Wir möchten Amsale Belay für ihre Unterstützung danken Dreharbeiten zu diesem Video Artikel. Diese Arbeit wurde von CIHR, NSERC und CRC gewährt JDL finanziert.

Teil 1. Filet Vorbereitung der erwachsenen Drosophila Bauch. Das beschriebene Verfahren unmittelbar unterhalb bereitet den Bauch für die anschließende Entfernung des oenocytes (siehe Teil 2 des Protokolls). Das gleiche Verfahren kann auch zur Herstellung der anderen Gewebe an der inneren Oberfläche der Kutikula, einschließlich der dorsalen Gefäß (dh Herz) und fetten Körper verwendet werden. Beachten Sie, dass in der Video-Artikel der oenocyte Dissektionstechnik auf einen Erwachsenen-Wildtyp (Canton-S) männliche Fliege, 6 Tage alt ist bewiesen. Identische Techniken können verwendet werden, um die oenocytes von weiblichen Fliegen zu entfernen. Der Bauch Filet Vorbereitung dauert ca. 5 Minuten in Anspruch. Vor Beginn ist es wichtig, bereit mehreren feinen Sezierung Pins (siehe unten und Teil 2) und eine Dissektion Nadel (siehe Teil 2). Kommerziell erhältliche Dissektion Nadeln sind oft zu groß für dieses Protokoll, so müssen wir unsere eigene Herstellung im Labor entnommen. Zum Erstellen der Dissektion Nadel-, Wolfram-Draht (0,005 &quot;) wird zunächst durch die Welle der Injektionsnadel (27G-, Aluminium-Nabe) eingefädelt. Fädeln Sie den Draht durch die Spitze der Injektionsnadel, so dass es von der Nabe entsteht. Crimp ragende Drahtende von der Nabe;. diese den Draht verhindert das Herausziehen der Injektionsnadel Next, schneiden Sie den Draht am anderen Ende der Sicke, so dass mehrere Millimeter (~ 3-4mm) aus Draht von der Spitze der Injektionsnadel ragen Passing. die Spitze ausgesetzt Wolfram durch eine Flamme wird der Draht zu einem sehr feinen Spitze zu schärfen. Ein Einweg-5ml Plastikpipette, wenn sie in die Nabe der Injektionsnadel verkeilt fungiert als praktischer Griff für diese dissection tool. Die feinen Sezierung Stifte in einer ähnlichen gemacht werden Weise. Nach dem Schärfen, fassen Sie die Spitze der Leiter fest mit einer Pinzette, um es von Bewegung zu verhindern und einen Schnitt von ca. 3 mm von der Spitze des kleinen Dissektion PIN freigibt. Sie vorsichtig, um Pin davon entfernt, aus den Händen schleuderte verhindern der Zange. Um Filet bereiten die erwachsenen Drosophila Bauch: <ol><li> Sichern Sie die fliegen, um die Zerlegung Platte (Sylgard; Dow-Corning), indem Sie einen feinen Sezierung pin obwohl der Thorax. </li><li> Entfernen Sie die Beine und Flügel der Fliege. Beim Entfernen der hinteren Reihe von Beinen, schaffen eine Öffnung in der Kutikula an der Stelle, knapp vor dem Brustkorb Unterleib trifft. Diese Öffnung wird später als Access Point für ein Einschnitt entlang der ventralen Oberfläche des Bauches verwendet werden (siehe Schritt 5) </li><li> Sichern Sie den Bauch der Fliege statt, indem eine zweite Sektion Stift durch die Genital-Segment. </li><li> Decken Sie die Fliege mit gekühltem Shields und Sang M3 Insekten Medium (Sigma). Entfernen Sie alle Luftblasen, indem Sie ihn mit einer Pasteurpipette. </li><li> Mit einer Pinzette den Bauch durch einen Einschnitt entlang der ventralen Mittellinie von der Öffnung in der Kutikula, indem Sie die Beine auf den Genitalbereich Segment geschaffen. Entfernen Sie die Eingeweide und Keimdrüsen aus dem