol> 8. Aufrechterhaltung der Longevity Experiment Die Fläschchen mit frischen Lebensmitteln sollte bei Raumtemperatur für jeden Transfer sein. <ol><li> Während der Versuchsphase, die Übertragung Fliegen auf neue Flaschen frischen Lebensmitteln alle 2 Tage (junge Frauen), oder 3 mal pro Woche (Männchen oder Weibchen&gt; 3 Wochen alt). Dieser Schritt stellt sicher, dass das Zuführen Umgebung für junge Frauen nicht durch das Vorhandensein von Larven gestört. Dieser Transfer sollte ohne Narkose abgeschlossen werden, was akute Mortalität verursachen, besonders bei älteren Fliegen (Pletcher, persönliche Beobachtungen). </li><li> Während jedes Fläschchen übertragen, aufzeichnen das Alter, zählt die toten Fliegen in der alten Flasche, und die toten Fliegen, die auf die neue Flasche durchgeführt werden. Notieren Sie diese Informationen separat inzwei Spalten in einer Tabelle (entweder dLife oder eigene Tabellenkalkulation). Dadurch wird sichergestellt, dass die durchgeführten Fliegen nicht doppelt gezählt. Die Gesamtzahl der Todesfälle (dead + durchgeführt) sollte mindestens gleich der Anzahl der durchgeführten Fliegen aus dem letzten Transfer. Subtrahieren der Anzahl von zuvor durchgeführten entfernt von der gesamten Zahl von Todesfällen, die Zahl der Todesfälle neuen zu bestimmen. </li><li> Eine Fliege gilt rechten zensiert, wenn es das Experiment links vor dem natürlichen Tod durch Flucht oder Tod durch Unfall. Tiere verlassen das Experiment auf diese Weise sollten in einer separaten Spalte am Tag eingetragen werden, dass die Fliege das Experiment beendet. Censored Fliegen sind nicht so tot (siehe unten) aufgezeichnet. </li><li> Weitere Schritte 8,1-8,2 wiederholen, bis der letzte Überlebende tot ist. Seien Sie sich bewusst, dass als Fliegen Alter, einige Fliegen kann auf dem Rücken liegen und erscheinen Toten wegen ihrer Untätigkeit. Daher, wenn das Zählen durchgeführt (toten) entfernt, auf der Seite der Phiolen, um zu bestimmen, ob es Beinbewegungen sind erschließen. Wenn ja, these Fliegen sind noch am Leben. In dem Fall, dass Fliegen zum Essen in der alten Flasche aber lebendig stecken bleiben, sollten sie nicht als tot gezählt werden und sollte durch weitere Erschließung des Fläschchens, die Fliege vertreiben gerettet werden. Zensur wie Fliegen sollten mit Vorsicht verwendet werden, da sie in der experimentellen Bias führen kann. </li></ol> 9. Data Analysis <ol><li> Die Hinterbliebenenpension Kurve zeigt die Wahrscheinlichkeit, dass eine Person zu einem bestimmten Alter überlebt und wird in der Regel unter Verwendung einer Kaplan-Meier-Ansatz (Abbildung 1) 8. In Abwesenheit von rechten zensierten Daten, die Formel kann, so dass altersspezifischen Überlebensrate im Alter x (S x) wird vereinfacht werden, indem die Zahl der Individuen lebendig zu Beginn der Zählung einer Zeit im Alter x (N x) bestimmt durch die Gesamtzahl von Fliegen im Experiment (N 0), S N x = x / N 0. 9,2) Survivorship Kurven sind die häufigste Form der Präsentation der Daten, und siekann für die Gleichstellung zwischen den Gruppen mit einer log-rank-Test geprüft werden. Angemessene Schlussfolgerung kann aus so wenig wie 50-100 Personen in einer Kohorte gezogen werden. Survivorship ist ein kumulatives Maß, aber, und daher Todesfällen, die nicht altersbedingten, wie diejenigen, früh im Leben, wird Überlebensrate während der gesamten Lebensdauer drücken macht es schwierig, festzustellen, spezifische Auswirkungen auf Alterung. </li><li> Eine zweite Datenvisualisierung Methode ist die altersspezifischen Sterblichkeit Funktion, die das Risiko des Sterbens zeigt durch jedes Alter Intervall und stellt eine differenziertere Beschreibung der Überlebensdaten 9,10. Mortalität Maßnahmen sind unabhängig von einem Zeitalter zum anderen, und die Form des Mortalitätskurve ist nützlich für Inferenz über die Dynamik der Alterung, insbesondere bei Anwendungen im Erwachsenenalter eingestellt sind. Schätzungen der altersspezifischen Sterblichkeit, jedoch fehlt die Präzision und Genauigkeit, mit kleinen Stichproben und erfordern oft mehrere-zu-viele Hunderte von Personen pro Kohorte für eine zuverlässige estimate 11. </li><li> Andere Methoden zur Schätzung Langlebigkeit Unterschiede sind parametrische (zB Gompertz) und semi-parametrischen (z. B. Cox-Regression) Modelle. Diese Modelle können leistungsfähige, aber sollten mit Vorsicht wegen der Annahmen über die Gestalt der Kurven Mortalität und der Art der Behandlung Effekte, die zu falschen Folgerung 11,12 führen könnten, aufgebracht werden. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung reproduzierbare Messungen von erwachsenen Langlebigkeit in Drosophila die anpassungsfähig zur Beurteilung von genetischen, pharmakologischen und Umweltinterventionen ist. Zentrale Aspekte des Protokolls sind sorgfältige Kontrolle der Larven Entwicklungsumgebung, die Minimierung Erwachsenen Stress und minimieren Vorspannung über experimentelle Gruppen und Kontrollen. Außerdem stellen wir die Verwendung des dLife Lebensdauer Experiment ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Aktive Trockenhefe </td><td> Fleishmann die Hefe </td><td> 2192 </td><td></td></tr><tr><td> Grape Agar Powder Premix </td><td> Genesee Scientific </td><td> 47-102 </td><td></td></tr><tr><td> Große Embryo Kollektion Cages </td><td> Genesee Scientific </td><td> 59-101 </td><td></td></tr><tr><td> Große Replacement End Caps </td><td> Genesee Scientific </td><td> 59-103 </td><td></td></tr><tr><td> 6 Unzen Platz Bottom Flaschen, Polypropylen </td><td> Genesee Scientific </td><td> 32-130 </td><td></td></tr><tr><td> Flugs Closures for Stock Bottles </td><td> Genesee Scientific </td><td> 49-100 </td><td></td></tr><tr><td> DrosophilaVials, Wide, Polystyrol </td><td> Genesee Scientific </td><td> 32-117 </td><td></td></tr><tr><td> Flugs Verschlüsse für Wide Vials </td><td> Genesee Scientific </td><td> 49-101 </td><td></td></tr><tr><td> Weite Öffnung Aardvark Pipettenspitzen, 200 ul </td><td> Denville Scientific </td><td> P1105-CP </td><td></td></tr><tr><td> Flystuff Flypad, Standard Größe </td><td> Genesee Scientific </td><td> 59-114 </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-70C </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand Petrischalen mit transparenten Deckeln, Raised Ridge, 100 OD x 15 mm H; </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Kimax * Colorware Flaschen 1.000 ml gelb </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-200-47 </td><td></td></tr><tr><td> PBS pH 7,4 10x </td><td> InVitrogen </td><td> 70011044 </td><td></td></tr><tr><td> Gelidium Agar </td><td> Mooragar </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> Bierhefe </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0290331280 </td><td></td></tr><tr><td> Kristallzucker </td><td> Kroger </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> Tegosept </td><td> Genesee Scientific </td><td> 20-266 </td><td> Fly Konservierungsmittel für Lebensmittel </td></tr><tr><td> Propionsäure, 99% </td><td> Acros Organics </td><td> 149300025 </td><td> Fly Konservierungsmittel für Lebensmittel </td></tr><tr><td> Kanamycinsulfat </td><td> ISC BioExpress </td><td> 0408-10G </td><td></td></tr><tr><td> Tetracycline HCl </td><td> VWR </td><td> 80058-724 </td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of lifespan in drosophila melanogaster

