Dr. Stephen Alderman, Dr. David Blatt, und Erin Macri sind dankbar für die Hilfe bei der Mikroskopie anerkannt. Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss aus dem NIFA Specialty Crops Research Initiative, USDA-SCRI SREP Bewilligung von Fördermitteln Nr. 2009-02484 finanziert. Briana Kinash, Kevin Kinloch, Megan Leonhard Joseph McCollum, Maria McSharry und Nicole Sallee lieferte hervorragende technische Unterstützung und nachdenklich Diskussionen.

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die hier beschriebene Verfahrensweise stellt einen First-Pass-Technik zur Isolierung von potenziellen BDM Abbauern aus dem Boden und wurde erfolgreich eingesetzt, um Pilze aus BDMs im Boden für sieben Monate begraben isolieren. Fungi wuchs, als auf frische BDM Material des gleichen Typs überimpft, das anzeigt, dass die isolierten Pilzen Tat waren Kolonisatoren, und daß die Filme waren nicht hemmend für Pilzwachstum. Isolation von Kunststoff-abbauende Pilze und Bakterien könnten potenziell ihre Verwendung führen, e...

Der Abbau ist historisch betrachtet worden eine unerwünschte Eigenschaft von Kunststoff-Polymere, weil Aufschlüsselung verkürzt Produkt Lebensdauer und Haltbarkeit. Vor kurzem hat das Bewusstsein für die Umweltprobleme durch Plastikmüll in der natürlichen Umgebung präsentiert 1,2,3 gemacht biologisch abbaubare Kunststoffe eine attraktive Alternative zu herkömmlichen Kunststoffen. Degradation (definiert als strukturelle Veränderungen, Fragmentierung und Reduktion im Molekulargewicht, Integrität und Stärke 4,5) erfolgt über eine Reihe von Veranstaltungen, darunter sowohl abiotische Prozesse (thermische Belastung, Photo-Oxidation, Hydrolyse, Erosion und mechanischer Belastung), und biologischen Abbau 6. Während abiotische Prozesse das Fragment Größe und die Eigenschaften von Kunststoffen verändern können, sind Mikroorganismen für ihre ultimative Mineralisierung zu Wasser und Kohlendioxid (unter aeroben Bedingungen) und / oder Methan (unter anaeroben Bedingungen) erforderlich. Eine wesentliche Nische fürbiologisch abbaubare Kunststoffe gibt es in der Landwirtschaft, wo Kunststoff Mulch verwendet werden, um Unkraut zu verhindern, um die Bodenfeuchtigkeit zu erhalten und zu erhöhen Bodentemperaturen 7,8. Hunderttausende von Hektar in den Vereinigten Staaten allein sind mit Kunststoff Mulch 9, einschließlich Mulch aus biologisch abbaubarem Kunststoff abgedeckt. Nach einer Ernte Vegetationsperiode, sind die Optionen für die Entsorgung von biologisch abbaubaren Mulch (BDM) Entsorgung in einer Deponie, Verbrennung zur Energierückgewinnung 10, Abbau über Kompostierung oder Abbau im Boden nach Bodenbearbeitung 11. Von diesen sind die wenigsten arbeitsintensive Schicksal Pflügen BDMs in den Boden, aber ohne effizienten Abbau und Mineralisierung während der Nicht-crop Monate (in der Regel im Winter), konnte Kunststoff Fragmente bleiben und stören Landmaschinen im Frühjahr Bodenbearbeitung und Pflanzung, und verbleiben in der Umwelt, wo sie erhebliche Auswirkungen auf Wildtiere, Pflanzen und microbiota 1,2,3,10. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Obwohl viele Kunststoff-Produkte, einschließlich der landwirtschaftlichen Mulchfolien, tragen die Bezeichnung &quot;biologisch abbaubar&quot; oder &quot;kompostierbar&quot;, in der Praxis, Abbau und Mineralisierung möglicherweise zu ineffizient und / oder zu unvollständig für in-Boden-Zersetzung zu sein ein Alternative für die Entsorgung dieser Produkte. Zum Beispiel erreicht oxo-biologisch abbaubare Polyethylene nur 12,4% Mineralisierung nach einem Jahr der Verwitterung und die drei darauf folgenden Monaten in einem 58 ° C Kompost, und weniger als die Hälfte dieses Betrages der Mineralisierung, wenn der Kompost Temperatur betrug 25 ° C 12 aufgetreten. Im Winter würde Bodentemperaturen an den meisten Standorten niedriger sein