Wir danken S. Burkhart, C. Hofmann und Simone Gräßle für hervorragende technische Unterstützung und sind dankbar, dass M. Ferg für die Hilfe bei der Datenanalyse. Wir danken auch S. Rastegar für kritische Kommentare zum Manuskript. Wir erkennen die Finanzierung der Studienstiftung des deutschen Volkes (MW), der DFG (DI913/4-1) und der Helmholtz-Programm BioGrenzflächen am KIT.

1. Bereiten Arbeitsverdünnung der chemischen Bibliothek Vorzuverdünnen die Verbindungen der Drogen Bibliothek getestet werden (z. B. FDA zugelassenen Medikamente, Enzo Life Science) in E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2) mit einem Roboter-Liquid-Handling-Station (zB Multiprobe II, 8 Nadeln mit Entsorgung Spitzenadapter, PerkinElmer). Geeignete Konzentrationen sind z. B. 40 &amp;mgr; g / ml in 3% DMSO, aber dies hängt von der Art der verwendeten Bibliothek ab. Die Multiprobe II Einstellungen entsprechend den unten beschriebenen Schritte sind in Tabelle 1 angegeben. Die in der Tabelle beschriebenen Protokoll ermöglicht die Herstellung von vier Aliquots Platten parallel. <ol><li> Je 10 ul Aliquots der Materialbibliothek (2 mg / ml in DMSO) in Deep-Well-Platten (z. B. 96-Well-Platte Aufbewahrung, Rund Nun, 0,8 ml, ABgene). Spalten 1 und 12 sollte leer gelassen werden - diese werden die positiven und negativen Kontrollen innerhalb Platte erhalten. </li><l<html> i&gt; Dispense 490 ul der E3 mit 1% DMSO in die vorbereiteten Teilmengen der Bibliothek mit der Multiprobe II. Die Verdünnung wird mit festen Nadeln ohne Entsorgungs Tipps durchgeführt. </li><li> Werden 10 ul DMSO in die Säule 1 und 10 ul einer 5 mM Dexamethason-Lösung (in DMSO) auf Spalte 12, wie in Platte steuert. Die DMSO-Konzentration in allen Vertiefungen nun 3%, die Dexamethason-Konzentration in den positiven Kontrollvertiefungen 100 uM in E3 / 3% DMSO. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit DMSO beständigen Klebstoff Dichtungsbahnen. Speichern die Platten bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Zucht von Fisch-Reporter Sammle Embryonen aus natürlichen Laich der Gruppe Paarungen zwischen GRE: Luc transgene Fische. Heben Embryonen (nicht mehr als 60) in 9 cm Petrischalen mit E3-Medium mit 1 mg / ml der Methylenblau Fungizid ergänzt bis 4 Tage nach der Befruchtung (dpf) in einem Brutschrank bei 28 ° C. Ändern E3 Medium regelmäßig. Titel &quot;&gt; 3. Vorbereitung der Luciferase-Medium (E3L) Bereiten Sie eine wässrige Lösung von Luciferin Lager 50 mM durch Zugabe von dH 2 O, um das Fläschchen mit dem Luciferin Pulver. Diese Stammlösung kann bei -80 ° C für mehrere Monate gelagert werden. Verdünnen Sie die Luciferin Lager in E3 Medium zu einer Endkonzentration von 0,5 mM bis E3L Medium zu erhalten. 4. Verteilen Larven in 96 Well Platten <ol><li> Bereiten 1 ml Pipettenspitzen mit breiten Bohrung durch Abschneiden von etwa 5 mm von der Spitze und kurz flamm die scharfen Kanten. </li><li> Pool Larven mehrere Kreuze durch vorsichtiges Gießen sie von den Petrischalen in ein Becherglas. Ernte etwa 50 Larven in einer Zeit, indem Sie vorsichtig gießen sie auf ein Sieb (Porengröße von 0,25 mm Durchmesser) und sofort legen Sie das Sieb in eine kleine Petrischale (Durchmesser 5,5 cm) mit E3L Medium gefüllt ist. </li><li> Mit einer großen Bohrung Pipettenspitze, Transfer 225 ul Medium, das jeder eine Larve in die Vertiefungen eines weißen96-Well-Platte (Optiplate, PerkinElmer). </li><li> Verschließen Sie die Platten mit Klebedichtungsbahnen (zB TopSeal-A, PerkinElmer) und inkubieren sie bei 28 ° C über Nacht. Diese Vorinkubation verhindert Aufzeichnung von transienten Änderungen der Biolumineszenz unmittelbar nach der Zugabe von Luciferin, ein Phänomen, das auch in kultivierten Zellen 19 auftritt. </li></ol> 5. Drug Treatment <ol><li> Entfernen Sie die Platte mit der Arbeitsverdünnung der Bibliothek aus dem -80 ° C Gefrierschrank ca. 4 Stunden vor dem Gebrauch. Die Platte vorsichtig vortexen und kurz drehen Sie es in einer Zentrifuge, um die Flüssigkeit am Boden der Platte zu sammeln. </li><li> Entfernen Sie die Klebedichtungsbahnen aus den Larven Platten. </li><li> Mit einer handbetriebenen 96-Kanal-Pipettieren Gerät (zB Liquidator, Steinbrenner) pipettieren