Name: enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster
Uploaded: 2014-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale unterstützt, das Centre National de la Recherche Scientifique, die Université de Strasbourg, das Hôpital de Strasbourg, der Verband pour la Recherche sur le Cancer, dem Institut National du Cancer, der Agence Nationale de la Recherche und dem Elsass. Pietro Laneve wurde von der Fondation la Recherche Médicale unterstützt gießen. Derzeit ist er ein Empfänger einer Istituto Italiano Tecnologia (IIT) Gemeinschaft. Publikationskosten werden von der Neurex Netzwerk unterstützt (TriNeuron - Programm Interreg IV Oberrhein)

1. Probenentnahme <ol><li> Lösen halbhaft Schneider 2-Zellen (1-5 × 10 6 Zellen im Durchschnitt), und durch Pipettieren geerntet sie durch Zentrifugation (100 × g für 1 min). Im Falle von in vitro kultivierten adhärenten Zellen, trypsinize sie unter Standardbedingungen oder direkt sammeln sie von den Platten in eine geeignete Menge an RNA-Extraktionsreagenz, mit Hilfe eines Zellschabers. </li><li> Für Embryo-Entnahme, wachsen Drosophila-Stämmen in Flugkäfigen und lassen Embryonen sammeln sich auf Legeplatten. Wischen Embryonen durch einen Pinsel in destilliertem Wasser (dH 2 O), entsorgen Trümmer durch Sieb-Filterung, spülen und erholen Embryonen in einer Ampulle 48. </li><li> Als alternative Technik, manuell zu sezieren Gewebe / Organe. Isolieren Hoden (ein Präferenzsystem für piRNA Analyse) von Drosophila Leib in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) unter einem Stereomikroskop (Vergrßerung 20X) unter Verwendung von Nadeln oder Dissektion Zange gegenin Sullivan et al 49 ualized. </li><li> Stößel homogenisieren Proben auf der Sucht nach 0,5 Volumen RNA-Extraktion Reagenz. </li></ol> 2. RNA-Extraktion / Analyse <ol><li> Den Anweisungen des Herstellers durchführen RNA-Isolierung durch kommerzielle Reagenzien. VORSICHT! RNA Extraktionsmittel sind in der Regel toxisch und ätzend. Alternativ Anwendung einer Proteinase K-basiertes Protokoll für die RNA-Isolierung 50, wie folgt: <ol><li> Verdünnen Sie die Proben in 400 ul Stop-Mix und Inkubation bei RT für 15 min. </li><li> Recover wasserlöslichen Komponenten durch Standard Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol und Chloroform-Extraktionen und Ethanol (EtOH) Fällung / Waschen. Luft trocknen die Proben und resuspendieren in Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelten doppelt destilliertem (dd) H 2 O. </li></ol></li><li> Beurteilen RNA-Konzentration durch UV-photometrische Messung. Auch dafür sorgen, das RNA-Reinheit hoch, in der Nähe von 2.0 ist, based auf der A 260 / A 280 Lesung. </li><li> Überprüfen RNA-Präparation auf denaturierenden Agarose-Gel wie folgt: <ol><li> In einen sauberen Becher löst man 1,2 g Agarose in 82 ml DEPC-ddH 2 O, unter kontinuierlichem Rühren. Kochen, bis vollständig gelöst ist. </li><li> Lassen Sie das Gel Lösung abkühlen; wenn die Temperatur 60 ° C erreicht 10 ml 10X 4-Morpholinpropansulfonsäure hinzufügen (MOPS) Puffer auf 1X Endkonzentration (FC) und 8 ml 37% Formaldehyd