als entweder von diesen Temperaturen, vermutlich was zu noch niedrigeren mikrobielle Aktivität und folglich weniger Mineralisierung. Neben Abbauraten verlangsamen, hat Missbrauch des Begriffs &quot;biologisch abbaubar&quot; zu misstrauen dieser Produkte durch die Verbraucher 13,14, einschließlich der in der Landwirtschaft geführt. Biologischer Abbau ist die Umwandlungvon Polymeren zu Kohlendioxid (und / oder Methan) und Wasser 14 durch natürlich vorkommende Mikroorganismen 4. Daher müssen biologischen chemisch gemessen werden, die körperliche Vereinigung von Mikroorganismen mit einem Substrat bedeutet nicht, mikrobiellen Abbau dieses Materials. Als Teil der Bemühungen um eine nachhaltige Nutzung von BDMs in der Landwirtschaft untersuchen, diese Studie auf die Entdeckung Mikroorganismen stammt aus landwirtschaftlichen Böden, die sie besiedeln und zersetzen handelsüblichen BDMs konzentriert. Standard-Prüfverfahren wurden für chemisch Messung der Abbau von biologisch abbaubaren Kunststoffen durch abiotische und biologische Mittel 15,16,17 veröffentlicht. Allerdings sind diese Methoden nicht auf Abbau von Kunststoffen durch individuelle mikrobielle Spezies, oder stellen Methoden für ihre Isolation. Die Methodik hierin ähnelt mehr Standard-Methoden entwickelt, um Kunststoffe für die Resistenz gegen mikrobiellen Abbau nach Impfen Proben mit Pilzsporen bewerten18,19. Wenn Formulierungen von Kunststoffen bekannt sind und eine Quelle des Ausgangsmaterials vorhanden ist, kann pulverförmigen Kunststoff in Agar-basierten Medien-und Abbau durch Visualisierung von Clearing-Zonen 13 bestimmt ausgesetzt werden. Diese Methode wurde bereits von Mikroorganismen, dass Polymere wie Polyurethan 20 verschlechtern, Poly (butylensuccinat-co-adipat) 21 und Poly (Milchsäure) 22 zu identifizieren. Ein ähnliches Verfahren beinhaltet das Suspendieren reinen pulverförmigen Kunststoff in flüssigem Medium, in dem der Kunststoff die einzige Kohlenstoffquelle 20,23. Während diese Verfahren den Vorteil einer definierten System haben, sie schlecht zu imitieren in situ Abbau von BDMs. Zuerst wird die Oberfläche anders, weil BDMs nicht in kleine Teilchen durch den Boden dispergiert sind, sondern, verkauft und verwendet wie Folien verteilt. Zweitens ist die chemische Zusammensetzung von BDMs aus reinem Polymeren. BDMs enthalten in der Regel Additive, wieFüllstoffe, Weichmacher und Farbstoffe, und diese Additive beeinflussen kann mikrobielles Wachstum und damit die Geschwindigkeit der Mineralisierung. Aus diesem Grund, und weil die Zusammensetzung bestimmter kommerzielle Filme in dieser Studie waren proprietär, Kunststoff-Folie in diesem Bereich bereits Form wurde verwendet, um Pilze und Bakterien zu isolieren. Der Einfachheit halber werden die folgenden Methoden nur für Pilze beschrieben, mit Änderungen hingewiesen gegebenenfalls für bakterielle Isolierungen. In einer aktuellen Studie 24 wurden drei kommerziell erhältlichen BDMs und ein experimenteller Film auf landwirtschaftlichen Standorten in drei verschiedenen Regionen der Vereinigten Staaten für eine Vegetationsperiode, und anschließend in mesh (250 Mikrometer) Taschen gelegt und begraben für einen Winter im Boden an den gleichen Standorten. Die 250 micron Maschen erlauben Pilzhyphen zu durchdringen, während ohne Wurzeln und die meisten Bodenfauna und der Minimierung der Eingriffe Boden 25,26. Nylon Materialien zu verhindern Beutel Abbau im Boden. Nach Aushub, fungal Isolate wurden vom BDM Stücke gewonnen und beurteilt für Wachstum auf Minimalmedium ohne Kohlenstoffquelle außer dem Agar und einem 5 cm x 5 cm Oberfläche desinfiziert Quadrat neu, unbenutzt BDM Film, der pre-entwesten war. Die meisten Kunststoffe wie Folien nicht ohne Verlust der Integrität autoklaviert werden, so wurde UV-Licht verwendet werden, um mikrobielle Zellen, die sich auf die Kunststoff töten. ISO 846 