Diese Arbeit wurde vom Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale unterstützt, das Centre National de la Recherche Scientifique, die Université de Strasbourg, das Hôpital de Strasbourg, der Verband pour la Recherche sur le Cancer, dem Institut National du Cancer, der Agence Nationale de la Recherche und dem Elsass. Pietro Laneve wurde von der Fondation la Recherche Médicale unterstützt gießen. Derzeit ist er ein Empfänger einer Istituto Italiano Tecnologia (IIT) Gemeinschaft. Publikationskosten werden von der Neurex Netzwerk unterstützt (TriNeuron - Programm Interreg IV Oberrhein)

1. Probenentnahme <ol><li> Lösen halbhaft Schneider 2-Zellen (1-5 × 10 6 Zellen im Durchschnitt), und durch Pipettieren geerntet sie durch Zentrifugation (100 × g für 1 min). Im Falle von in vitro kultivierten adhärenten Zellen, trypsinize sie unter Standardbedingungen oder direkt sammeln sie von den Platten in eine geeignete Menge an RNA-Extraktionsreagenz, mit Hilfe eines Zellschabers. </li><li> Für Embryo-Entnahme, wachsen Drosophila-Stämmen in Flugkäfigen und lassen Embryonen sammeln sich auf Legeplatten. Wischen Embryonen durch einen Pinsel in destilliertem Wasser (dH 2 O), entsorgen Trümmer durch Sieb-Filterung, spülen und erholen Embryonen in einer Ampulle 48. </li><li> Als alternative Technik, manuell zu sezieren Gewebe / Organe. Isolieren Hoden (ein Präferenzsystem für piRNA Analyse) von Drosophila Leib in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) unter einem Stereomikroskop (Vergrßerung 20X) unter Verwendung von Nadeln oder Dissektion Zange gegenin Sullivan et al 49 ualized. </li><li> Stößel homogenisieren Proben auf der Sucht nach 0,5 Volumen RNA-Extraktion Reagenz. </li></ol> 2. RNA-Extraktion / Analyse <ol><li> Den Anweisungen des Herstellers durchführen RNA-Isolierung durch kommerzielle Reagenzien. VORSICHT! RNA Extraktionsmittel sind in der Regel toxisch und ätzend. Alternativ Anwendung einer Proteinase K-basiertes Protokoll für die RNA-Isolierung 50, wie folgt: <ol><li> Verdünnen Sie die Proben in 400 ul Stop-Mix und Inkubation bei RT für 15 min. </li><li> Recover wasserlöslichen Komponenten durch Standard Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol und Chloroform-Extraktionen und Ethanol (EtOH) Fällung / Waschen. Luft trocknen die Proben und resuspendieren in Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelten doppelt destilliertem (dd) H 2 O. </li></ol></li><li> Beurteilen RNA-Konzentration durch UV-photometrische Messung. Auch dafür sorgen, das RNA-Reinheit hoch, in der Nähe von 2.0 ist, based auf der A 260 / A 280 Lesung. </li><li> Überprüfen RNA-Präparation auf denaturierenden Agarose-Gel wie folgt: <ol><li> In einen sauberen Becher löst man 1,2 g Agarose in 82 ml DEPC-ddH 2 O, unter kontinuierlichem Rühren. Kochen, bis vollständig gelöst ist. </li><li> Lassen Sie das Gel Lösung abkühlen; wenn die Temperatur 60 ° C erreicht 10 ml 10X 4-Morpholinpropansulfonsäure hinzufügen (MOPS) Puffer auf 1X Endkonzentration (FC) und 8 ml 37% Formaldehyd zu 3% FC. VORSICHT! Formaldehyd ist