zu 3% FC. VORSICHT! Formaldehyd ist krebserregend. </li><li> Gießen Sie das Gel in eine horizontale Elektrophorese-Zelle. Lassen Sie das Gel unter einer Haube für mindestens 1 Stunde fest werden. Nach der Erstarrung, tauchen das Gel in MOPS 1X. </li><li> Aliquoten 2 ug RNA-Probe und 1 ug Ladder (verwenden Sie ein RNA-Marker, wenn genaue Auswertung gewünscht wird). Hinzufügen 3 Volumen Agarose-Ladefarbstoff (ALD), um RNA und Leiter. Wärme bei 70 ° C für 5 min und sofort auf Eis kühlen. CAUTION! Inhalt der ALD (Ethidiumbromid und Formamid, siehe Materialien) sind mutagen und korrosiven sind. </li><li> Legen Sie die Proben und führen Sie das Gel bei 50 V für ca. 1 h mit gelegentlichen Puffer Recycling. Überprüfen Sie die RNA durch UV-Fraktionierung Muster Visualisierung oder Gel Imaging. Erkennen diskrete Banden, die 28S-und 18S-rRNAs und tRNAs (siehe Abbildung 1). </li></ol></li><li> Gehen Sie nach Nord Assay oder speichern RNA bei -80 ° C. </li></ol> 3. Denaturierung Acrylamid-Gel Vorbereitung <ol><li> Verwenden Sie eine kleine vertikale Elektrophorese-Apparat für diese Fraktionierung Schritt (Plattengröße ca. 8 cm x 9 cm, Kamm Dicke 0,75 mm). </li><li> Montieren Sie saubere Gläser zusammen in einem Gussrahmen. </li><li> Herstellung von 10 ml 10% Acrylamid / Bis-Acrylamid (19: 1)-Lösung in MOPS-1X, 7 M Harnstoff. Unmittelbar vor dem Gießen werden 100 ul 10% Ammoniumpersulfat und 10 ul TEMED und schnell mischen Sie die Lösung. VORSICHT! Acrylamid ist neurotoxischen und krebserregend. </li><li> Gießen Sie das Gel zwischen Glasplatten und legen Sie die gut Kamm vorsichtig, um Blasen zu vermeiden. Lassen Sie das Gel polymerisiert bei Raumtemperatur mindestens 45 min vor der Verwendung. Alternativ speichern Sie das Gel O / N, in Wasser getränkten Filterpapiere eingewickelt und in Frischhaltefolie versiegelt. </li></ol> 4. Probenvorbereitung <ol><li> Aliquot 0,5-20 ug Gesamt-RNA pro Probe. Wenn Volumen 3-4 ul überschreitet, Vakuum trocknen die Probe. </li><li> Für Größenbestimmung, führen Sie einen aliquoten (20-30 cps) von radioaktiv markiertem Low-Range-Leiter parallel zu Proben, als Marker (siehe Abschnitt 4.3 und 4.4 für Vorbereitung). Behandeln Sie es parallel zu Proben, wie in Schritt 4.5 beschrieben. </li><li> Ladder: eine Phosphatvorwärtsreaktion unter Verwendung von 0,1 ug eines 10 bp-Schritt-Leiter eingestellt. Bei 37 ° C für 30 Minuten und stoppt die Reaktion durch Zugabe von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 20 mM FC. </li><li> Reinige durch EtOH Fällung / Waschen, trocknen undresuspendieren in ddH 2 O (etwa 100 ul). VORSICHT! 32 P ist eine radioaktive Quelle. </li><li> Zu jeder Probe das gleiche Volumen von Acrylamid blauen Farbstoff (ABD). Denaturieren durch Erhitzen bei 80 ° C für 5 min auf Eis und kühlen, bis Belastung. VORSICHT! Formamid (Gehalt in ABD) ist ätzend. </li></ol> 5. Die elektrophoretische Fraktionierung <ol><li> Entfernen Sie die Glasplatten aus der Casting-Unterstützung und richtig montieren sie in der Elektrophorese-Zelle. Füllen inneren und äußeren Kammer mit ausreichender Laufpuffer (RB). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Kamm und Vorlauf das Gel bei 200 V für 10 min. Vor dem Laden der Proben, abzuwaschen Harnstoffablagerungen aus den Vertiefungen durch Spritzen einige RB durch eine Spritze. </li><li> Verwenden Sie flache Spitzen sorgfältig stratify Proben aus Schritt 4.5 an der Unterseite von jedem gut. Überprüfen Anode und Kathode Verbindungen zu umgekehrten Lauf zu vermeiden. Nachdem die Proben in das Gel bei 100 V für 5 min, il zu erhöhen, um die Spannung 200 V. </li><li> Für eine Fraktionierung Länge von etwa 7 cm, einer 45 min-Dauer ausreichend. Vermeiden Bromphenolblau (a Tracking Pigment in ABD), um das Gel überlaufen. </li><li> Visualisieren auf-Gel-der fraktionierten lange RNAs durch Ethidiumbromid (EtBr)-Färbung, als optionaler Schritt: <ol><li> Schneiden Sie 2 cm von der Spitze des Gels und die Scheibe in ddH 2 O. kurz spülen </li><li> Inkubieren Sie die Gel-Scheibe bei RT für 15 min unter leichtem shacking in RB, EtBr 0,5 ug / ml FC. </li><li> Entfärben des Gels für 15 min in RB, visualisieren lange rRNAs durch UV-Bestrahlung oder Gel-Bildgebung. Überprüfen Sie für die RNA-Beladung und Qualität (siehe Abbildung 1, Tafel 7). VORSICHT! Ethidiumbromid ist mutagen. </li></ol></li><li> Unterdessen gehen Lösch den unteren Teil des Gels, die kleine RNA-Spezies. </li></ol> 6. Gel-Blotting <ol><li> Schneiden Sie 6 Stück Löschpapier, um die Blotting Bereich passen und eine äquivalente Stück uncharged Nylon-Membran. Dämpfen Papierbögen, Membran und 2 Schreibunterlagen in RB. Stellen Sie sicher, dass Sie die Pads vollständig genießen, indem Sie wiederholt drückte sie in RB. </li><li> Entfernen Sie das Gel aus dem Gerät, und öffnen Sie die Gläser durch Mittel einer Spachtel. Verwenden Sie ein sauberes Schneider, um die Vertiefungen zu entfernen. Legen Sie ein Blatt feuchten Whatman-Papier auf dem Gel und heben es auf. </li><li> Das Nylonmembran auf die freie Fläche des Gels. Markieren eine Ecke, um die Filter nach Probenbeladung zu orientieren. Füllen Sie das &quot;Sandwich&quot; (3 Papierstücke auf jeder Seite). Wirf einen Kunststoffstab auf dem Blot Oberfläche, um mögliche Luftblasen zu entfernen. </li><li> Legen Sie den Fleck zwischen zwei Schreibunterlagen und dann in der Blotting-Kassette. Bauen Sie die Kassette in den Löschmodul, füllen die Kammer mit RB und kontrollieren die korrekte Ausrichtung (Nylonmembran muss zwischen dem Gel und der positive Terminus zu bleiben). </li><li> Transfer bei 20 V für 20 min. Hinweis: Um homogenen Bedingungen zu gewährleisten, nach 10 Minuten öffnen Sie das Löschmodul und rOtate das Sandwich um 180 ° vor dem Abschluss der Übertragung. </li></ol> 7. Membran Vernetzung <ol><li> Bereiten Sie 6 ml frischem Vernetzungslösung (XLS). Tränken Sie ein 10 cm x 10 cm (größer als Nylonmembran) Stück Löschpapier mit XLS. VORSICHT! HCl (eine Komponente von XLS) ist stark ätzend. </li><li> Blot die Demontage und legen Sie die Membran auf dem nassen 3MM Filterpapier. Hinweis: RNA muss nicht in direktem Kontakt mit der gesättigten Papier. Setzen Sie den Filter und Papier zwischen zwei