Bauch. </li><li> Sever die Kutikula und Tracheen Anschluss der Bauch, die Brust. Die einzige verbleibende Gewebe verbindet den Bauch, die Brust sollte das Herz sein. Dies bietet die abdominale Nagelhaut mit einer gewissen Stabilität und verhindert das Drehen oder Verdrehen während der nächste Schritt. </li><li> Pin flachen vorderen meisten Ecken der abdominalen Nagelhaut. Entfernen Sie den Brustkorb. Pulling die Kutikula straff, polige Flachbandkabel den hinteren Ecken der Nagelhaut. Der Stift im Genitalbereich Segment müssen eventuell neu positioniert, um die Schuppenschicht flach sein. </li></ol> Part 2. Oenocyte Dissektion Der Bauch Filet Vorbereitung macht die innere Oberfläche der abdominalen Kutikula und befestigt Gewebe einschließlich des Herzens, dicken Körper, Tracheen, Körperwand Muskeln, Haut, und die oenocytes. Das Herz liegt entlang der dorsalen Mittellinie. Fat Körper (undurchsichtiges Gewebe) deckt die meisten der internen Kutikula Oberfläche. Tracheen (weiß röhrenförmige Strukturen) von den seitlichen Öffnungen Luftloch zu erweitern, ebenso wie den intensiven Branchen, die diese Gewebe zu infiltrieren. Darunter liegenden diesen Geweben, die pigmentierte oenocytes (bernsteinfarben Zellen) strahlen von der Mittellinie auf den seitlichen Rand der Kutikula in der hinteren Region der einzelnen Segmente. Die oenocytes liegen direkt unter dem schwarz gebrannten Regionen jedes Tergit (dorsal cuticularen Platten) und schwierig sein kann, ohne Vorkenntnisse von ihrem Standort zu identifizieren. Eine weitere Population von ventral gelegenen oenocytes mit dem sternites (ventral cuticularen Platten) assoziiert, obwohl es möglich ist, diese Zellen zu isolieren, das Video-Protokoll wird nur demonstrieren die Dissektion der dorsalen oenocytes. In jedem Abdominalsegment liegt ein prominenter Blatt von Fett Körpergewebe anterior der oenocytes, ein kleinerer weniger offensichtlich Blatt fetten Körper liegt hinter der oenocytes. Der prominente Blatt von Fett Körpergewebe deckt die oft oenocytes des Segments vorangeht. Die dorsale Gefäß und fetten Körper muss zuerst entfernt werden, um die oenocytes aussetzen. Es ist wichtig zu beachten, dass die gelbe Pigmentierung der oenocytes, aus denen die ihren Namen verdankt (oeno - aus dem Griechischen Oinos, &quot;Wein&quot;) 1, deutlich unterscheidet diese Zellen aus dem umliegenden Gewebe, die Intensität der Pigmentierung steigt mit dem Alter der Fliege. Darüber hinaus umhüllt eine Basallamina der oenocytes 2,3, die Unterstützung der Zellhaufen und die Verhinderung der Zellen, die aus immer während der Präparation dissoziiert. Die Basallamina hilft auch bei der Entfernung von extraneously eingehalten Gewebe wie Fett Körpergewebe, indem sie einen schwachen Punkt, wo diese Adhäsionen leicht gestört werden kann. Die im Folgenden beschriebene Vorgangsweise enthält detaillierte Anweisungen für die Beseitigung der oenocytes aus der Bauchhaut. Die oenocytes kann leicht aus Abdominalsegmente 2-5 (männlich) und 2-6 (weiblich) entfernt werden. Die oenocytes aus der ersten und letzten Abdominalsegmente (Segmente 1 und 6 bei Männern und 7 bei Frauen) sind oft durch die Dissektion Stifte halten die Ecken der Kutikula gestört und sind daher zu vermeiden. Die Entfernung der oenocytes dauert ca. 10 Minuten in Anspruch. Um die