19 empfiehlt Oberfläche Entwesung in 70% Ethanol und anschließender Trocknung, aber wenn mit dieser Methode, muss man sicherstellen, dass keine Komponente oder Zusatzstoff des Films negativ wird von der Ethanol betroffen. Seit BDMs vermutlich hergestellt von Sonnenlicht zu widerstehen, wurde UV als Dekontaminationsmethode gewählt. Isolate, die auf BDM Stück besser als auf Minimalmedium alleine wuchsen, wurden zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Agar, ein Polysaccharid durch Meeresalgen produziert, wird verwendet, um mikrobielle Medien verfestigen, da es in der Regel nicht genutzt metabolisch von landwirtschaftlich und medizinisch nichtkönnen Mikroorganismen, jedoch haben Agar-Hydrolyse Enzyme aus marinen Bakterien 27 und Agar-Hydrolyse Bakterien haben auch aus dem Boden 28 isoliert isoliert worden. BDM Polymeren und Agar sowohl erwartet seltenen Substrate für Enzyme, die durch Boden-Pilze, die in Umgebungen, in denen diese Polymere als potentielle Nährstoffquellen enthalten entwickelt haben sezerniert werden, aber beide Substrate sind in der Platte Bioassay hier (Schritt 7). Pilze, die BDMs aber nicht Agar verwenden als Kohlenstoffquelle aus Pilzen, die Agar verwenden nur unterschieden werden, indem das Wachstum auf Agar-verfestigtem Medium, enthaltend i) keinen zusätzlichen Kohlenstoffquelle außer Agar (negative Kontrolle), ii) BDM Filme (experimentell) und iii) Glucose (positive Kontrolle). Wachstum der Isolate auf Minimalmedium mit Glukose erwartet; Pilze nicht entstehende Glucose-enthaltenden Platten möglicherweise nicht in der Lage ist Wachstum auf dem bestimmten Minimal-Medium in dem Experiment verwendet. Potential BDM Abbauern sollte auf Agar verfestigten Minimalmedium + BDM Film besser als sie auf Agar verfestigten Minimalmedium wachsen allein wachsen. Pilze wachsen auf Minimalmedium Platten sind Agar-Abbauern oder oligotrophs und werden voraussichtlich auch auf dem Agar mit BDM Filme in Bioassay Platten verbunden wachsen, aber nicht auf die Filme selbst (es sei denn, sie glücklicherweise auch verschlechtern BDM Polymere). Um die Möglichkeit zu sehen, das mikrobielle Wachstum durch die Nutzung von Agar und nicht die von BDMs beseitigen, folgten wir unseren ersten Test zum BDM Kolonisation auf Agar-Platten mit einem Biotest in definierten Brühemedium (Schritt 9). BDM Stücke repräsentiert die einzige bekannte Kohlenstoffquelle in dem Bioassay Rohre. Nach dem ersten Screening und auf die Wiederbelebung Glycerin Aktien der Isolate, einige knappe, aber sichtbare Myzel in flüssigem Medium, das definiert keine bekannte Kohlenstoff-Quelle gebildet. Diese Ergebnisse legen nahe, dass einige der erworbenen Isolate waren oligotrophs - Organismen, die durch Abfangen sehr geringe Mengen an Kohlenstoff, Stickstoff und andere Nährstoffe, entweder in der wässrigen Umgebung oder bestehenden flüchtigen in der Luft gelöst 29,30,31 wachsen. Species Identifizierung über 18S ribosomalen DNA-Analyse unterstützt diese Ansicht, da viele der Isolate abgestimmt Pilzgattungen zuvor berichtet Oligotrophie 32 ausstellen. Oligotrophs, die gewöhnlich sind saprophytes erfordern ein breites Spektrum von metabolischen Funktionen für die Nutzung Substrat in einem Bereich von 30 Umgebungen. So ist es nicht verwunderlich, dass wir die gleichen Pilze isoliert von BDMs (vermutlich erfordern ungewöhnliche enzymatischen Fähigkeiten) nährstoffarmen Kapazitäten demonstriert und konnten sich auf Spurenstoffe wie Hautfett vor Fingerabdrücken, Staub oder flüchtige Spuren in der Luft wachsen. Durch die Isolierung von oligotrophs schlossen wir, dass das Wachstum auf einer BDM Oberfläche allein nicht verwendet werden, um BDM Aufschlüsselung abzuleiten. Die hier beschriebenen Verfahren beziehen sich auf unsere Bemühungen, screen nativen BDM Kolonisatoren aus landwirtschaftlichen Böden für bona fide BDM Zusammenbruch.