Glasplatten und wickeln in Saran-Wrap. </li><li> Erwärmen die Membran bei 60 ° C für 2 Stunden, gefolgt von einer ddH 2 O Waschen. Lagerung bei -20 ° C oder fahren Sie mit der Hybridisierung. </li></ol> 8. Membran Prähybridisierung <ol><li> Wenn RNA-Beladung überprüft wurde (optionaler Schritt 5.5), direkt an der Hybridisierung fortfahren. Oder aber, schneiden Sie 1 cm vom Anfang des Nylon-Filter, um die Sondenquer hybridizatio vermeidenns bis fraktionierten lange RNAs. </li><li> Vorwärmkammer 10 ml Hybridisierungslösung (HS) bei 37 ° C aufweist. Denaturieren 1 mg Lachssperma bei 95 ° C für 5 min, cool auf Eis und in den HS. </li><li> Den Filter in HS Inkubation bei 37 ° C für mindestens 1 h unter Rotation in einem Hybridisierungsofen. Überprüfen Sie, dass die RNA-Seite der Filterflächen HS. </li></ol> 9. Sondensynthese <ol><li> Ein Phosphat Vorwärtsreaktion eingestellt auf 10 pmol spezifischer Antisense-Oligonukleotid, wie in 4.3 beschrieben. </li><li> Mit 5 Volumina von Tris-EDTA-NaCl (TEN)-Puffer, um die Reaktion und Reinigung des markierten Primers von nicht eingebauten Nukleotiden durch Gel-Ausschluß-Chromatographie auf G-25 Sephadex-Säulen (oder auch von EtOH-Fällung). Sonde Aktivität kann durch Flüssig-Szintillationszählers beurteilt. </li></ol> 10. Membran Hybridisierung <ol><li> Ersetzen Sie die HS mit einem frischen 10 ml Aliquot (vorbereitet und ergänzt, wie oben beschrieben). Erhitzen Sie die Sonde an95 ° C für 10 min, cool auf Eis und in den neuen HS. Inkubieren des Filters bei 37 ° C auf. </li></ol> 11. Waschen der Membran <ol><li> Wiederherstellen der Hybridisierungslösung und bei -20 ° C in einer Radioaktivität-Abschirmung-Box. </li><li> Spülen Sie die Filter in Waschpuffer (WB) und waschen Sie es gründlich für 10 min bei RT. </li><li> Verwenden Sie ein Geiger Mueller-Detektor zur Überprüfung Restradioaktivität an den Filter Ecken. Wenn Hintergrundemission ist etwa 5 cps, fahren Sie mit Membranexposition. </li></ol> 12. Signalerkennung <ol><li> Setzen Sie den Filter auf Autoradiographie-Filme oder auf einem Molecular Imager-Bildschirm auf. Zeigen Signale, die von der fotografischen Verarbeitung oder Digital-Wandlung. </li><li> Analysieren Sie die Bandenintensität von engagierten Quantifizierungssoftware (ImageJ oder Optiquant). </li></ol> 13. Membran Stripping <ol><li> Um Primärsignale in 500 ml kochendes entkleiden Lösung zu entfernen, tauchen die Membran, Dann bei RT inkubieren für 1 min. Fahren Sie mit Roman (vor)-Hybridisierung oder den Filter bei -20 ° C. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Obwohl unsere Wertschätzung der Feingeist, durch die Verflechtung RNA reguliert die Neurogenese steigt kontinuierlich, die mechanistische Auswirkungen der RNA-basierten Schaltungen beeinflussen neuronalen Stammzellbiologie, die neuronale Differenzierung / Funktionsintegration, Entwicklung von neuronalen Erkrankungen und Krebserkrankungen bleiben unerforscht. Die Pflege solcher Netzwerke durch Reiche macht das Potenzial der genetischen Systemen wie Drosophila melanogaster Instrumental in unerforschte zelluläre...