krebserregend. </li><li> Gießen Sie das Gel in eine horizontale Elektrophorese-Zelle. Lassen Sie das Gel unter einer Haube für mindestens 1 Stunde fest werden. Nach der Erstarrung, tauchen das Gel in MOPS 1X. </li><li> Aliquoten 2 ug RNA-Probe und 1 ug Ladder (verwenden Sie ein RNA-Marker, wenn genaue Auswertung gewünscht wird). Hinzufügen 3 Volumen Agarose-Ladefarbstoff (ALD), um RNA und Leiter. Wärme bei 70 ° C für 5 min und sofort auf Eis kühlen. CAUTION! Inhalt der ALD (Ethidiumbromid und Formamid, siehe Materialien) sind mutagen und korrosiven sind. </li><li> Legen Sie die Proben und führen Sie das Gel bei 50 V für ca. 1 h mit gelegentlichen Puffer Recycling. Überprüfen Sie die RNA durch UV-Fraktionierung Muster Visualisierung oder Gel Imaging. Erkennen diskrete Banden, die 28S-und 18S-rRNAs und tRNAs (siehe Abbildung 1). </li></ol></li><li> Gehen Sie nach Nord Assay oder speichern RNA bei -80 ° C. </li></ol> 3. Denaturierung Acrylamid-Gel Vorbereitung <ol><li> Verwenden Sie eine kleine vertikale Elektrophorese-Apparat für diese Fraktionierung Schritt (Plattengröße ca. 8 cm x 9 cm, Kamm Dicke 0,75 mm). </li><li> Montieren Sie saubere Gläser zusammen in einem Gussrahmen. </li><li> Herstellung von 10 ml 10% Acrylamid / Bis-Acrylamid (19: 1)-Lösung in MOPS-1X, 7 M Harnstoff. Unmittelbar vor dem Gießen werden 100 ul 10% Ammoniumpersulfat und 10 ul TEMED und schnell mischen Sie die Lösung. VORSICHT! Acrylamid ist neurotoxischen und krebserregend. </li><li> Gießen Sie das Gel zwischen Glasplatten und legen Sie die gut Kamm vorsichtig, um Blasen zu vermeiden. Lassen Sie das Gel polymerisiert bei Raumtemperatur mindestens 45 min vor der Verwendung. Alternativ speichern Sie das Gel O / N, in Wasser getränkten Filterpapiere eingewickelt und in Frischhaltefolie versiegelt. </li></ol> 4. Probenvorbereitung <ol><li> Aliquot 0,5-20 ug Gesamt-RNA pro Probe. Wenn Volumen 3-4 ul überschreitet, Vakuum trocknen die Probe. </li><li> Für Größenbestimmung, führen Sie einen aliquoten (20-30 cps) von radioaktiv markiertem Low-Range-Leiter parallel zu Proben, als Marker (siehe Abschnitt 4.3 und 4.4 für Vorbereitung). Behandeln Sie es parallel zu Proben, wie in Schritt 4.5 beschrieben. </li><li> Ladder: eine Phosphatvorwärtsreaktion unter Verwendung von 0,1 ug eines 10 bp-Schritt-Leiter eingestellt. Bei 37 ° C für 30 Minuten und stoppt die Reaktion durch Zugabe von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 20 mM FC. </li><li> Reinige durch EtOH Fällung / Waschen, trocknen undresuspendieren in ddH 2 O (etwa 100 ul). VORSICHT! 32 P ist eine radioaktive Quelle. </li><li> Zu jeder Probe das gleiche Volumen von Acrylamid blauen Farbstoff (ABD). Denaturieren durch Erhitzen bei 80 ° C für 5 min auf Eis und kühlen, bis Belastung. VORSICHT! Formamid (Gehalt in ABD) ist ätzend. </li></ol> 5. Die elektrophoretische Fraktionierung <ol><li> Entfernen Sie die Glasplatten aus der Casting-Unterstützung und richtig montieren sie in der Elektrophorese-Zelle. Füllen inneren und äußeren Kammer mit ausreichender Laufpuffer (RB). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Kamm und Vorlauf das Gel bei 200 V für 10 min. Vor dem Laden der Proben, abzuwaschen Harnstoffablagerungen aus den Vertiefungen durch Spritzen einige RB durch eine Spritze. </li><li> Verwenden Sie flache Spitzen sorgfältig stratify Proben aus Schritt 4.5 an der Unterseite von jedem gut. Überprüfen Anode und Kathode Verbindungen zu umgekehrten Lauf zu vermeiden. Nachdem die Proben in das Gel bei 100 V für 5 min, il zu erhöhen, um die Spannung 200 V. </li><li> Für eine Fraktionierung Länge von etwa 7 cm, einer 45 min-Dauer ausreichend. Vermeiden Bromphenolblau (a Tracking Pigment in ABD), um das Gel überlaufen. </li><li> Visualisieren auf-Gel-der fraktionierten lange RNAs durch Ethidiumbromid (EtBr)-Färbung, als optionaler Schritt: <ol><li> Schneiden Sie 2 cm von der Spitze des Gels und die Scheibe in ddH 2 O. kurz spülen </li><li> Inkubieren Sie die Gel-Scheibe bei RT für 15 min unter leichtem shacking in RB, EtBr 0,5 ug / ml FC. </li><li> Entfärben des Gels für 15 min in RB, visualisieren lange rRNAs durch UV-Bestrahlung oder Gel-Bildgebung. Überprüfen Sie für die RNA-Beladung und Qualität (siehe Abbildung 1, Tafel 7). VORSICHT! Ethidiumbromid ist mutagen. </li></ol></li><li> Unterdessen gehen Lösch den unteren Teil des Gels, die kleine RNA-Spezies. </li></ol> 6. Gel-Blotting <ol><li> Schneiden Sie 6 Stück Löschpapier, um die Blotting Bereich passen und eine äquivalente Stück uncharged Nylon-Membran. Dämpfen Papierbögen, Membran und 2 Schreibunterlagen in RB. Stellen Sie sicher, dass Sie die Pads vollständig genießen, indem Sie wiederholt drückte sie in RB. </li><li> Entfernen Sie das Gel aus dem Gerät, und öffnen Sie die Gläser durch Mittel einer Spachtel. Verwenden Sie ein sauberes Schneider, um die Vertiefungen zu entfernen. Legen Sie ein Blatt feuchten Whatman-Papier auf dem Gel und heben es auf. </li><li> Das Nylonmembran auf die freie Fläche des Gels. Markieren eine Ecke, um die Filter nach Probenbeladung zu orientieren. Füllen Sie das &quot;Sandwich&quot; (3 Papierstücke auf jeder Seite). Wirf einen Kunststoffstab auf dem Blot Oberfläche, um mögliche Luftblasen zu entfernen. </li><li> Legen Sie den Fleck zwischen zwei Schreibunterlagen und dann in der Blotting-Kassette. Bauen Sie die Kassette in den Löschmodul, füllen die Kammer mit RB und kontrollieren die korrekte Ausrichtung (Nylonmembran muss zwischen dem Gel und der positive Terminus zu bleiben). </li><li> Transfer bei 20 V für 20 min. Hinweis: Um homogenen Bedingungen zu gewährleisten, nach 10 Minuten öffnen Sie das Löschmodul und rOtate das Sandwich um 180 ° vor dem Abschluss der Übertragung. </li></ol> 7. Membran Vernetzung <ol><li> Bereiten Sie 6 ml frischem Vernetzungslösung (XLS). Tränken Sie ein 10 cm x 10 cm (größer als Nylonmembran) Stück Löschpapier mit XLS. VORSICHT! HCl (eine Komponente von XLS) ist stark ätzend. </li><li> Blot die Demontage und legen Sie die Membran auf dem nassen 3MM Filterpapier. Hinweis: RNA muss nicht in direktem Kontakt mit der gesättigten Papier. Setzen Sie den Filter und Papier zwischen zwei Glasplatten