die Wirkstofflösung nach oben und unten 3 mal. Dann aliquotiert 25 ul der Arbeitsverdünnung des chemischen Bibliothek in die Vertiefungen mit den Larven (mit dem Beispiel oben, diesezu einer Endkonzentration von 4 ug / ml in E3 mit 0,3% DMSO). Bereiten 10 (Minimum: 5) Replika-Platten mit Larven pro Bibliothek Platte. </li><li> Verschließen Sie die Platten mit den Klebedichtungsbahnen und beschriften Sie jede Platte mit einem Barcode-Aufkleber. </li></ol> 6. Lumineszenz-Aufnahme <ol><li> Setzen Sie die Platten, die die Larven in die Stapeleinheiten eines EnVision Biolumineszenz Leser mit verstärkten Lumineszenz-Empfindlichkeit (PerkinElmer). Alternativ können Sie einen Roboter-Inkubator System wie die für Säugetierzellkultur-Screening-Systeme in Kombination mit dem Leser beschäftigt. </li><li> Rekord Biolumineszenz für zwei Tage mit Leser-Einstellungen analog zu den in Tabelle 2 für die EnVision Leser beschrieben. Passen Sie die Anzahl der Test wiederholt, um die Anzahl der Platten in der Flucht, um die erforderliche Laufzeit entsprechen. </li><li> Nach dem Ende des Laufs, überprüfen Sie die Platten auf das Vorhandensein von toten Larven auf allgemeine Toxizität der Layout-Datei bewertenounds. </li></ol> 7. Datenanalyse Alle Daten-Analyse ist in der statistischen Programmierumgebung R mit eigenen Scripts durchgeführt. <ol><li> AUC-Berechnung Zur Herstellung von Verbindungen der Aktivierung GC Signalisierung unabhängig von ihrer kinetischen Eigenschaften zu identifizieren, die Fläche unter der Kurve (AUC) der aufgezeichneten Spuren Lumineszenz (Biolumineszenz rohen Zählungen gegen Zeit) als die Parameter-Screening. AUC mit der Trapezregel (siehe 2a und a &#39;) angenähert. </li><li> Normalisierung Log-Transformation die AUC-Werte, um einen höheren Normalität der Daten (Fig. 2b und b &#39;) zu gewährleisten. Dann normalisieren die Log-transformierten AUC-Werte für jede Bibliothek Platte mit der robusten Z-Score-Methode (siehe 20). Diese Normalisierung führt zu Werten, die die Anzahl von Standardabweichungen von dem Mittelwert von allen Datenpunkten. Auf diese Weisesystematische Fehler, wie interLaufSchwankungen, aus den Daten entfernt. Die Daten können nun durch Auftragen der mittleren robuste Z-Score der Replikate für jede Vertiefung (2c und c &#39;) visualisiert werden. </li><li> Qualitätsmetriken <ol><li> Heatmap Um Platte bedingte Effekte sichtbar zu machen, zeichnen die Daten für jede Platte als Heatmap zB mit dem heatmap.2 Funktion des gplot Paket 21. Auf diese Weise können Randeffekte oder Verbindung Verschleppung leicht erkannt werden (zB vgl. Abb. 3a mit 3b). Ausschließen suboptimalen Platten von der weiteren Analyse. </li><li> ROC-Kurve Um zu bestimmen, Empfindlichkeit und Spezifität des Tests zu berechnen eine Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve z. B. mit Hilfe der ROC Bioconductor Paket 22 mit den in 7.2 (3c) bestimmt Z-Punktzahlen. Anschließend bestimmen die AUC von diesem curve. Ein AUC-Wert nahe 1 zeigt eine hohe Sensitivität und Spezifität des Assays. </li></ol></li><li> Hit-Identifizierung Um den Cut-off-Wert für die Identifizierung der Wirkstoffe zu optimieren, bestimmen die Youden Index. Um den Index zu berechnen, subtrahieren Sie die geschätzte wahre Positive-Rate (TPR) von der falsch positiv Rate (FPR) der ROC-Kurve für die Erhöhung robuste Z-Score-Cut-off-Werte. Nehmen Sie die robuste Z-Score mit der höchsten Youden Index (TPR minus FPR) als Cut-Off-Punkt. Der TPR / FPR kann durch den Nachweis der positiven Kontrolle Brunnen oder von bekannten Wirkstoffen innerhalb der Bibliothek geschätzt werden. Bei der Verwendung von positiven Kontrollvertiefungen stellen Sie sicher, dass sie die erwarteten Hit Stärke entsprechen. </li></ol> 8. Wiederholungsprüfung <ol><li> Neu zu bewerten positive Hit Verbindungen, die durch die Behandlung von Larven mit seriellen Verdünnungen der von einem anderen Anbieter erhaltenen Verbindungen mit der gleichen Recording-oben beschrieben. Echte Hits sollte ein Lumineszenz induzierenlso in diesem Assay im Idealfall in einer dosisabhängigen Weise. </li></ol>

<ol>
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Wir haben nichts zu offenbaren.