Erwachsenen oenocytes isolieren: <ol><li> Sever die tracheale Stämme, die aus der Luftlöcher mit einer Dissektion Nadel. </li><li> Entfernen Sie die fetten Körper und Herz durch die Lösung der Anbindung an die innere Oberfläche der Kutikula mit einer Dissektion Nadel. Dazu positionieren Sie den Punkt der Dissektion Nadel zwischen den fetten Körper und die oenocytes, und ziehen Sie es aus dem seitlichen Rand der Kutikula, bis hin zu der Mittellinie bewegen unterhalb des Herzens, und weiterhin gegenüberliegenden Seite. Fortschritt von der hinteren zur vorderen, entfernen Sie das Fett Körpergewebe und das Herz aus der Kutikula von jeder nachfolgenden Segment. Wenn durchgeführt sorgfältig die oenocytes bleiben an der Kutikula, und die fetten Körper und Herz entnommen Ganzes. </li><li> Körper Wand Muskeln Gurt der oenocytes auf die innere Oberfläche der Kutikula. Mit der Zerlegung Nadel sever Längs Körperwand Muskeln der einzelnen Segmente. Dazu ziehen Sie die Dissektion Nadel entlang der hinteren Seite des oenocyte Strang, leichtes Anheben sie von der Oberfläche der Kutikula. Die bandartigen Strängen oenocyte kommen sollte, weg von der Nagelhaut und kann auf die Seite gelegt werden, während die restlichen oenocytes entfernt werden. </li><li> Einmal von der Nagelhaut entfernt und liegt auf dem Sezieren Platte kann es erforderlich sein, um sauber aus allen eingehalten Fett Körpergewebe aus dem oenocytes. Dies ist durch einfaches Auflegen der Dissektion Nadel zwischen dem Fett-Gewebe und die oenocytes und Trennen der Verbindung, indem Sie die Nadel nach unten und gegen die Dissektion Platte gemacht. </li><li> Sammeln Sie die oenocyte Stränge durch einfaches Stoßen sie mit dem Ende der Dissektion Nadel. Einmal bis ans Ende der Dissektion Nadel die oenocytes langsam kann über die Oberfläche des Kulturmediums gezogen werden geklebt. Die seziert oenocytes können direkt in Zell-Lyse-Puffer geeignet für entweder RNA oder Protein-Extraktions-gelegt werden. Beachten Sie, dass die oenocytes (Abdominalsegmente 2-5) von einem einzigen Männchen fliegen in der Regel liefert 15-20ng Gesamt-RNA. </li></ol> Abbildung Legende: <img src="/files/ftp_upload/2242/2242fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Expression der Desaturase-Gene, desat1 und desatF, in männliche und weibliche oenocytes von D. melanogaster. Reverse Transkription-PCR-Amplifikation von desat1 und desatF aus cDNA von ausgewachsenen männlichen und weiblichen oenocytes abgeleitet. Die desat1 Gen ist in männliche und weibliche oenocytes ausgedrückt; desatF Ausdruck geschlechtsdimorphischen, ausschließlich in weiblichen oenocytes ausgedrückt. Entsprechend diesen Unterschieden in der Genexpression, ist desat1 für die Produktion von Kohlenwasserstoff-Verbindungen, die für beide Männchen und Weibchen 9 erforderlich und desatF ist in der Herstellung von spezifisch weiblichen Kohlenwasserstoffverbindungen 10,11 beteiligt. DesatF hat sich gezeigt, dass spezifisch exprimiert werden bei weiblichen oenocytes durch in situ Hybridisierung 12. Beachten Sie, dass im Durchschnitt 15-20ng Gesamt-RNA aus dem oenocytes aus einer einzelnen Fliege seziert erreicht ist. RNA wurde unter Verwendung des RNeasy Micro Kit (Qiagen); cDNA wurde unter Verwendung des qScript cDND Synthese-Kit (Quanta Biosciences)

