Diese Arbeit wurde zum Teil durch Mittel aus dem Institut Pasteur und durch Zuschüsse aus dem Ligue nationale contre le Cancer (Zuschüsse R05/75-129 und RS07/75-75), der Vereinigung pour la Recherche sur le Cancer (Zuschüsse ARC A09 / unterstützt 1/5031 und 4867) und die Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 und 026 01 ANR09 MIEN). MM war ein Empfänger einer MENRT Gemeinschaft.

1. Hefe-Zwei-Hybrid-Screenings <ol><li> Nehmen Sie die folgenden erforderlichen Lösungen: <ol><li> Komplette Synthetic Drop Out (SD): Man löst 26,7 g minimal SD Basis mit Glucose in 1 l Wasser. 2 g der Aminosäure-Mischung wie folgt hergestellt: 2 g Adenin hemisulfate, 2 g Arginin HCl, 2 g Histidin HCl, 2 g Isoleucin, 4 g Leucin, 2 g Lysin HCl, 2 g Methionin, Phenylalanin 3 g, 2 g L -Serin, 2 g L-Threonin, 3 g Tryptophan, Tyrosin 2 g, 1,2 g Uracil, 9 g Valin. </li><li> Selective Drop Out SD-L/-W/-H: SD enthält alle essentiellen Aminosäuren außer den angegebenen (-L:-Leucin;-W:-Tryptophan;-H:-Histidin). </li><li> YPGLU: Für 1 L, Gewicht 10 g Hefeextrakt, 10 g Bacto-Pepton und 20 g Glucose. Komplett mit 25 g Bactoagar für feste Medien. </li><li> YCM: Wie YPGLU, aber pH-Wert auf 4,5 eingestellt. </li></ol></li><li> Passende und Verbreitung <ol><li> Verwendung eingefroren Aliquots von pre-Transformationed Hefestamm Y187 (Paarungstyp α), die eine cDNA-Bibliothek in pACT2 geklont. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen durch Ausplattieren serielle Verdünnungen auf SD-L-Platten. </li><li> Klonen Sie die Erreger in ORF pGBKT7 Vektor, und verwandeln das rekombinante Plasmid mit einem Standard-Verfahren in Hefestamm AH109 (Paarungstyp a). </li><li> Spread-pGBKT7 transformierten AH109 Hefe auf SD-W Platten. Inkubieren mindestens zwei Tage 30 ° C in einem befeuchteten Inkubator. Die Platten können bei 4 ° C bis zum Zwei-Hybrid-Screening gespeichert werden. </li><li> Mit 3-Aminotriazol (3-AT), einem kompetitiven Inhibitor des HIS3 Enzym, um das Potenzial selbst Transaktivierung des HIS3 Reportergens durch die Erreger &#39;Proteinen entgegenwirken. Führen Sie eine automatische Aktivierung Test durch die Bestimmung der Konzentration von 3-AT, die das Wachstum von pGBKT7-transformierten Hefezellen verhindert auf SD-W/-H Platten. </li><li> Seed 30 ml SD-W mit wenigen Kolonien pGBKT7 transformierten AH109. Inkubation 30 h bei 30 ° C mit einer Drehung. </li><li> Seed 200 ml SD-W mit 30 mlder AH109 Kulturen. Inkubation mit Drehung um 20 h bei 30 ° C. </li><li> Aufgetaut cDNA-transformierten Y187 in 20 ml YPGLU, Inkubation 10 min bei 30 ° C unter Rotation inkubiert. </li><li> Zentrifuge ein Volumen von pGBKT7 transformierten AH109 Kultur entsprechend einer äquivalenten Menge von lebensfähigen Hefezellen Y187 für 5 min bei 3500 UpM bei 20 ° C. Vorsichtig zurückziehen den Überstand und Pellet in 10 ml YPGLU. </li><li> Mischen Sie die resuspendierten AH109 Hefe mit Y187 enthaltende Bibliothek. Übertragen in einer 50 ml Tube. Zentrifuge für 5 min bei 3.500 rpm bei 20 ° C, vorsichtig zurückziehen Überstand (fragile Pellet). </li><li> Pellet in YPGLU um insgesamt 1,5 ml. </li><li> Spread-Hefe auf 3 YCM-Agar 150 mm Platten, 0,5 ml / Platte. Inkubation 4,5 h bei 30 ° C. </li><li> Sammeln gepaart Hefe YCM Platten durch Abkratzen mit einem Rechen Glas in 10 ml SD-L/-W/-H. Spülen Sie die Platten zweimal mit 5 ml Medium SD-L/-W/-H und Pool. </li><li> Zentrifuge 5 min bei 3.500 rpm, 20° C. Überstand verwerfen und Pellet resuspendieren die Hefe in 5 ml Medium SD-L/-W/-H. </li><li> Verbreiten gepaart Hefe auf 10 Platten (0,5 ml / Platte) von SD-L/-W/-H Agar mit der entsprechenden Konzentration von 3-Aminotriazol (3-AT) in der Auto-Aktivierung Test bestimmt ergänzt. Inkubation bei 30 