Wir können Probiotika isolieren und zusammenbauen, die sowohl die Gesundheit der Korallen fördern als auch gleichzeitig die Auswirkungen der Verschmutzung mildern können und die zur Persistenz eines Riffs in der sich verändernden Welt beitragen können. Der beschriebene Isolations- und Screening-Ansatz kann verwendet werden, um Mikroorganismen auszuwählen, die wichtige Stoffwechselaktivitäten wie den Abbau von Schadstoffen oder andere nützliche Eigenschaften für Meeresorganismen wie Korallen darstellen. Diese Methode kann angewendet werden, um Mikroorganismen zu isolieren, die in der Lage sind, Verunreinigungen zu abbauen.
Und zusätzlich können andere Materialquellen in den anderen Umweltproben wie Pflanzen, Boden, Wasser, alles verwendet werden. Studieren Sie die Literatur und versuchen Sie, sich auf Stämme zu konzentrieren, die gute Kandidaten für Ihren Zweck sein können. Wenn möglich, richten Sie die Isolationsmethoden für diese Stämme und vermeiden Sie bekannte Krankheitserreger.
Und wenn Sie ein Konsortium von Bakterien verwenden wollen, ist es auch sehr wichtig, zuerst zu untersuchen, ob die Mitglieder des Konsortiums antagonistische Aktivität gegeneinander haben. Da Korallen zunehmend vom Aussterben bedroht sind, beginnt diese Methode weltweit und es besteht die Notwendigkeit, die Methode zu verbreiten und zu standardisieren. Da einige Korallenforscher keine Erfahrung mit konventioneller Mikrobiologie haben, haben sie deshalb häufig um Rat gefragt, wie mit einem solchen Ansatz verfahren werden soll.
Um von jeder gezielten Probenahmestelle aus zu beginnen, verwenden Sie sterile Flaschen mit Schraubverschlüssen, um 500 Milliliter Wasser in Dreifacharbeit zu sammeln. Wenn die Probenverarbeitung später stattfindet, halten Sie die Flaschen bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie eine sterile Zange und Zange, um Korallenfragmente von der gleichen Probenahmestelle der Wasserproben zu schneiden.
Spülen Sie das Probenkorallenfragment mit 20 Millilitern steriler 3%Salzlösung oder künstlichem Meerwasser, um die lose befestigten frei lebenden Bakterien des Meerwassers loszuwerden. Mit Zangen jedes Korallenfragment in einen sterilen Behälter mit einem Schraubverschluss mit steriler Lösung legen. Mit sterilen Zangen und Zangen wiegen sie fünf Gramm Korallenfragmente in sterilen Petrischalen auf einer Waage.
Übertragen Sie die fünf Gramm Korallenprobe auf einen sterilen Mörtel und mazerieren Sie sie mit einem sterilen Stößel. Mit einem sterilen Spachtel die mazerierte Probe in einen sterilen Kulturkolben mit 25 Millilitern 3%Natriumchlorid-Sterillösung und 10 bis 15 Glasperlen von 2,5 Millimetern übertragen. Verwenden Sie 20 Milliliter sterile Saline-Lösung, um den Mörtel in die Röhre zu waschen, um die maximale Menge des Mazerats zurückzugewinnen.
Um Mikroorganismen von verschiedenen Korallenkomden zu lösen, halten Sie die Kolben 16 Stunden lang bei der Wassertemperatur der Probenahmestelle 16 Stunden lang bei 150 mal g unter ständiger Rührung auf. Um Bakterien auszuwählen, führen Sie zunächst serielle Verdünnungen bis zu 10 bis zu den negativen neun in steriler Salzlösung für Korallenproben und bis zu 10 bis zu den negativen sechs für Wasserproben durch. Pipette verdünnt sich fünfmal auf und ab, bevor die Spitze entsorgt wird.
Dann wirbeln sie jeweils. Wirbeln Sie die Proben jedes Mal für fünf Sekunden, bevor Sie die nächste serielle Verdünnung durchführen. Pipette 100 Mikroliter jeder Verdünnung auf Petrischalen mit 3%Natriumchlorid-Lysogeny-Brühe Agarmedium und Platte.
Inkubieren Sie die Platten für ein bis drei Tage bei der Zieltemperatur, zum Beispiel 26 Grad Celsius. Überprüfen Sie die Platten einmal täglich. Wählen und isolieren Sie die Kolonien, die mit der Streifenplattentechnik unterschiedliche Wachstumsmorphologien auf neuen Platten präsentieren.
Wiederholen Sie diesen Schritt so oft wie nötig, um reine Kolonien auf den Tellern wachsen zu lassen. Bewahren Sie die Isolate bei vier Grad Celsius oder in Glycerin auf, wie im Manuskript beschrieben. Um den EE2-Degradationstest durchzuführen, wählen Sie eine einzelne Kolonie aus den frischen Platten und impfen Sie in zwei Milliliter sterilem LB-Medium in einem Rohr.