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<tbody>
 <tr>
 <td>Reagent Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potato Dextrose Agar</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>8X05491</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Agar</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP 1423-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Chloramphenicol</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>200-287-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Glutaraldehyde</td>
 <td>Electon Microscopy Sciences</td>
 <td>16216-10</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Molecular sieve</td>
 <td>Fisher </td>
 <td>M-8892</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Ethanol</td>
 <td>Pharmco-Aaper</td>
 <td>E200</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Contrex</td>
 <td>Decon Labs, Inc.</td>
 <td>5204</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Parafilm M</td>
 <td>Pechiney Plastic Packaging</td>
 <td>S37440</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Mineral salts for buffers and media</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>Various</td>
 <td>Various vendors sell these reagents</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of native soil microorganisms with potential for breaking down biodegradable plastic mulch films used in agriculture

Fungi heimisch landwirtschaftlichen Böden, die im Handel erhältlichen biologisch abbaubaren Mulch (BDM) Filme kolonisiert wurden isoliert und auf eine mögliche Potenzial, Kunststoffe zersetzen. Normalerweise, wenn Formulierungen von Kunststoffen bekannt sind und eine Quelle des Ausgangsmaterials vorhanden ist, kann pulverförmigen Kunststoff in Agar-basierten Medien-und Abbau durch Visualisierung von Clearing-Zonen bestimmt ausgesetzt werden. Doch dieser Ansatz schlecht imitiert in situ Abbau von BDMs. Zuerst werden BDMs nicht als kleine Teilchen durch den Boden dispergiert. Zweitens werden BDMs nicht im Handel als reine Polymere erhältlich, sondern als Folien, die Zusätze (z. B. Füllstoffe, Weichmacher und Farbstoffe), die das mikrobielle Wachstum beeinflussen können. Die hier beschriebenen Verfahren wurden Isolate aus Boden vergraben Mulchfolien erworben werden. Pilz-Isolate aus ausgegraben BDMs erworben wurden einzeln für Wachstum auf einem Stück neue, entwesten BDMs oben definierten Medium ohne Kohlenstoffquelle e festgelegten getestetXCEPT Agar. Isolate, die auf BDMs wuchsen, wurden weiter in einem flüssigen Medium, wo BDMs waren die einzige hinzugefügt Kohlenstoffquelle getestet. Nach etwa zehn Wochen wurden Pilzbesiedlung und BDM Abbau durch Rasterelektronenmikroskopie untersucht. Isolate wurden durch eine Analyse der ribosomalen RNA-Gen-Sequenzen identifiziert. Dieser Bericht beschreibt die Methoden zum Pilz isoliert, sondern auch Bakterien isoliert wurden mit diesen Methoden durch Einsetzen geeigneter Medien für Bakterien. Unsere Methodik sollte sich als nützlich erweisen für Studien, die Aufschlüsselung der intakten Kunststofffolien oder Produkte, für die Kunststoff-Rohstoffe sind entweder unbekannt oder nicht verfügbar. Doch unser Ansatz nicht ein quantitatives Verfahren zum Vergleich von Preisen BDM Abbau.