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre für 6-10 Tage. </li><li> Bestimmen Sie die diploid (2n)-Rate um Paarungseffizienz durch die Verbreitung 250 ul serielle Verdünnungen (10 -4 bis 10 -6) der gesteckten Hefesuspension auf SD-L/-W Platten bewerten. Platten bei 30 ° C für zwei Tage. Graf Kolonien auf SD-L/-W gewachsen, und daraus die gesamte diploide Zahl in der anfänglichen Volumen gepaart Hefe. Melden diploide Zahl lebensfähiger Bibliothek enthaltende Hefe, um den diploiden zu berechnen. Es sollte reichen um 10-25%. </li><li> 6-10 Tage nach Inkubation bei 30 ° C, holen gepaart Hefekolonien in frischen SD-L/-W/-H + 3-AT-Platten. [Tipp: Um die Hefe in einem Schema von 8Gassen von 12 Wells Wiedergabe eines 96-Well-Platte, so dass es einfacher sein wird später für die Sequenzierung]. Lassen Hefekolonien wachsen für 4-5 Tage bei 30 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre. </li></ol></li><li> Screening von his3 positive Klone durch PCR und Sequenzierung Das Ziel ist, die PCR zu amplifizieren ORF in den pACT2 Träger Hefekolonien auf selektiven Platten gezüchtet SD-L/-H/-W enthalten. <ol><li> Legen Sie eine 96-Well-PCR-Platte auf Eis. </li><li> Um Hefezellen lysieren, fügen Sie 50 ul pro Well einer Zymolase 20T Lösung (2,5 mg / ml in 10 mM HEPES-Puffer pH 7.7). </li><li> Vorsichtig resuspendieren eine Kolonie pro Vertiefung. </li><li> Inkubieren 15 min bei 37 ° C und 15 min bei 95 ° C. </li><li> Setzen Sie die Platte wieder auf Eis. In 50 ul destilliertem Wasser pro Vertiefung. Gut mischen durch Auf-und Abpipettieren. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 3.500 rpm und 4 ° C. </li><li> PCR amplifizieren 10 ul eines Einsatzes unter Verwendung der Primer Annealing beiden Seiten des ORF von cDNA in pACT2 abgeleitete Vektoren zu detektieren. Das Protokoll ist gIven zur Amplifikation von 96 lysierte Hefe Kolonien mit dem ExTaq Polymerase. Bereiten Sie die folgende Mischung: 525 ul 10x ExTaq Puffer, 420 ul dNTPs Mix (2,5 mm), 10,5 ul Forward Primer (1 ug / ul), 10,5 ul Reverse Primer (1 ug / ul), 31,5 ul ExTaq (5 U / ul ) und 3202,5 ​​ul H 2 0. Verteilen Sie 40 ul der Mischung pro Vertiefung in einer 96-Well PCR-Platte. In 10 ul lysierte Hefe pro Vertiefung. Für die Amplifikation wie folgt: 94 ° C für 3 min, dann 35 Zyklen bei 94 ° C für 30 sec, 60 ° C für 1 min, 72 ° C für 4 min, und am Ende mit 72 ° C für 7 min. Lauf 3 ul der PCR-Produkte auf einem 1,2% Agarosegel der PCR-positive Klone zu detektieren. Beachten Sie, dass mit pre-cast 96 gut Agarosegelen empfohlen. [Tipp: Platte kann bei -20 ° C für ein paar Monate gelagert werden und für neue PCR wieder verwendet] </li><li> Sequence die PCR-Fragmente aus HIS3 positive Klone isoliert. Führen Sie eine BLAST-Analyse der zellulären ORF zu identifizieren. Low-Vertrauen Ausrichtungen (E &amp; Wertgt; 10 -10, Identität &lt;80%, Peptidlänge &lt;20 Aminosäuren) werden verworfen sowie frameshifted und vorzeitiges Stopp-Codon Sequenzen enthält. </li></ol></li></ol> 2. Matrix Gebäude für HT-GPCA HT-GPCA eine Säugerzelle-basierten Test, bei dem beide Erreger und Wirt transient exprimierte Proteine ​​fusioniert sind, um komplementäre Fragmente des geteilten Gaussia princeps Luciferase. Nach Interaktion der Partner wird dieses Enzym rekonstituiert so das Maß der Enzymaktivität. Die Wechselwirkung Intensität wird so von einer normalisierten Lumineszenz-Wert (siehe unten und Abbildung 1) abgeleitet <ol start="4"><li> Auswahl der Wirtszelle Partner <ol><li> Wählen Proteine, die mehr als drei Mal in den Y2H Screenings zur weiteren Validierung in Säugerzellen identifiziert werden, um die Datenmenge Vertrauen 9 erhöhen. </li><li> In bekannten Interaktionspartner der Erreger Proteine ​​als positive Kontrollen. </li></ol></li><li> Übertragen in HT-GPCA kompatiblen Vektoren <ol><li> Klonen jeden Erreger Protein ORF in einer pSPICA-N2 Vektor um Erreger Proteine ​​mit Aminosäuren 110-185 der humanisierten Gaussia princeps Luciferase an ihrem N-Terminus (GL2-Pathogen-Protein-Fusionen) fusioniert zu generieren. </li><li> PCR amplifizieren zelluläre Protein ORF direkt von den Y2H positive Klone oder aus anderen Quellen ORF (Human ORFeome <a href="http://horfdb.dfci.harvard.edu/" target="_blank">http://horfdb.dfci.harvard.edu/</a> ) und sie in pSPICA-N1-Vektoren, Proteine ​​am N-Terminus fusioniert mit erzeugen die Aminosäuren 18 bis 109 der humanisierte Gaussia princeps Luciferase (GL1-Host-Protein-Fusionen). [Tipp: Für großangelegte Klonen, die Gateway-Klonen wird empfohlen. In diesem Fall für die PCR-Amplifikation, verwenden Primer entwickelt, um Gateway-kompatible Websites enthalten]. </li><li> Sequence alle Expressionsvektoren. Sequenzen des pSPICA-N1-N2 und pSPICAkönnen in Bezug 8 gefunden werden. </li></ol></li></ol> Beachten Sie, dass Plasmidkonstrukte umgekehrt werden kann, dh Erreger Proteine ​​in pSPICA-N1-und Host-Protein in pSPICA-N2. 3. High-Throughput Gaussia princeps Luciferase-Based Protein Komplementierung Assay (HT-GPCA) <ol start="6"><li> Zelltransfektion <ol><li> Seed 293T-Zellen bei 350.000 Zellen / ml von DMEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), die kein Antibiotikum. Verteilen Sie 100 ul / Vertiefung in sterile weiße Kultur Platten. Nicht mehr als 10 Platten in einem einzigen Experiment. Lassen Zellen für 24 h wachsen bei 37 ° C mit 5% CO 2. [Tip:. Da die pSPICA Plasmide einen SV40 enthalten, ermöglicht die Verwendung von 293T-Zellen, die die Replikation in transfizierten Zellen und führt so zu Überexpression der beiden Luciferase-Fragmente] </li><li> Am folgenden Tag, transfizierbaren Zellen unter Verwendung eines geeigneten Transfektionsprotokoll. Beachten Sie, dass für bestimmte Transfektionsreagenzien, die nuahl von Zellen ausgesät müssen möglicherweise angepasst werden. Mit 100 ng pro Vertiefung sowohl der Erreger und Wirt ORF Plasmidkonstrukte. Co-Transfektion von 10 ng pro Vertiefung einer von CMV-Glühwürmchenluciferase Plasmid für Transfektionseffizienz zu normalisieren. Jeder Punkt wird in dreifacher Ausführung getestet. [Tip:. DNA Mischungen können den Tag vor der Transfektion durchgeführt werden und bei -20 ° C mit Klebedichtungen] </li><li> Übertragen Transfektionsgemisch zu den Platten kultivierten 293T-Zellen. Seien Sie vorsichtig, um sanft die Hinterlegung der DNA-Gemisch auf die Zellen, wie 293T nicht stark haftend und leicht aus dem Boden des Bohrlochs zu lösen. Inkubation in einer Zellkultur-Inkubator für 24-30 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol></li></ol><ol start="7"><li> Zelllyse und Gaussia Luciferase Dosierung <ol><li> Waschen der Zellen mit PBS (100 ul / well). In 40 ul 1X Renilla Lysepuffer. Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur unter Rühren. </li><li> Sparen Sie 10 ul Zelllysaten in einem anderen weißen plate für die nachfolgende Dosis der Firefly-Luciferase-Aktivität. Lagerung bei 4 ° C oder alternativ bei -20 ° C mit Dichtung. </li><li> Messen Sie die Gaussia Aktivität auf den verbleibenden 30 ul Zelllysaten durch Zugabe von 100 ul Renilla Luciferase Assay-Reagenz und Zählen Lumineszenz für 10 sec mit einem Luminometer. Dosierung einer 96-Well-Platte dauert etwa eine halbe Stunde. Führen Sie eine Messung mit frischem Zellextrakten seit Einfrieren oder Langzeitlagerung Interaktion vermittelte Gaussia Aktivität beeinflussen können. </li></ol></li></ol><ol start="8"><li> Messung der Firefly-Aktivität <ol><li> Messen Sie die Firefly-Aktivität