und wickeln in Saran-Wrap. </li><li> Erwärmen die Membran bei 60 ° C für 2 Stunden, gefolgt von einer ddH 2 O Waschen. Lagerung bei -20 ° C oder fahren Sie mit der Hybridisierung. </li></ol> 8. Membran Prähybridisierung <ol><li> Wenn RNA-Beladung überprüft wurde (optionaler Schritt 5.5), direkt an der Hybridisierung fortfahren. Oder aber, schneiden Sie 1 cm vom Anfang des Nylon-Filter, um die Sondenquer hybridizatio vermeidenns bis fraktionierten lange RNAs. </li><li> Vorwärmkammer 10 ml Hybridisierungslösung (HS) bei 37 ° C aufweist. Denaturieren 1 mg Lachssperma bei 95 ° C für 5 min, cool auf Eis und in den HS. </li><li> Den Filter in HS Inkubation bei 37 ° C für mindestens 1 h unter Rotation in einem Hybridisierungsofen. Überprüfen Sie, dass die RNA-Seite der Filterflächen HS. </li></ol> 9. Sondensynthese <ol><li> Ein Phosphat Vorwärtsreaktion eingestellt auf 10 pmol spezifischer Antisense-Oligonukleotid, wie in 4.3 beschrieben. </li><li> Mit 5 Volumina von Tris-EDTA-NaCl (TEN)-Puffer, um die Reaktion und Reinigung des markierten Primers von nicht eingebauten Nukleotiden durch Gel-Ausschluß-Chromatographie auf G-25 Sephadex-Säulen (oder auch von EtOH-Fällung). Sonde Aktivität kann durch Flüssig-Szintillationszählers beurteilt. </li></ol> 10. Membran Hybridisierung <ol><li> Ersetzen Sie die HS mit einem frischen 10 ml Aliquot (vorbereitet und ergänzt, wie oben beschrieben). Erhitzen Sie die Sonde an95 ° C für 10 min, cool auf Eis und in den neuen HS. Inkubieren des Filters bei 37 ° C auf. </li></ol> 11. Waschen der Membran <ol><li> Wiederherstellen der Hybridisierungslösung und bei -20 ° C in einer Radioaktivität-Abschirmung-Box. </li><li> Spülen Sie die Filter in Waschpuffer (WB) und waschen Sie es gründlich für 10 min bei RT. </li><li> Verwenden Sie ein Geiger Mueller-Detektor zur Überprüfung Restradioaktivität an den Filter Ecken. Wenn Hintergrundemission ist etwa 5 cps, fahren Sie mit Membranexposition. </li></ol> 12. Signalerkennung <ol><li> Setzen Sie den Filter auf Autoradiographie-Filme oder auf einem Molecular Imager-Bildschirm auf. Zeigen Signale, die von der fotografischen Verarbeitung oder Digital-Wandlung. </li><li> Analysieren Sie die Bandenintensität von engagierten Quantifizierungssoftware (ImageJ oder Optiquant). </li></ol> 13. Membran Stripping <ol><li> Um Primärsignale in 500 ml kochendes entkleiden Lösung zu entfernen, tauchen die Membran, Dann bei RT inkubieren für 1 min. Fahren Sie mit Roman (vor)-Hybridisierung oder den Filter bei -20 ° C. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Obwohl unsere Wertschätzung der Feingeist, durch die Verflechtung RNA reguliert die Neurogenese steigt kontinuierlich, die mechanistische Auswirkungen der RNA-basierten Schaltungen beeinflussen neuronalen Stammzellbiologie, die neuronale Differenzierung / Funktionsintegration, Entwicklung von neuronalen Erkrankungen und Krebserkrankungen bleiben unerforscht. Die Pflege solcher Netzwerke durch Reiche macht das Potenzial der genetischen Systemen wie Drosophila melanogaster Instrumental in unerforschte zelluläre...