RNA Biochemie hat spektakuläre Fortschritte in den vergangenen Jahren erlebt 1. Unser Verständnis von RNA-Potenzial in der Steuerung der Genexpression durch die Identifizierung von nicht-kodierenden leistungsstarke Ribo-Regulatoren 2 gesprengt, durch die Entdeckung von neuartigen RNA-basierte Regulationsmechanismen 3,4 und durch eine tiefere Charakterisierung der bereits bekannten posttranskriptionale Veranstaltungen 5. Alle zusammen haben diese Studien erlaubt RNA Biologie drastisch machen die Szene, zu einem wichtigen Forschungsthema in der aktuellen Wissenschaftslandschaft. Insbesondere in den letzten Jahren sind wir immer ein Gefühl von der allgegenwärtigen Auswirkungen der &quot;RNA-Welt&quot; auf der molekularen Neurobiologie 6, eines der dynamischsten Forschungsbereiche in der modernen Lebenswissenschaften. Im letzten Jahrzehnt des vergangenen Jahrhunderts hat sich die wissenschaftliche Gesamtszenario durch die Entdeckung der RNA-Interferenz 7,8 und der kleine regulatorische RNAs 9,10 revolutioniertinsbesondere im Bereich der Mikro-RNAs 11, endogen exprimiert kleinen nicht-kodierenden RNAs in der Kontrolle fast aller zellulären Funktionen als pleiotrope und kombiRegulaToren der Genexpression beteiligt ist. Fast 10 Jahre nach miRNA ersten Entdeckung in Caenorhabditis elegans durch Ambros und Ruvkun-Labors, wurde die Aufmerksamkeit erneut auf das Feld eingeschaltet, wenn eine hohe Zahl von miRNAs wurden in Drosophila und in menschlichen Zellen als auch 12-15 identifiziert. Seitdem dank vielseitiger transgene Ansätze, Drosophila melanogaster hat sich als wertvolle biologische Kontext für das Eintauchen in miRNA Biosynthese und Aktivität stand. Drosophila miRNAs haben unterschiedliche Funktionen in Insektenspezifische oder evolutionär konservierten Prozesse aufgedeckt, die sich vom Altern, den Stoffwechsel, Signalwege , Verhalten und, natürlich, die Neurogenese. Entlang dieser Richtung, die wir vor kurzem eine neuartige Verbindung 16 in die faszinierende Zusammenarbeitrrelation zwischen dem Master-Gen gcm / Gleiten und der RNA-Weg stattfindet. Die Fliege Transkriptionsfaktor Gcm / Glide 17-19 stellt ein einzigartiges Beispiel für das Schicksal der Zelle Determinante, die diktiert die Glia gegen neuronale Schicksal Wahl in multi fliegen neuronalen Vorläufer 20. Zwanzig Jahre lang Forschung zu diesem Thema hat deutlich unterstrichen, das Auftreten von mehreren überlappenden und Eingänge der Genregulation konvergierenden über GCM / gleiten 21-28, die zum Ausgleich der zarte Verhältnis zwischen neuronalen und Gliazellen während der Entwicklung des Nervensystems Kollegen erforderlich Schwellenwerte festzulegen. Wir entdeckten, dass die Verordnung über DMEL-miR279 Targeting stellt eine weitere Steuerungsebene einen Beitrag zur posttranskriptionale Feinabstimmung der GCM / 16 gleiten Ausdruck. Weltweit haben diese Forschungslinien erforderliche spezifische methodische Verbesserungen: entlang Jahren mehrere Technologien, die ursprünglich entwickelt, um zu analysieren traditional RNAs wurden zur Quantifizierung der kleine nicht kodierende RNAs wurden wie umgewandelt, wie RNAse-Schutzassays, cDNA-Arrays 29-31, Echtzeit-PCR-Verfahren 32-35 und Sequenzierung 36,37. Auf der anderen Seite hat Rekalibrierung technische Ansätze kontinuierlichen Fortschritte auf dem Gebiet gefördert. Northern Blot-Assay (NB, oder RNA-Gel-Blot-Test) stellt eine repräsentative Beispiel: Es wird weitgehend eingesetzt, um RNA-Akkumulation Profil, da sie gewährleistet, sowohl quantitative Expressionsniveau sowie Größenbestimmung. Allerdings ist die Eigen geringe Empfindlichkeit der Methode begrenzen, wenn es um den Nieder reichlich Genexpression Feinstimmer wie kurze RNAs angewendet werden kann, ist. Eine nachteilige Folge ist das Erfordernis großer Mengen an Gesamt-RNA, die nur schwer ihre Anwendung auf bestimmte biologische Proben ermöglicht. Aus solchen Gründen bestimmte NB Varianten für kleine RNAs Erkennung entwickelt worden 38-40: wir nutzten eine verbesserte NB procEDURE 41 (ENB, Enhanced Northern Blot), während die Aufklärung der oben genannten Wechselspiel zwischen DMEL-miR279 und GCM / gleiten. Dieses Verfahren beruht auf einer chemischen Vernetzungsschritt auf der Basis der Aktivität eines Carbodiimid-Derivats [1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid, EDC] die Nucleinsäure auf festen Trägern zu fixieren. Carbodiimid ist ein vielseitiges Vernetzer bekannt, die Bildung von Amidbindungen zwischen den aktivierten Carboxy oder Phosphat-und Amingruppen 42 katalysieren. Diese Eigenschaft kann durch die Mono-phosphorylierten 5&#39;-Hydroxylgruppe kovalent paar kleine RNAs ausgenutzt werden, um Gruppen an der Oberfläche der Nylonmembranen Amino ist. Die resultierende Befestigung Konfiguration erhöht die Zugänglichkeit des immobilisierten Nukleinsäure und wiederum die Effizienz der Sonden-Target-Hybridisierung, die in bemerkenswerter Detektionsverstärkung 43 führt. Die Technik übernimmt insbesondere relevance in Drosophila molekulare Studien, mit denen das Auftreten von neuen und unverwechselbaren Klassen von kleinen nicht-kodierenden RNAs 44 entsteht. Unter diesen rasiRNAs 45,46 bilden einen bestimmten Subtyp von Piwi-interacting RNAs (piRNAs 47), in sequenzspezifische Gen-Silencing beteiligt. Operative Details dieses Verfahrens werden im Folgenden vollständig beschrieben und visualisiert, bezogen auf die Analyse der miRNAs DMEL--miR279 und DMEL--miR286 und zum ersten Mal von einem rasiRNA, rasi4. Wir schoben, diese Methode, die es uns erlaubt enthüllt schlecht ausgedrückt Ziele von minimalen Mengen von RNA (weniger als 1 ug) Extreme.