auf die gespeicherte 10 ul Zelllysaten durch Zugabe von 50 ul Firefly Luciferase Assay-Reagenz und Zählen Lumineszenz für 10 sec. Dosierung einer 96-Well-Platte dauert etwa eine halbe Stunde. [Tipp: Die Dosierung der Firefly Luciferase durchgeführt am Tag nach der auf gefrorenen Lysate werden.] </li></ol></li></ol><ol start="9"><li> NLR Berechnungen <ol><li&gt; Für jede Interaktion, wird das Verhältnis zwischen Gaussia Luciferaseaktivität und Firefly Luciferaseaktivität um eine normalisierte Gaussia Lumineszenz Wert unter Berücksichtigung Transfektionseffizienz und die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Berechnen Sie den Mittelwert der dreifach. </li><li> Um die Interaktion zu überwachen, schätzen eine normalisierte Lumineszenz Ratio (NLR) für jedes Pathogen-Wirt-Paar. Um dies zu tun, teilen die normierte Gaussia Lumineszenz-Aktivität in Anwesenheit von Erreger und Wirt-Proteine ​​durch die Summe der Aktivitäten in Kontroll-Wells gemessen (Abbildung 1 von 8 Referenz angepasst) erkannt. Die NLR cut-off Wert für positive Wechselwirkungen wurde geschätzt auf rund 3,5 8 sein. </li></ol></li></ol><ol start="10"><li> Datenanalyse <ol><li> Führen hierarchisches Clustering unter Verwendung der R-Statistik-Paket. Erstens, die Gruppe NLR Daten in Kategorien, berechnen dann eine Interaktion mit Dendrogramms die komplette Verknüpfung Verfahren. Visualisieren Sie dieseDendrogram mit JavaTreeView 10. Berechnen Sie den Abstand zwischen Interaktion Dendrogramm und phylogenetische Baum mit einem Pearson Korrelationskoeffizient. </li><li> Um die Interaktion Netzwerke generieren, wählen Sie die positiven Wechselwirkungen von der HT-GPCA Datenmenge und verwenden Sie die Software Cytoscape 1. Extrahieren Sie den Grad der Host-Proteine ​​und zeichnen ihre Verteilung auf die lokale Dynamik Netzwerk zugreifen. Host-Erreger Netzwerke können an den Host interactome überlagert werden, um eine Beurteilung der globalen Auswirkungen der Erreger Proteine ​​in den Host zellulären Netzwerk bereitzustellen. </li><li> Entpacken Sie die GO (Gene Ontology) Begriffe mit den gezielten zellulären Faktoren mit dem DAVID Bioinformatik Datenbank 12, um die funktionelle Bereicherung des Datensatzes beurteilen verbunden. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Protoc. 4, 44-57 (2009).</li><li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+genotype+comparison+of+human+papillomavirus+E2-host+interaction+networks+provides+new+insights+for+e2+molecular+functions.">Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions.</a> PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).</li><li>Neveu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+virus-host+interactomes+with+a+mammalian+high-throughput+protein+complementation+assay+based+on+Gaussia+princeps+luciferase.">Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase.</a> Methods. , (2012).</li><li>Braun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimentally+derived+confidence+score+for+binary+protein-protein+interactions.">An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions.</a> Nat. 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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Unabhängig, Hefe-Zwei-Hybrid-und Säugetierzellen Interaktionsassays wie GST-Pulldown, LUMIER oder Mappit, haben sich als effektive Werkzeuge, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen sein, aber durch die hohe Rate der falsch-positiven und falsch-negativen beschränkt Wechselwirkungen mit diesen Techniken 15 verbunden. Darüber hinaus ist Beweis wächst, dass die Kombination von orthogonal Verfahren erhöht die Zuverlässigkeit der erhaltenen Wechselwirkung Datensatz 7. Die jüngste Entwick...