RNA Biochemie hat spektakuläre Fortschritte in den vergangenen Jahren erlebt 1. Unser Verständnis von RNA-Potenzial in der Steuerung der Genexpression durch die Identifizierung von nicht-kodierenden leistungsstarke Ribo-Regulatoren 2 gesprengt, durch die Entdeckung von neuartigen RNA-basierte Regulationsmechanismen 3,4 und durch eine tiefere Charakterisierung der bereits bekannten posttranskriptionale Veranstaltungen 5. Alle zusammen haben diese Studien erlaubt RNA Biologie drastisch machen die Szene, zu einem wichtigen Forschungsthema in der aktuellen Wissenschaftslandschaft. Insbesondere in den letzten Jahren sind wir immer ein Gefühl von der allgegenwärtigen Auswirkungen der &quot;RNA-Welt&quot; auf der molekularen Neurobiologie 6, eines der dynamischsten Forschungsbereiche in der modernen Lebenswissenschaften. Im letzten Jahrzehnt des vergangenen Jahrhunderts hat sich die wissenschaftliche Gesamtszenario durch die Entdeckung der RNA-Interferenz 7,8 und der kleine regulatorische RNAs 9,10 revolutioniertinsbesondere im Bereich der Mikro-RNAs 11, endogen exprimiert kleinen nicht-kodierenden RNAs in der Kontrolle fast aller zellulären Funktionen als pleiotrope und kombiRegulaToren der Genexpression beteiligt ist. Fast 10 Jahre nach miRNA ersten Entdeckung in Caenorhabditis elegans durch Ambros und Ruvkun-Labors, wurde die Aufmerksamkeit erneut auf das Feld eingeschaltet, wenn eine hohe Zahl von miRNAs wurden in Drosophila und in menschlichen Zellen als auch 12-15 identifiziert. Seitdem dank vielseitiger transgene Ansätze, Drosophila melanogaster hat sich als wertvolle biologische Kontext für das Eintauchen in miRNA Biosynthese und Aktivität stand. Drosophila miRNAs haben unterschiedliche Funktionen in Insektenspezifische oder evolutionär konservierten Prozesse aufgedeckt, die sich vom Altern, den Stoffwechsel, Signalwege , Verhalten und, natürlich, die Neurogenese. Entlang dieser Richtung, die wir vor kurzem eine neuartige Verbindung 16 in die faszinierende Zusammenarbeitrrelation zwischen dem Master-Gen gcm / Gleiten und der RNA-Weg stattfindet. Die Fliege Transkriptionsfaktor Gcm / Glide 17-19 stellt ein einzigartiges Beispiel für das Schicksal der Zelle Determinante, die diktiert die Glia gegen neuronale Schicksal Wahl in multi fliegen neuronalen Vorläufer 20. Zwanzig Jahre lang Forschung zu diesem Thema hat deutlich unterstrichen, das Auftreten von mehreren überlappenden und Eingänge der Genregulation konvergierenden über GCM / gleiten 21-28, die zum Ausgleich der zarte Verhältnis zwischen neuronalen und Gliazellen während der Entwicklung des Nervensystems Kollegen erforderlich Schwellenwerte festzulegen. Wir entdeckten, dass die Verordnung über DMEL-miR279 Targeting stellt eine weitere Steuerungsebene einen Beitrag zur posttranskriptionale Feinabstimmung der GCM / 16 gleiten Ausdruck. Weltweit haben diese Forschungslinien erforderliche spezifische methodische Verbesserungen: entlang Jahren mehrere Technologien, die ursprünglich entwickelt, um zu analysieren traditional RNAs wurden zur Quantifizierung der kleine nicht kodierende RNAs wurden wie umgewandelt, wie RNAse-Schutzassays, cDNA-Arrays 29-31, Echtzeit-PCR-Verfahren 32-35 und Sequenzierung 36,37. Auf der anderen Seite hat Rekalibrierung technische Ansätze kontinuierlichen Fortschritte auf dem Gebiet gefördert. Northern Blot-Assay (NB, oder RNA-Gel-Blot-Test) stellt eine repräsentative Beispiel: Es wird weitgehend eingesetzt, um RNA-Akkumulation Profil, da sie gewährleistet, sowohl quantitative Expressionsniveau sowie Größenbestimmung. Allerdings ist die Eigen geringe Empfindlichkeit der Methode begrenzen, wenn es um den Nieder reichlich Genexpression Feinstimmer wie kurze RNAs angewendet werden kann, ist. Eine nachteilige Folge ist das Erfordernis großer Mengen an Gesamt-RNA, die nur schwer ihre Anwendung auf bestimmte biologische Proben ermöglicht. Aus solchen Gründen bestimmte NB Varianten für kleine RNAs Erkennung entwickelt worden 38-40: wir nutzten eine verbesserte NB procEDURE 41 (ENB, Enhanced Northern Blot), während die Aufklärung der oben genannten Wechselspiel zwischen DMEL-miR279 und GCM / gleiten. Dieses Verfahren beruht auf einer chemischen Vernetzungsschritt auf der Basis der Aktivität eines Carbodiimid-Derivats [1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid, EDC] die Nucleinsäure auf festen Trägern zu fixieren. Carbodiimid ist ein vielseitiges Vernetzer bekannt, die Bildung von Amidbindungen zwischen den aktivierten Carboxy oder Phosphat-und Amingruppen 42 katalysieren. Diese Eigenschaft kann durch die Mono-phosphorylierten 5&#39;-Hydroxylgruppe kovalent paar kleine RNAs ausgenutzt werden, um Gruppen an der Oberfläche der Nylonmembranen Amino ist. Die resultierende Befestigung Konfiguration erhöht die Zugänglichkeit des immobilisierten Nukleinsäure und wiederum die Effizienz der Sonden-Target-Hybridisierung, die in bemerkenswerter Detektionsverstärkung 43 führt. Die Technik übernimmt insbesondere relevance in Drosophila molekulare Studien, mit denen das Auftreten von neuen und unverwechselbaren Klassen von kleinen nicht-kodierenden RNAs 44 entsteht. Unter diesen rasiRNAs 45,46 bilden einen bestimmten Subtyp von Piwi-interacting RNAs (piRNAs 47), in sequenzspezifische Gen-Silencing beteiligt. Operative Details dieses Verfahrens werden im Folgenden vollständig beschrieben und visualisiert, bezogen auf die Analyse der miRNAs DMEL--miR279 und DMEL--miR286 und zum ersten Mal von einem rasiRNA, rasi4. Wir schoben, diese Methode, die es uns erlaubt enthüllt schlecht ausgedrückt Ziele von minimalen Mengen von RNA (weniger als 1 ug) Extreme.