Wir präsentieren hier die Workflow-und Datenanalyse für eine chemische Bildschirm messen GC-Aktivität in vivo-Assay mit der Grizly 18. Der Test hat die Qualitätskontrolle Eigenschaften und Performance-Maßnahmen, die vergleichbar mit herkömmlichen Zell Basis-Bildschirme sind, ein wichtiger Vorteil für den Einsatz im Hochdurchsatz-Einstellungen. Außerdem erkennt jedoch, die in-vivo-Assay auch Verbindungen, die nicht zugänglich sind, in vitro Screens sind. Dies wird durch die Anwesenheit der Prohormon Pregnenolon unter den Hits veranschaulicht. Somit ist die Grizly Assay erweitert den Anwendungsbereich der Bildschirme im GC Signalaktivität ab. Die Bedeutung der Erfassung von in vivo-Wirkungen mit unserem Test wird auch durch Ergebnisse, die wir mit dem Organozinn Schadstoffe DBT und TBT 18 dargestellt erhalten. DBT, aber nicht TBT, hat sich gezeigt, GC-Signalisierung in Säugerzellkultur zu hemmen, und man beobachtet die gleichen in Zebrafischzellkulturen auszudrückenING Das GRE: Luc Reporter. Wichtig ist jedoch bei der Grizly Assay zeigte TBT inhibitorische Aktivität auf die GC-Weg, da es zu DBT durch die Larven Metabolismus umgewandelt werden. Diese Hemmung war bereits bei umweltrelevanten Konzentrationen von TBT beobachtet. Diese Ergebnisse veranschaulichen weiter das Potential der Grizly Assay in Verbindung Erfassen Wirkungen auf der Basis zwischenOrganÜberSprechen und metabolischen Veränderungen der Verbindungen im lebenden Tier. Sie heben auch das Anwendungspotenzial der Grizly Assay für die Umweltüberwachung. Somit kann endokrin Wirkungen auf der Ebene der Rezeptor-Signalisierung, wobei die Unterbrecher stört GC Signalaktivität durch eine GR-Agonisten, wie Dexamethason induziert sucht werden. Eine andere Möglichkeit ist es, Verbindungswirkungen Pregnenolon-stimulierte Synthese GC studieren. Der hohe Durchsatz Qualität des Tests sollte ein schnelles Screening von Umwelt Sample-Bibliotheken zu ermöglichen. Die Verwendung von Luciferase als areporter Gen ermöglicht eine hohe Dynamik der Erkennung von Signalaktivität 23. Tatsächlich ist die Empfindlichkeit des Tests ist es möglich, osmotischer Stress-induzierte Produktion von einzelnen GC Larven 18 zu erfassen. Die hohe zeitliche Auflösung mit der Luciferase-Reporter erreicht ermöglicht es uns, Signalaktivitäten über die Zeit, die es ermöglichen, analysieren auch die Kinetik der Daten ist zu folgen. Ein möglicher Nachteil für einige Anwendungen ist die begrenzte Eignung für die räumliche Überwachung dieses Reportersystem. Fluoreszierende Reportersysteme könnten für Tests und Überwachung bestimmter Bereiche der Larven benötigen besser geeignet sein. Jedoch können solche Assays von niedriger Empfindlichkeit aufgrund von Hintergrundeffekten durch das Anregungslicht, das auch stellt Grenzwerte für die Detektion von fluoreszierenden Verbindungen erleiden. Darüber hinaus könnte sie weniger kinetische wegen der allgemein höheren Stabilität von fluoreszierenden Proteinen 23 zu liefern.Darüber hinaus präsentieren sie Herausforderungen in Bezug auf Bildausrüstung, Datenanalyse und Datenspeicherung, die ihre Verwendung für kleinere Forschungslabors einschränken könnten. Das Set-up des Grizly Test, wie einer Mikrotiterplatte basierten Assay ermöglicht die einfache Integration in typische Screening-Workflows. Der Test ist auch in kleineren Forschungslabors durch seine einfache Handhabung und Datenanalyse leicht anwendbar. Gleichzeitig ermöglicht sie ein hohes Maß an Automatisierung, Drogenanwendung durch Pipettieren Roboter oder automatisierte Verteilung von Embryonen durch Embryo Sortiervorrichtungen 24,25 zB automatisiert. Die einfache Anzeige erfordert keine automatisierten Screening-Mikroskopen oder anspruchsvolle Bildanalyse-Software, bietet aber einen umfassenden Satz von Daten über die zeitlichen und quantitativen Aspekte der untersuchten Signalweges. Zusammenfassend stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für eine relativ kostengünstig, robust und einfach zu handhabendes chemisches Screening Assay für GCSignalaktivität in vivo und in Echtzeit. Der Assay erlaubt die Bestimmung der in vivo-Wirkungen von Verbindungen auf GC nicht nachweisbar Signalisierung in Zellkultur-Assays. Unter den vielen Anwendungen für den Test sind z. B. die Bestimmung der genetischen Auswirkungen auf die Glukokortikoid-Signalisierung, die Umweltüberwachung von endokrinen Disruptoren Auswirkungen auf die Glukokortikoid-Synthese und Signalaktivität, und das Screening von Verbindungen für die unerwünschte Auswirkungen auf GC-Signalisierung oder für neue in-vivo-Modulatoren von dieser wichtigen Signalweg.

Glukokortikoide (GCs) sind Steroidhormone durch die Nebenniere, die bei der Stressantwort und in der Regulation des Stoffwechsels eine wichtige Rolle spielen 1 produziert. GCs binden zytoplasmatischen Glucocorticoid-Rezeptoren (GRs) des Kernrezeptor-Superfamilie, die bei der Bindung, Translokation in den Kern 2. Hier können sie zum Beispiel die Transkription durch Eingriffe mit anderen Transkriptionsfaktoren (Transrepression) oder aktivieren Gen-Transkription über Glucocorticoid-Response-Elemente (GREs, Trans). Aufgrund ihrer anti-inflammatorischen Eigenschaften werden sowohl natürliche als auch künstliche GCs in der Behandlung einer Reihe von Krankheiten, wie Asthma oder Arthritis 3 verwendeten Medikamente. Allerdings können vor allem langfristige Nutzung von GCs zu schweren Nebenwirkungen führen, einschließlich Diabetes und Glaukom-4. Daher werden neue Verbindungen gezielt GC-Signalisierung mit potentiell vorteilhafte Behandlung Effizienz und Verträglichkeit sehr begehrt achternäh. Wichtig ist, dass in kultivierten Zellen beobachtet Ligandeneffekte von den in-vivo-5 gesehen unterscheiden. Solche Effekte könnten Befunden mit konventionellen Zellkultur erhalten Pharma-Screening-Assays. Chemische In-vivo-Screening, wie durch die Zebrafisch-Modell aktiviert wurde vor kurzem in den Fokus gerückt, da es erlaubt die Bestimmung der Auswirkungen nicht in der Zellkultur 6,7 nachweisbar. Hormonelle Signalwege kann auch durch Umweltschadstoffe beeinträchtigt werden. So genannte endokrin wirksame Substanzen (EDC) beeinflussen verschiedene Hormon reguliert Prozesse 8. So kann die Wiedergabe und sexuelle Differenzierung von Wasserorganismen durch Substanzen mit Östrogen-ähnliche Aktivitäten moduliert werden. Kürzlich wurden Bedenken laut, dass Stoffwechselstörungen könnten EDZ in der Umwelt 9 verbunden werden. Ein Weg durch solche &quot;Stoffwechselstörungen&quot; gezielte ist der Glucocorticoid-Weg, der auch in xeno gebracht wurdeAntibiotika Auswirkungen auf die Entwicklung und Funktion des Immunsystems 10,11. Doch im Vergleich mit der großen Menge an verfügbaren Informationen über Verbindungen stören Sexualsteroidhormonwirkung, relativ wenig über Störungen des Hormonhaushalts über die GR-vermittelte bekannt. Daher Werkzeuge benötigt werden, die Auswirkungen auf die Überwachung von Schadstoff GC-Signalisierung in vivo ermöglichen. Der Zebrafisch ist seit langem ein beliebtes Modell in der Entwicklungsbiologie und hat vor kurzem zog auch Forscher aus anderen Bereichen, einschließlich Endokrinologie 12. Im Vergleich zu anderen Knochenfischen, ist die GC-Signalisierungssystem des Zebrafisches, das jenem von Säugetieren, da die Zebrafisch-Genom enthält nur eine GR-Gens im Gegensatz zu den duplizierten Rezeptoren in vielen anderen Fischarten 13-15. Darüber hinaus ist der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse bereits funktional in 5 Tage alten Zebrafischlarven, die endogene GC-Produktion als Reaktion auf Stressoren erhöhen 14,16-18. Wir haben kürzlich erzeugten eine transgene Zebrafisch-Linie, GRE: Luc, die für die Überwachung der GC-Signalaktivität in vivo und