Die zunehmende Menge an Daten gesammelt, um Protein-Protein-Wechselwirkung Karten erzeugen öffnet Perspektiven weiter zu verstehen Erreger Infektionen. Als globales Verständnis von pathogenen Infektionen beginnt sich abzuzeichnen, bietet es Zugriff auf den Bereich von Störungen durch Erreger Proteine ​​induziert beim Anschließen des menschlichen Proteoms 1. Es bietet damit einen Weg zu verstehen, wie Krankheitserreger die Wirtszelle Maschinen manipulieren. Insbesondere ergab die Zuordnung von mehreren viralen-Wirt-Interaktion Netzwerke dass virale Proteine ​​bevorzugt Zielrechner Proteine, die stark in das Mobilfunknetz angeschlossen sind (Hubs), oder die von zentraler Bedeutung für viele Pfade in einem Netzwerk (Engpässe Proteine) 2-4 sind. Diese Wechselwirkungen können Viren auf wichtige zelluläre Prozesse zu manipulieren, was instrumental zu replizieren und infektiöse Nachkommen. Vergleichende Wechselwirkungen Mapping wurden kürzlich auf verwandten Viren mit dem Ziel, Informationen bezüglich extrahieren durchgeführtPathogenese 4. Darüber hinaus haben Studien der Wirt-Erreger-Interaktionen Landschaft zu viele Krankheitserreger 5 erweitert. Die gezielte Zellfaktoren Identifizierung bietet Einblicke in die Strategien, die von Pathogenen verwendet, um Zellen zu infizieren und ermöglicht den Nachweis von pathogenen Potential Marker. Die Hefe-Zwei-Hybrid-System ist die beliebteste Methode, um binäre Interaktionen zu identifizieren, da genetisches Screening ist eine effiziente und empfindliches Werkzeug für High-Throughput-Mapping von Protein-Protein-Interaktionen. Der hier vorgeschlagene Ansatz weiter verbessert einzelnen Y2H Screenings durch die Beurteilung ein Protein aus mehreren Krankheitserregern Stammvarianten, um so den Zugang zu einem vergleichenden Überblick über Pathogen-Wirt-Protein-Protein-Interaktionen. Darüber hinaus liegt eine große Einschränkung der Hefe-Zwei-Hybrid-Screening in einem hohen falsch-negative Rate, da sie etwa 20% der gesamten Wechselwirkungen 6 erholt. Dies bedeutet, dass Interaktionen mit nur einer Teilmenge von patho erkanntgens Varianten könnten Erkennung mit den anderen entgangen sein. Daher werden die einzelnen Partner, die aus allen Zwei-Hybrid-Screenings weiter für die Interaktion mit dem kompletten Sortiment der untersuchten Stämme herausgefordert, vergleichende Interaktion Datensätzen. Da wurde gezeigt, dass die Kombination verschiedener Methoden stark erhöht die Robustheit von Protein-Protein-Wechselwirkung Datensätze 7 wird diese Validierung in Säugetierzellen durch ein neu entwickeltes Protein-Fragment Komplementierung Assay genannt HT-GPCA 8 durchgeführt. Diese Zell-basierte System ermöglicht die Detektion von Protein-Interaktionen durch Komplementierung des Gaussia princeps aufgeteilt Luciferase und wurde entwickelt, um die Kompatibilität mit einem Hochdurchsatz-Format. Dank seiner Lumineszenz-basierten Technologie und deren geringem Hintergrundrauschen mit anderen Fluoreszenz-basierten Assay verglichen, zeigt HT-GPCA eine auffallend hohe Empfindlichkeit. Insgesamt stellt dieser Ansatz eine effizienteWerkzeug, um eine umfassende Kartierung von Wirt-Pathogen-Zwischenspiele, die den ersten Schritt in Richtung einer globalen Verständnis der Wirtszelle Entführung repräsentiert.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strains</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal SD base</td>
			<td>US biological</td>
			<td>D9500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>264571000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase</td>
			<td>Seikagaku</td>
			<td>120491</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>31966</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>14190</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>15140</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>25300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renilla luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2820</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655083</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-wellPCR plates</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4t-i0730/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (30 &deg;C)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &deg;C)</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>Centro XS-LB 960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a comparative approach to characterize the landscape of host-pathogen protein-protein interactions