<table><tbody><tr><td>FINAL COMPOSITION/NAME</td><td>COMPANY</td><td>CATALOGUE (Stock)</td><td>COMMENTS</td></tr><tr><td colspan="4">GENERAL REQUIREMENT</td></tr><tr><td>Centrifuge, 5418</td><td>Eppendorf</td><td>5418 000.017</td><td></td></tr><tr><td>Decontaminant, RNase Away</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83931</td><td>Apply on glass/plasticware, wipe and rinse</td></tr><tr><td>RNase inhibitor, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>Hazardous //// 1609-47-8</td></tr><tr><td colspan="4">SAMPLE PREPARATION</td></tr><tr><td>Stereo Microscope, M60</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>137 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2.7 mM KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>7447-40-7&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td>7558-79-4&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.8 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>7778-77-0&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">RNA EXTRACTION/ANALYSIS</td></tr><tr><td>UV-Vis Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Gel Imager, ChemiDoc XRS+</td><td>Biorad</td><td>170-8265</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT</td><td>BioRad</td><td>170-4487EDU</td><td></td></tr><tr><td>RNA extraction reagent, TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>PCA (25:24:1), 1:1 for extraction</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td>136112-00-0</td></tr><tr><td>Chlorophorm, 1:1 for extraction</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>67-66-3&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59844</td><td>64-17-5&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gene Ruler 1Kb DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>Stop Mix</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM NaOAc, pH 5.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>127-09-3</td></tr><tr><td>1x RSB Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2% sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>Never cool down SDS to avoid&amp;nbsp; precipitation //// 151-21-3</td></tr><tr><td>2 mg/ml Proteinase K</td><td>Roche Applied Science</td><td>0-3115828001</td><td>EC 3.4.21.64 9</td></tr><tr><td>10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Tris-Cl, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>1185-53-1&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>30 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>7786-30-3</td></tr><tr><td>Denaturing Agarose Gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.2% Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2</td></tr><tr><td>10X MOPS Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M MOPS sodium salt, pH 7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9381</td><td>Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7</td></tr><tr><td>Agarose Loading Dye</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x MOPS Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3% formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Hazardous //// 50-00-0</td></tr><tr><td>50% formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670</td><td>Hazardous //// 75-12-7</td></tr><tr><td>Ethidium bromide (EtBr) 30 &amp;mu;g/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Hazardous //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>Bromophenol blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>115-39-9&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">SMALL RNA FRACTIONATION</td></tr><tr><td>Flat gel loading tips</td><td>Life Technologies</td><td>LC1002</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Concentrator</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>DNA120</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>Denaturing Acrylamide Gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3449</td><td>Hazardous. Let the gel polymerize for 45 min before use</td></tr><tr><td>1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7 M urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6504</td><td>57-13-6</td></tr><tr><td>0.1% ammonium persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215589</td><td>7727-54-0&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.1% TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td>110-18-9</td></tr><tr><td>Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1211</td><td>Label 0.1 &amp;mu;g, as described in the &quot;probe labeling&quot; reaction</td></tr><tr><td>Acrylamide Blue Dye&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670</td><td>Hazardous //// 75-12-7</td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>115-39-9&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Running Buffer (RB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x MOPS Buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alternative RB: 1x TBE Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x TBE Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5X TBE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>445 mM Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>445 mM boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td>10043-35-3</td></tr><tr><td>20 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gel Staining Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide 0.5 &amp;mu;g/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Hazardous //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>1x RB</td><td></td><td></td><td>Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr</td></tr><tr><td colspan="4">BLOTTING</td></tr><tr><td>3MM Whatman paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Nylon Membrane, Hybond NX</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>RPN203T</td><td>Photosensitive</td></tr><tr><td colspan="4">CROSSLINKING</td></tr><tr><td>Crosslinking Solution (XLS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% 1-methylimidazole (v/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>336092</td><td>Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7</td></tr><tr><td>12.5 mM HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>Hazardous //// 7647-01-0</td></tr><tr><td>3.1% EDC (w/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3450</td><td>25952-53-8&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">(PRE)-HYBRIDIZATION</td></tr><tr><td>Liquid Scintillation Counter&amp;nbsp;</td><td>Beckmann</td><td>LS 6500</td><td></td></tr><tr><td>Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>rasi4 anti-sense probe</td><td></td><td></td><td>5&#039; CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3&#039;</td></tr><tr><td>5s-rRNA anti-sense probe</td><td></td><td></td><td>5&#039;-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3&#039;</td></tr><tr><td>Dmel-miR279 anti-sense probe</td><td></td><td></td><td>5&#039;-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3&#039;</td></tr><tr><td>Dmel-miR286 anti-sense probe</td><td></td><td></td><td>5&#039;-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3&#039;</td></tr><tr><td>Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>(Pre)-Hybridization Solution (HS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>151-21-3&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5x Denhardt&#039;s Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20X SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.6 M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.2 M sodium phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td>7601-54-9&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>20 mM EDTA (pH 8.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>&amp;nbsp;60-00-4&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50x Denhardt&#039;s Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% Ficoll 400 (w/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>26873-85-8</td></tr><tr><td>1% Polyvinylpyrrolidone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td>9003-39-8</td></tr><tr><td>1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>9048-46-8&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1X TEN Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl (pH 8.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 mM EDTA (pH 8.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Probe Labelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.4 &amp;mu;M oligonucleotide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 &amp;mu;l Ci/&amp;mu;l [&amp;gamma;-32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002A</td><td>Hazardous //// 51963-61-2</td></tr><tr><td>1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer</td><td>Biolabs</td><td>B0201</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/&amp;mu;l</td><td>Biolabs</td><td>M0201</td><td>EC 2.7.1.78</td></tr><tr><td colspan="4">WASHING</td></tr><tr><td>Geiger Mueller Detectors</td><td>Canberra Industries</td><td>MCB2/CPS &amp;ndash; EM77021</td><td></td></tr><tr><td>Washing Buffer (WB), 2x SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stringent Washing Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2x SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x SSPE, 0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2x SSPE, 0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">SIGNAL DETECTION</td></tr><tr><td>PharosFX Plus System</td><td>Biorad</td><td>170-9460</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>Freely available</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantity One</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-ray films , BioMax XAR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5888</td><td>Photosensitive</td></tr><tr><td>Developer for X-ray films</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7042</td><td></td></tr><tr><td>Fixer for X-ray films</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7167</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">STRIPPING</td></tr><tr><td>Stripping Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 8.8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.1% SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3</td></tr></tbody></table>