In einer aktuellen Studie 24, repliziert jeweils vier von drei kommerziell erhältlichen BDMs Bezeichnung &quot;biologisch abbaubar&quot;, sowie einen experimentellen Film und eine herkömmliche Kunststoff-Kontrolle wurden über Boden als Mulch für Tomaten-Produktion im Frühjahr 2010 gelegt in Mount Vernon, WA, Knoxville, TN, und Lubbock, TX. Im Herbst 2010 wurden BDM Film Quadrate von jeweils verwitterten Mulch in vier replizieren Grundstücke geschnitten und Mutterboden wurde aus direkt unter dem Bereich,...

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Isolation of Native Soil Microorganisms with Potential for Breaking Down Biodegradable Plastic Mulch Films Used in Agriculture

Kunststoff-Folien mit der Bezeichnung &quot;biologisch abbaubar&quot; sind im Handel erhältlich für die landwirtschaftliche Nutzung als Mulch. Bodenbearbeitung stellt eine attraktive Methode zur Verfügung, aber Abbau unter Feldbedingungen ist wenig bekannt. Der Zweck dieser Studie war es, Methoden zur Isolierung von Mutterboden Pilze und Bakterien, die Plastik Mulchfolien nach Feld Bestattung kolonisieren zu entwickeln.

Isolation der Native Soil Mikroorganismen mit Potenzial für den Abbau von biologisch abbaubaren Kunststoff Mulch Films in der Landwirtschaft eingesetzt

Fungi native to agricultural soils that colonized commercially available biodegradable mulch (BDM) films were isolated and assessed for potential to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

30.4K Aufrufe.  Western Washington University. Kunststoff-Folien mit der Bezeichnung "biologisch abbaubar" sind im Handel erhältlich für die landwirtschaftliche Nutzung als Mulch. Bodenbearbeitung stellt eine attraktive Methode zur Verfügung, aber Abbau unter Feldbedingungen ist wenig bekannt. Der Zweck dieser Studie war es, Methoden zur Isolierung von Mutterboden Pilze und Bakterien, die Plastik Mulchfolien nach Feld Bestattung kolonisieren zu entwickeln.

Serie: Isolation of Native Soil Microorganisms with Potential for Breaking Down Biodegradable Plastic Mulch Films Used in Agriculture

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastic Embedding und Schnitte von Xenopus laevis Embryonen

Forschung

Biologie

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

Isolation von Protoplasten aus Geweben von 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) plasmid. A. rhizogenes can cause hairy root formation on plant tissues and form composite plants after transformation. On these composite plants, some of the regenerated roots are transgenic, carrying the wild type T-DNA and the engineered binary vector; while the shoots are still non-transgenic, serving to provide energy and growth support. These hairy root composite plants will not produce transgenic seeds, but there are a number of important features that make these composite plants very useful in plant research. First, with a broad host range,A. rhizogenes can transform many plant species, especially dicots, allowing genetic engineering in a variety of species. Second, A. rhizogenes infect tissues and explants directly; no tissue cultures prior to transformation is necessary to obtain composite plants, making them ideal for transforming recalcitrant plant species. Moreover, transgenic root tissues can be generated in a matter of weeks. For Medicago truncatula, we can obtain transgenic roots in as short as three weeks, faster than normal floral dip Arabidopsis transformation. Overall, the hairy root composite plant technology is a versatile and useful tool to study gene functions and root related-phenotypes. Here we demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species M. truncatula.