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

Die letzten Jahrzehnte haben die Explosion der wissenschaftlichen Interesse rund um die Genexpression Kontrollmechanismen auf RNA-Ebene erlebt. Dieser Zweig der Molekularbiologie wurde stark durch die Entdeckung von nicht-kodierenden RNAs als Hauptakteure im post-Transkriptionsregulation angeheizt. Solch eine revolutionäre Perspektive wurde begleitet und durch die Entwicklung von leistungsfähigen Technologien für die Profilierung von kurzen RNAs Ausdruck ausgelöst, sowohl auf der Hochdurchsatz-Ebene (genomweiten Identifikation) oder als Single-Kandidat Analyse (steady state Anreicherung von spezifischen Arten). Obwohl mehrere state-of-art-Strategien derzeit zur Dosierung oder zu visualisieren, wie Flucht-Moleküle vorhanden sind, bleibt Northern Blot-Test die zuschussfähigen Ansatz in der Molekularbiologie für die sofortige und genaue Auswertung der RNA-Expression. Es ist ein erster Schritt in Richtung der Anwendung von anspruchsvoller, kostenintensive Technologien und in vielen Fällen bleibt eine bevorzugte Methode, um einfach Einblickein RNA Biologie. Hier Übersicht wir ein effizientes Protokoll (erweitert Northern Blot) zum Erfassen schwach exprimierte microRNAs (oder andere kleine regulatorische RNA-Spezies) von Drosophila melanogaster ganze Embryonen, manuell zerlegt Larven / adulten Geweben oder in vitro kultivierten Zellen. Eine sehr begrenzte Menge an RNA erforderlich ist, und die Verwendung von Material aus der Durchflusszytometrie isoliert Zellen können auch in Betracht gezogen.

Durch Befolgen der im Text beschrieben und schematisch in Abbildung 1 dargestellt Gesamtverfahren, untersuchten wir die Expression von RNAs kleine RNA-Komplex Proben unterschiedlicher Herkunft. In dem Experiment in Abbildung 1 dargestellt, wurde RNA aus Drosophila Schneider 2-Zellen durch Proteinase K-Extraktion, Integrität überprüft isoliert (optionaler Schritt: Denaturierung Agarose-Gel-Fraktionierung) und im Doppel geladen. Eine Hälfte des Gels wurde auf eine neutrale Me...

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Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Das Ziel dieser Publikation ist es, sichtbar zu machen und zu diskutieren, die operativen Schritte einer Enhanced Northern Blot-Protokoll auf RNA aus Drosophila melanogaster Embryonen entnommen, Zellen und Geweben. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für eine effiziente Erkennung von kleinen RNA-Spezies.

Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

23.8K Aufrufe.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire.  Das Ziel dieser Publikation ist es, sichtbar zu machen und zu diskutieren, die operativen Schritte einer Enhanced Northern Blot-Protokoll auf RNA aus Drosophila melanogaster Embryonen entnommen, Zellen und Geweben. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für eine effiziente Erkennung von kleinen RNA-Spezies. 

Serie: Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection der Larven ZNS von Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Forschung

Biologie

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Hochauflösendes Video Tracking von Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Präparation Oenocytes von Adult Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Ein nicht-invasives Haar Sampling-Technik, um High Quality DNA aus Elusive Kleinsäuger erhalten

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

Substrat Generation für Endonukleasen der CRISPR / Cas-Systeme

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Messung der Lebensdauer in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imaging Durch die Puppenhülle von<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Aufrechterhaltung eines<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Bevölkerung Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...