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

Die letzten Jahrzehnte haben die Explosion der wissenschaftlichen Interesse rund um die Genexpression Kontrollmechanismen auf RNA-Ebene erlebt. Dieser Zweig der Molekularbiologie wurde stark durch die Entdeckung von nicht-kodierenden RNAs als Hauptakteure im post-Transkriptionsregulation angeheizt. Solch eine revolutionäre Perspektive wurde begleitet und durch die Entwicklung von leistungsfähigen Technologien für die Profilierung von kurzen RNAs Ausdruck ausgelöst, sowohl auf der Hochdurchsatz-Ebene (genomweiten Identifikation) oder als Single-Kandidat Analyse (steady state Anreicherung von spezifischen Arten). Obwohl mehrere state-of-art-Strategien derzeit zur Dosierung oder zu visualisieren, wie Flucht-Moleküle vorhanden sind, bleibt Northern Blot-Test die zuschussfähigen Ansatz in der Molekularbiologie für die sofortige und genaue Auswertung der RNA-Expression. Es ist ein erster Schritt in Richtung der Anwendung von anspruchsvoller, kostenintensive Technologien und in vielen Fällen bleibt eine bevorzugte Methode, um einfach Einblickein RNA Biologie. Hier Übersicht wir ein effizientes Protokoll (erweitert Northern Blot) zum Erfassen schwach exprimierte microRNAs (oder andere kleine regulatorische RNA-Spezies) von Drosophila melanogaster ganze Embryonen, manuell zerlegt Larven / adulten Geweben oder in vitro kultivierten Zellen. Eine sehr begrenzte Menge an RNA erforderlich ist, und die Verwendung von Material aus der Durchflusszytometrie isoliert Zellen können auch in Betracht gezogen.