Falls es sich um einen Glycerinbestand handelt, nehmen Sie 10 Mikroliter Glycerin-Bakterienbestand und streifen Sie auf LB-Agarplatten. Inkubieren Sie bei 24 bis 28 Grad Celsius über Nacht, um einzelne Kolonien wachsen zu lassen. Legen Sie das Rohr mit LB-Medium unter ständiger Rührung bei 150 mal g bei 24 bis 28 Grad Celsius über Nacht.
Nach dem Bakterienwachstum pellet die Zellen, indem man sie acht Minuten lang bei Raumtemperatur mit 8 000 mal g zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand. Um die verbleibende LB-Brühe zu waschen, fügen Sie zwei Milliliter Kochsalzwasser hinzu, um die Zellen wieder aufzuhängen.
Wiederholen Sie die Wäsche zweimal, um sicherzustellen, dass keine Spuren von Kohlenstoffquelle vorhanden sind. Impfen Sie die gewaschenen und resuspendierten Zellen im minimalen Bushnell Haas Kulturmedium, das EE2 als einzige Kohlenstoffquelle enthält. Bewerten Sie das Bakterienwachstum durch optische Dichte bei 600 Nanometern und unsere koloniebildenden Einheiten auf LB-Agarmedium nach 16 bis 72 Stunden Inkubation.
Um minimale Medien zu erstellen, die eine öl-wasserlösliche Fraktion und eine öl-wasserunlösliche Fraktion als einzige Kohlenstoffquelle enthalten, fügen Sie 1-2% Rohöl zu 500 Milliliter sterilen destillierten Wassers in einem Filterkolben hinzu, der ein Ventil auf dem Boden enthält. Halten Sie den Kolben bei 24 bis 28 Grad Celsius bei 150 mal g 48 Stunden unter ständiger Erregung aufbewahren. Danach den Kolben auf eine stabile Oberfläche stellen und 10 bis 20 Minuten warten, damit sich die lösliche und unlösliche Fraktion trennen kann.
Öffnen Sie dann den unteren Filterkolben, um die ölwasserlösliche Fraktion in einen neuen sterilen Kolben zu übertragen, der die öl-wasserunlösliche Fraktion einspart. Dann bereiten Sie zwei Flaschen Bushnell Haas Agar Minimum Medium. Autoclave es.
Kombinieren Sie mit der öl-wasserlöslichen Fraktion als einzige Kohlenstoffquelle, die 500 Milliliter Agarmedium macht. Tun Sie das gleiche mit der öl-wasserunlöslichen Fraktion und übertragen Sie ca. 25 Milliliter jedes Mediums auf einzelne Petrischalen. Um ölabbauende Bakterien zu isolieren, verwenden Sie zuvor verdünnte Proben und Pipette 100 Mikroliter jeder Verdünnung auf die Petrischalen, die Agarmedium enthalten und sie verblechen.
Denken Sie daran, negative Kontrollen für Ihre Platten zu halten. Inkubieren Sie die Gerichte für ein bis drei Tage bei der Zieltemperatur und wiederholen Sie die Isolationsverfahren wie zuvor. In diesem Protokoll wurden Mikroorganismen aus verschiedenen Wasserquellen isoliert und Korallennubbine mit vermeintlichen BMC-Eigenschaften und in der Lage, verschiedene Klassen von Verunreinigungen zu abbauen.
Mit Wasserproben, die in einer Kläranlage gesammelt wurden, die vom Experimental Center of Environmental Sanitation der Federal University of Rio de Janeiro gewonnen wurden, wurden 33 Bakterienstämme isoliert, die EE2 abbauen konnten. Zusätzlich wurden mit der Technik zur Auswahl ölabbauender Bakterien 20 Stämme isoliert, die sowohl ölwasserlösliche Als auch ölwasserunlösliche Fraktionen abbauen konnten. Vermeintliche BMC-Eigenschaften wurden in Mikroorganismen untersucht, darunter ein Stamm, der eine starke antagonistische Aktivität gegen den Korallenpathogen Vibrio cholerae lyticus aufweist, Stämme, die Harnstoff abbauen können, ein guter Katasaseproduzent und Mikroorganismen, die potenziell vorteilhafte Gene aufweisen, wurden gefunden.
Durch die Verwendung von Bio-Remediation und BMC-Impfung war es möglich, Korallen aus Ölexpositionseinwirkungen vorherzusagen. Ein von der Koralle isoliertes Ölbioremediator-Konsortium PBMC wurde auf Korallen-Nubbins geimpft, die 1% Öl ausgesetzt waren. Es zeigte eine besser erhaltene photochemische Fähigkeit im Vergleich zur Korallengesundheit ohne Impfung.
Lassen Sie Proben nicht zu lange bei Raumtemperatur. Andernfalls kann sich die mikrobielle Gemeinschaft verändern und krankheitsbedingte Mikroben andere überwuchern. Rohöl ist giftig.
Bitte stellen Sie sicher, dass Sie bei der Arbeit mit diesem oder einem anderen Schadstoff, den Sie verwenden möchten, die entsprechende persönliche Schutzausrüstung verwenden. Die Technik ebnete einen innovativen Weg auf dem Gebiet der Korallenrestaurierung und ozeanische Biosanierung kann potenziell verwendet werden, um wirtschaftliche, ökologische und soziale Auswirkungen durch globale Veränderungen zu minimieren.