Altern ist ein Phänomen, dass die Ergebnisse im stationären physiologischen Verschlechterung in nahezu allen Organismen, in denen es untersucht wurde, was zu einer verminderten körperlichen Leistungsfähigkeit und Risiko von Krankheiten erhöht. Individuelle Alterung zeigt sich auf der Ebene der Bevölkerung als eine Zunahme der altersbedingten Sterblichkeit, die oft im Labor wird durch die Beobachtung Lebensdauer gemessen in großen Kohorten von gleichaltrigen Personen. Experimente, um das Ausmaß zu quantifizieren versuchen, die genetische oder umweltbedingte Manipulationen Auswirkungen Lebensdauer in einfachen Modellorganismen haben bemerkenswert erfolgreich gewesen für das Verständnis der Aspekte des Alterns, die über Taxa und für inspirierende neue Strategien zur Verlängerung Lebensdauer und Verhinderung altersbedingter-assoziierten Erkrankungen bei Säugetieren konserviert sind . Der Essig Drosophila melanogaster, ist ein attraktives Modell für die Erforschung der Mechanismen des Alterns aufgrund seiner relativ kurze Lebensdauer, bequem Tierhaltung und einfache Genetik.Allerdings sind demografische Maßnahmen des Alterns, einschließlich des Alters-spezifische Überleben und Mortalität, außerordentlich anfällig für selbst geringfügige Abweichungen in der experimentellen Gestaltung und Umwelt und die Erhaltung der strengen Laborpraxis für die Dauer des Alterns Experimente erforderlich. Diese Überlegungen, zusammen mit der Notwendigkeit, eine genaue Steuerung des genetischen Hintergrund zu praktizieren, sind essentiell für die Erzeugung robuste Messungen. Tatsächlich gibt es viele bemerkenswerte Kontroversen um Folgerung aus Langlebigkeit Experimente in Hefe, Würmern, Fliegen und Mäusen, die Umwelt oder genetische Artefakte 1-4 wurden verfolgt. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Reihe von Verfahren, die über viele Jahre Vermessung Langlebigkeit in Drosophila mit Labor-Fläschchen optimiert wurden. Wir beschreiben auch die Verwendung des dLife Software, die in unserem Labor entwickelt wurde und steht zum Download (erhältlich <a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/ple</a>tcherlab / Software). dLife beschleunigt den Durchsatz und fördert gute Praktiken, indem optimale Versuchsplanung, Vereinfachung fly Handhabung und Datenerfassung und Standardisierung von Daten-Analyse. Wir diskutieren auch die vielen Fallstricke in der Entwicklung, Sammlung und Interpretation der Lebensdauer von Daten, und wir bieten vor, um diese Gefahren zu vermeiden.