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

We demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species Medicago truncatula.

Generierung von Composite-Anlagen in Medicago truncatula Für Nodulation Assays verwendet

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy to use and widely utilized by laboratories analyzing the adipogenic potential of mesenchymal cells. However, they are not specific to changes in gene transcription. We have developed a gene-specific differentiation assay to analyze when a mesenchymal cell has switched its fate to an adipogenic lineage. Immuno-labelling against fatty acid binding protein-4 (FABP4), a lineage-specific marker of adipogenic differentiation, enabled visualization and quantification of differentiated cells. The ability to quantify adipogenic differentiation potential of mesenchymal cells in a 96 well microplate format has promising implications for a number of applications. Hundreds of clinical trials involve the use of adult mesenchymal stromal cells and it is currently difficult to correlate therapeutic outcomes within and especially between such clinical trials. This simple high-throughput FABP4 assay provides a quantitative assay for assessing the differentiation potential of patient-derived cells and is a robust tool for comparing different isolation and expansion methods. This is particularly important given the increasing recognition of the heterogeneity of the cells being administered to patients in mesenchymal cell products. The assay also has potential utility in high throughput drug screening, particularly in obesity and pre-diabetes research.

Traditional methods of assessing adipogenic differentiation are cheap and easy to use, but are not specific to changes in gene expression. We have developed an assay to quantify mesenchymal cell differentiation into mature adipocytes using a lineage specific marker. This assay has diverse applications across basic research and clinical medicine.

Visualisierung und Quantifizierung von mesenchymalen Zellen adipogenen Differenzierung Potenzial mit einer Linie spezifische Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

Mikron-Skala Phänotypisierung Techniken der Mais Leitbündel basierend auf Microcomputed Röntgentomographie

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Repeatable Stair-step Assay to Access the Allelopathic Potential of Weedy Rice (Oryza sativa ssp.)

Weed competition contributes significantly to yield losses in cropping systems worldwide. The evolution of resistance in many weed species to continuously applied herbicides has presented the need for additional management methods. Allelopathy is a physiological process that some plant species possess that provide the plant with an advantage over its neighbors. Allelopathic crop varieties would be equipped with the ability to suppress the growth of surrounding competitors, thus reducing potential yield loss due to weed interference. This paper focuses on the construction and operation of a stair-step assay used for the screening of the allelopathic potential of a donor species (Oryza sativa) against a receiver weed species (Echinochloa crus-galli) in a greenhouse setting. The structure described in this paper serves as a stand for the plant samples and incorporates a timed watering system for the accumulation and distribution of allelochemicals. Allelochemicals produced by the plant roots are allowed to flow downward through a series of four pots separately into a collection tank and recycled back to the top plant through electric pumps. This method of screening provides an avenue for the allelochemicals from the donor plant to reach receiver plants without any resource competition, thus allowing quantitative measurement of the allelopathic potential of the selected donor plant. The allelopathic potential is measurable through the height reduction of the receiver plants. Preliminary screening data for the effectiveness of this method demonstrated height reduction in the receiver species, barnyardgrass (E. crus-galli), and thus the presence of allelopathic residues from the donor plant, weedy rice (Oryza sativa).

Repeatable Stair-step Assay to Access the Allelopathic Potential of Weedy Rice Oryza sativa ssp.

Allelopathy has shown promise as a useful supplemental weed control strategy in cropping systems. To determine the allelopathic potential of a desired plant specimen, a stair-step screening method is provided.

Wiederholbarer Treppenschritt-Assay zum Zugriff auf das allelopathische Potenzial von Weedy Rice (Oryza sativa ssp.)

Weed competition contributes significantly to yield losses in cropping systems worldwide. The evolution of resistance in many weed species to continuously ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequenzierung für räumliche und zeitliche gewebespezifische Genexpressionsanalyse in Pflanzen

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Isolierung primärer Rattenhepatozyten mit Multiparameter-Perfusionskontrolle

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

Anwendung der passiven Kopfbewegung zur Erzeugung definierter Beschleunigungen an den Köpfen von Nagetieren

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...