Durch Befolgen der im Text beschrieben und schematisch in Abbildung 1 dargestellt Gesamtverfahren, untersuchten wir die Expression von RNAs kleine RNA-Komplex Proben unterschiedlicher Herkunft. In dem Experiment in Abbildung 1 dargestellt, wurde RNA aus Drosophila Schneider 2-Zellen durch Proteinase K-Extraktion, Integrität überprüft isoliert (optionaler Schritt: Denaturierung Agarose-Gel-Fraktionierung) und im Doppel geladen. Eine Hälfte des Gels wurde auf eine neutrale Me...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Das Ziel dieser Publikation ist es, sichtbar zu machen und zu diskutieren, die operativen Schritte einer Enhanced Northern Blot-Protokoll auf RNA aus Drosophila melanogaster Embryonen entnommen, Zellen und Geweben. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für eine effiziente Erkennung von kleinen RNA-Spezies.

Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

enhanced-northern-blot-detection-small-rna-species-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

24.0K Aufrufe.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire.  Das Ziel dieser Publikation ist es, sichtbar zu machen und zu diskutieren, die operativen Schritte einer Enhanced Northern Blot-Protokoll auf RNA aus Drosophila melanogaster Embryonen entnommen, Zellen und Geweben. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für eine effiziente Erkennung von kleinen RNA-Spezies. 

Serie: Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Forschung

Genetik

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Biochemie

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Biologie

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences that encode rRNAs, composing regions called ribosomal DNA (rDNA) loci. Many organisms' genomes contain more than one rDNA locus distributed across different chromosomes, and rRNA may be transcribed from multiple rDNA loci or only a single locus. Changes in rRNA transcription sources often indicate ribosomal distress. However, the homogeneity of rRNA obstructs distinguishing if rRNA is transcribed from multiple or a single rDNA locus. Here, we describe a method that uses single nucleotide polymorphism-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) to distinguish rRNA transcription between Drosophila melanogaster rDNA loci on the X and Y chromosomes. This method leverages locus-specific rRNA variants to enable easy detection of the source of rRNA transcription with single-cell resolution. This assay can be applied to any Drosophila cell type and may be adapted for use in other systems.

The protocol describes single nucleotide polymorphisms-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) method to distinguish ribosomal RNA transcripts derived from the X or Y chromosome ribosomal DNA locus in Drosophila melanogaster.

Einzelnukleotid-Polymorphismus-sensitiver FISH-Nachweis der lokusspezifischen ribosomalen RNA-Transkription in Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi-Interferenz durch dsRNA Injektion in Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Nachweis und Quantifizierung einzelner mRNA-Moleküle in Drosophila

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study muscle biology. The combination of both Drosophila genetics and advanced omics approaches led to the identification of key conserved molecules that regulate muscle morphogenesis and regeneration. However, the transcriptional dynamics of these molecules and the spatial distribution of their messenger RNA within the syncytia cannot be assessed by conventional methods. Here we optimized an existing single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) method to enable the detection and quantification of individual mRNA molecules within adult flight muscles and their muscle stem cells. As a proof of concept, we have analyzed the mRNA expression and distribution of two evolutionary conserved transcription factors, Mef2 and Zfh1/Zeb. We show that this method can efficiently detect and quantify single mRNA molecules for both transcripts in the muscle precursor cells, adult muscles, and muscle stem cells.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der räumlichen Verteilung von mRNA im Muskelgewebe von Drosophila 

Drosophila is a well-established model for studying key molecules that regulate myogenesis. However, current methods are insufficient to determine mRNA transcriptional dynamics and spatial distribution within syncytia. To address this limitation, we optimized an RNA fluorescence in situ hybridization method allowing the detection and quantification of mRNAs at a single-molecule scale.

Untersuchung der Transkriptionsdynamik von Muskeln auf Einzelmolekülskalen in Drosophila

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study ...

Entwicklungsbiologie

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting

Einzelnukleotid-Polymorphismus-sensitiver FISH-Nachweis der lokusspezifischen ribosomalen RNA-Transkription in Drosophila melanogaster

RNAi-Interferenz durch dsRNA Injektion in Drosophila Embryos

Untersuchung der Transkriptionsdynamik von Muskeln auf Einzelmolekülskalen in Drosophila

Untersuchung der Transkriptionsdynamik von Muskeln auf Einzelmolekülskalen in Drosophila

Untersuchung der Transkriptionsdynamik von Muskeln auf Einzelmolekülskalen in Drosophila

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

Whole Berg RNA Fluorescent