Ein vereinfachtes Schema des Protokolls ist in Abbildung 1, wo wichtige Schritte skizziert vorgestellt. Die Synchronisation Teil des Protokolls können für verschiedene Assays, altersangepassten erwachsenen Fliegen erfordern. Typische Überlebensrate Kurven von Wildtyp-Fliegen sind in Abbildung 2a dargestellt, mit dem dLife Experiment-Management-Software (Abb. 2b, c). Erwachsene Männchen leben meist kürzer, beide Populationen erreichen ei...

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Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiges Modell für die Erkundung der molekularen Grundlagen der Langlebigkeit Regulierung. Dieses Protokoll diskutieren die Schritte bei der Erzeugung eines reproduzierbaren, population-based Messung der Lebensdauer sowie potenzielle Fallstricke und wie man sie vermeidet beteiligt.

Messung der Lebensdauer in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

measurement-of-lifespan-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

33.9K Aufrufe.  University of Michigan. Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiges Modell für die Erkundung der molekularen Grundlagen der Langlebigkeit Regulierung. Dieses Protokoll diskutieren die Schritte bei der Erzeugung eines reproduzierbaren, population-based Messung der Lebensdauer sowie potenzielle Fallstricke und wie man sie vermeidet beteiligt.

Serie: Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection der Larven ZNS von Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Forschung

Biologie

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Hochauflösendes Video Tracking von Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Überwachung Herzfunktion Larven Drosophila melanogaster Für physiologische Untersuchungen

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Präparation Oenocytes von Adult Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imaging Durch die Puppenhülle von<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Aufrechterhaltung eines<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Bevölkerung Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human disease in this organism. Sensitive methods for measurements of parameters such as metabolic rates are needed to drive the understanding of physiology and disease in small animals such as the fruit fly. The method described here assesses fuel oxidation in small numbers of adult flies fed food containing trace amounts of 14C-labeled substrates such as glucose or fatty acid. After the feeding period and any additional experimental manipulations, flies are transferred to short tubes capped with mesh, which are then placed in glass vials containing KOH-saturated filter paper that traps exhaled, radiolabeled CO2 generated from oxidation of radiolabeled substrates as potassium bicarbonate, KHCO3. This radiolabeled bicarbonate is measured by scintillation counting. This is a quantitative, reproducible, and simple approach for the study of fuel oxidation. The use of radiolabeled glucose, fatty acids, or amino acids allows determination of the contribution of these different fuel sources to energy metabolism under different conditions such as feeding and fasting and in different genetic backgrounds. This complements other approaches used to measure in vivo energy metabolism and should further the understanding of metabolic regulation.

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Die Messung der Kohlendioxidproduktion von Radiolabeled Substrate in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...