<ol>
	<li>Wielowiejski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ueber+das+blutgewebe+der+insekten.">Ueber das blutgewebe der insekten.</a> Zeit. Wiss. Zool. 43, 512-536 .</li><li>Krupp, J. J., Kent, C., Billeter, J. C., Azanchi, R., So, A. K., Schonfeld, J. A., Smith, B. P., Lucas, C., Levine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+experience+modifies+pheromone+expression+and+mating+behavior+in+male+Drosophila+melanogaster.">Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster.</a> Curr. Biol. 18, 1373-1383 (2008).</li><li>Locke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+membranes,+Golgi+complexes,+and+vacuolar+systems.">Surface membranes, Golgi complexes, and vacuolar systems.</a> Annu. Rev. Entomol. 48, 1-27 (2003).</li><li>Billeter, J. C., Atallah, J., Krupp, J. J., Millar, J. G., Levine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+cells+tag+sexual+and+species+identity+in+Drosophila+melanogaster.">Specialized cells tag sexual and species identity in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 461, 987-991 (2009).</li><li>Gould, A. P., Elstob, P. R., Brodu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+oenocytes:+a+model+system+for+studying+cell-fate+specification+by+Hox+genes.">Insect oenocytes: a model system for studying cell-fate specification by Hox genes.</a> J. Anat. 199, 25-33 (2001).</li><li>Lawrence, P. A., Johnston, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+of+the+Drosophila+abdomen:+the+epidermis,+oenocytes+and+ventral+muscles.">Cell lineage of the Drosophila abdomen: the epidermis, oenocytes and ventral muscles.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 72, 197-208 (1982).</li><li>Johnson, M. B., Butterworth, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+and+aging+of+adult+fat+body+and+oenocytes+in+Drosophila+as+revealed+by+light+microscopic+morphometry.">Maturation and aging of adult fat body and oenocytes in Drosophila as revealed by light microscopic morphometry.</a> J. Morphol. 184, 51-59 (1985).</li><li>Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+hepatocyte-like+cells+regulate+Drosophila+lipid+metabolism.">Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism.</a> Nature. 445, 275-280 (2007).</li><li>Marcillac, F., Bousquet, F., Alabouvette, J., Savarit, F., Ferveur, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+with+major+effects+on+Drosophila+melanogaster+sex+pheromones.">A mutation with major effects on Drosophila melanogaster sex pheromones.</a> Genetics. 171, 1617-1628 (2005).</li><li>Chertemps, T., Duportets, L., Labeur, C., Ueyama, M., Wicker-Thomas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+female-specific+desaturase+gene+responsible+for+diene+hydrocarbon+biosynthesis+and+courtship+behaviour+in+Drosophila+melanogaster.">A female-specific desaturase gene responsible for diene hydrocarbon biosynthesis and courtship behaviour in Drosophila melanogaster.</a> Insect Mol. Biol. 15, 465-473 (2006).</li><li>Legendre, A., Miao, X. X., Da Lage, J. L., Wicker-Thomas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+a+desaturase+involved+in+female+pheromonal+cuticular+hydrocarbon+biosynthesis+and+courtship+behavior+in+Drosophila.">Evolution of a desaturase involved in female pheromonal cuticular hydrocarbon biosynthesis and courtship behavior in Drosophila.</a> Insect. Biochem. Mol. Biol. 38, 244-255 (2008).</li><li>Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+sex+pheromone-producing+enzyme+expression+in+Drosophila.">Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila.</a> PLoS Biol. 7, e1000168-e1000168 (2009).</li></ol>