Erhebliche Anstrengungen wurden versammelt, um groß angelegte umfassende Protein-Protein-Interaktion Netzwerk Karten zu erzeugen. Dies ist maßgeblich auf die Erreger-Wirt-Beziehungen verstehen und wurde im Wesentlichen durch genetische Screenings in Hefe-Zwei-Hybrid-Systemen durchgeführt. Die jüngste Verbesserung der Protein-Protein-Wechselwirkung Erfassung durch einen Gaussia Luciferase-basierte Fragment Komplementierung Assay bietet nun die Möglichkeit, integrative Ansätze notwendig vergleichende interactomic entwickeln konsequent vergleichen Interaktion Profile von Proteinen aus verschiedenen Erreger Stammvarianten gegen einen gemeinsamen Satz von zellulären Faktoren. Dieses Dokument konzentriert sich insbesondere auf die Nützlichkeit der Kombination von zwei orthogonalen Methoden zur Protein-Protein-Wechselwirkung Datensätzen zu generieren: Hefe Zwei-Hybrid (Y2H) und eine neue Assays mit hohem Durchsatz Gaussia princeps Protein Komplementations-Assay (HT-GPCA) in Säugetierzellen durchgeführt. nt &quot;&gt; Eine groß angelegte Identifizierung zellulärer Partner eines Erregers Protein wird durch Kreuzen-basierten Hefe-Zwei-Hybrid-Screenings von cDNA-Bibliotheken mit mehreren Erreger Stammvarianten durchgeführt. Eine Teilmenge der interagierenden Partner auf einem High-Vertrauen statistischen Scoring ausgewählt ist weiter validiert in Säugerzellen für paarweisen Interaktionen mit dem ganze Reihe von Varianten Erreger Proteine ​​mit HT-GPCA. Diese Kombination aus zwei komplementären Methoden verbessert die Robustheit der Interaktion Datenmenge und ermöglicht die Durchführung einer strengen vergleichende Analyse Interaktion. Solche vergleichende Interactomics bilden eine zuverlässige und leistungsstarke Strategie zu entziffern irgendwelche Erreger-Wirt-Wechselspiel.