In diesem Video-Artikel präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Analyse-Protokoll für die Vorbereitung der oenocytes aus adulten D. melanogaster in einer geeigneten Art und Weise für die molekulare Analyse. Eine gekürzte Text-basierte Darstellung der Dissektion Methode wurde an anderer Stelle 2, beschrieben und die daraus resultierenden oenocyte Vorbereitung hat sich gezeigt, angemessen für die Extraktion der beiden RNA-und Protein-2. Mit dieser Vorbereitung kann es auch möglich, Me...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sylgard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten Wire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella, Inc.</td>
<td>27-11</td>
<td>0.005&#x201D;/20&#x2019;</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dumont</td>
<td>11252-30</td>
<td>#5</td>
</tr>
<tr>
<td>Shields and Sang M3 Insect Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S3652</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy Micro Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>qScript cDNA Synthesis Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quanta Biosciences</td>
<td>95047-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monoject Hypodermic Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>722289</td>
<td>20G1 with aluminum hub</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of oenocytes from adult drosophila melanogaster

In<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, Wie in anderen Insekten, bietet eine wachsartige Schicht auf der äußeren Oberfläche der Kutikula, vor allem der Kohlenwasserstoff-Verbindungen bestehen, Schutz vor Austrocknung und andere ökologische Herausforderungen. Mehrere dieser Kutikula Kohlenwasserstoff (CKW)-Verbindungen auch als chemisch vermittelte Signale, und als solche zu vermitteln Pheromone Kommunikation zwischen Mitgliedern der gleichen Spezies oder in einigen Fällen zwischen verschiedenen Arten und das Verhalten beeinflussen. Spezialisierte Zellen genannt oenocytes werden als der primäre Ort für die CHC-Synthese betrachtet. Allerdings ist relativ wenig bekannt über die Beteiligung der oenocytes in der Regulation der Biosynthese, Transport und Ablagerung Wege einen Beitrag zur CHC-Ausgang. Angesichts der wichtigen Rolle, die CKW in verschiedene Aspekte der Insekten Biologie, einschließlich der chemischen Kommunikation, Austrocknung Widerstand und Immunität zu spielen, ist es wichtig, ein besseres Verständnis der molekularen und genetischen Regulierung der CHC Produktion innerhalb dieser spezialisierten Zellen zu gewinnen. Die erwachsenen oenocytes der<em&gt; D. melanogaster</em&gt; Sind in der Bauchhaut liegt, und sind metamerically in bandartige Cluster strahlende entlang der inneren Kutikula Oberfläche jedes Abdominalsegment angeordnet. In diesem Video-Artikel zeigen wir eine Dissektionstechnik für die Herstellung von oenocytes von Erwachsenen benutzt<em&gt; D. melanogaster</em&gt;. Ausdrücklich stellen wir eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Demonstration (1), wie Filet vorbereiten eines Erwachsenen<em&gt; Drosophila</em&gt; Bauch, (2) wie zur Identifizierung der oenocytes und erkennen sie von anderen Geweben, und (3), wie man intakte oenocyte Cluster von der Bauchhaut zu entfernen. Eine kurze experimentelle Illustration dessen, wie diese Vorbereitung kann verwendet werden, um die Expression von Genen in Kohlenwasserstoff-Synthese beteiligt zu untersuchen ist im Preis inbegriffen. Die seziert Vorbereitung gezeigt, hier wird für die detaillierte molekulare und genetische Analyse der oenocyte Funktion im erwachsenen Fruchtfliege zu ermöglichen.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster at JoVE.com

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Bei den Insekten produzieren oenocytes Kutikula Kohlenwasserstoffverbindungen. Diese Verbindungen gegen Austrocknung zu schützen und zu erleichtern chemische Kommunikation. Hier zeigen wir eine Dissektionstechnik verwendet, um die oenocytes von Erwachsenen zu isolieren<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, Und zeigen, wie diese Vorbereitung genutzt werden, um Gene in Kohlenwasserstoff-Synthese beteiligt zu studieren.

Präparation Oenocytes von Adult Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

dissection-of-oenocytes-from-adult-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

20.4K Aufrufe.  University of Toronto. Bei den Insekten produzieren oenocytes Kutikula Kohlenwasserstoffverbindungen. Diese Verbindungen gegen Austrocknung zu schützen und zu erleichtern chemische Kommunikation. Hier zeigen wir eine Dissektionstechnik verwendet, um die oenocytes von Erwachsenen zu isolieren Drosophila melanogaster, Und zeigen, wie diese Vorbereitung genutzt werden, um Gene in Kohlenwasserstoff-Synthese beteiligt zu studieren.

Serie: Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Drosophila Ovaries

Dissection von Drosophila Ovarien

Forschung

Biologie

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection der Larven ZNS von Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

Dissection der Imaginalscheiben vom 3. Instar Drosophila-Larven

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

Whole Cell Recordings von Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Hochauflösendes Video Tracking von Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissection der hippocampalen von erwachsenen Maus

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

Insulin-Injektion und Hämolymphe Extraction die Insulinsensitivität in Adult Measure Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...