Eine große Stärke von HT-GPCA liegt in seiner hohen Empfindlichkeit, durch die Bewertung der falsch-positiven und falsch negativen Ergebnisse für die HPV E2-Protein in Abbildung 2 (nach Lit. 13) dargestellt. Um die falsch-negative Rate zu bestimmen, wurden von bekannten Wechselwirkungen von HPV16 E2 von HT-GPCA (2A) beurteilt. Vier von 18 Wechselwirkungen wurden nicht wiederhergestellt (entspricht einer 22% falsch-negative Rate). Die falsch positive Interaktionen wurden gemessen, um ...

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A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Dieser Artikel konzentriert sich auf die Identifizierung von High-Interaktion zuversichtlich Datensätze zwischen Wirt und Pathogen-Proteine ​​mit einer Kombination aus zwei orthogonal Methoden: Hefe-Zwei-Hybrid von einem High-Throughput-Assay Interaktion in Säugerzellen namens HT-GPCA gefolgt.

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

a-comparative-approach-to-characterize-landscape-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.1K Aufrufe.  Institut Pasteur. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Identifizierung von High-Interaktion zuversichtlich Datensätze zwischen Wirt und Pathogen-Proteine ​​mit einer Kombination aus zwei orthogonal Methoden: Hefe-Zwei-Hybrid von einem High-Throughput-Assay Interaktion in Säugerzellen namens HT-GPCA gefolgt.

Serie: A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to facilitate cross-presentation of chaperoned antigens and elicit innate and adaptive T cell responses. Xenopus skin graft rejection provides an excellent platform to study the ability of gp96 to elicit classical MHC class Ia (class Ia) restricted T cell responses. Additionally, the Xenopus model system also provides an attractive alternative to mice for exploring the ability of gp96 to generate responses against tumors that have down-regulated their class Ia molecules thereby escaping immune surveillance. Recently, we have developed an adoptive cell transfer assay in Xenopus clones using peritoneal leukocytes as antigen presenting cells (APCs), and shown that gp96 can prime CD8 T cell responses in vivo against minor histocompatibility skin antigens as well as against the Xenopus thymic tumor 15/0 that does not express class Ia molecules. We describe here the methodology involved to perform these assays including the elicitation, pulsing and adoptive transfer of peritoneal leukocytes, as well as the skin graft and tumor transplantation assays. Additionally we are also describing the harvesting and separation of peripheral blood leukocytes used for flow cytometry and proliferation assays which allow for further characterization of the effector populations involved in skin rejection and anti-tumor responses.

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

The frog Xenopus laevis provides an attractive alternative non-mammalian model for exploring the ability of heat shock protein such as gp96 to promote antigen-specific CD8 T cell responses. We present methods to study in vivo facilitation of cross-presentation of skin and tumor antigens by gp96.

Vergleichende In vivo Studium der gp96 Adjuvantizität in the Frog Xenopus laevis</em

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phage Phenomics: Physiologische Ansätze zur Charakterisierung Novel virale Proteine

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Retrovirale Transduktion von T-Helferzellen als genetischer Ansatz zur Untersuchung Mechanismen der Kontrolle ihrer Differenzierung und Funktion

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Ein Protokoll zur Charakterisierung der morphologischen Veränderungen von<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In Antwort auf Antibiotika-Behandlung

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Infektion von Zebrafischlarven mit Aspergillus Sporen zur Analyse von Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

Etikettenfreier quantitativer Proteomik-Workflow für Discovery-gesteuerte Host-Pathogen-Interaktionen

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...