in Echtzeit 18 ermöglicht. Die Leitung ein Luciferase-Reportergen-Konstrukt unter der Kontrolle eines minimalen TATA-Box-Promotor und vier concatemerized GRE (Abbildung 1a). GC-induzierte Biolumineszenz können zwischen Einzel-GRE gemessen werden: Luc Larven in 96-Well Mikrotiterplatten in vivo über längere Zeiträume. Diese Grizly Test (für &quot;Glucocorticoid Responsive In-vivo-Zebrafisch-Luciferase-Aktivität&quot;) in einer Reihe von verschiedenen Forschungsfeldern, wie beispielsweise Stressforschung, Umweltüberwachung, Bildschirme und pharmakologische 18 verwendet werden. Wir waren in der Lage, die körpereigene Cortisol-Anstieg nach der osmotischen Stress von einzelnen Larven erkennen und könnte die Reifung der Reaktion während der Entwicklung zu folgen. Außerdem konnten wir die Wirkungen von GC Signalisierungs zinnorganischer überwachens, die Metabolisierung von der Larve erfordern. Wichtig ist, war die Linie in der Lage, diese Effekte bei umweltrelevanten Konzentrationen zu erkennen. Schließlich wird in einem Pilot Bildschirm der Test sensitiv und spezifisch nachgewiesen Verbindungen mit GC-Aktivität aus einer chemischen Bibliothek, darunter eine Verbindung, die körpereigene Cortisol-Produktion in den Larven stimuliert. Hier beschreiben wir ein ausführliches Protokoll für die chemische-Bildschirme mit der Grizly-Assay.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buffer composition + reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDA approved drug library</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-2841-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiprobe II</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>8 channel, equipped with disposable tip adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquidator 96</td>
			<td>Steinbrenner Laborsysteme</td>
 <td></td>
			<td>hand-operated 96-channel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision XCite Multilabel Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with stacker automation, temperature control, barcode reader and enhanced luminescence detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasticware + consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Storage Plate</td>
			<td>ABgene</td>
			<td>AB-0765</td>
			<td>round well, 0.8 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover films,</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>6018412</td>
			<td>self adhesive, DMSO resistent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Steinbrenner Laborsysteme</td>
			<td>LRF-200L</td>
			<td>for liquidator 96, 200 &#956;l, low retention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TopSeal-A</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPlate-96</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005299</td>
			<td>white opaque 96-well microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode Labels</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1608182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered polypropylene IsoTip pipette tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>S058.4809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRE:Luc fish</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ZDB-TGCONSTRCT-120920-1</td>
			<td>available at the European Zebrafish Resource Centre EZRC, Karlsruhe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chemical screening procedure for glucocorticoid signaling with a zebrafish larva luciferase reporter system

Glucocorticoid Stresshormone und deren Derivate sind künstliche häufigsten verwendeten Medikamente zur Behandlung von Entzündungen, aber langfristige Behandlung mit Glukokortikoiden kann zu schweren Nebenwirkungen führen. Testsysteme benötigt werden, um neue Verbindungen zu beeinflussen Glucocorticoid-Signalisierung in vivo zu suchen oder um unerwünschte Wirkungen von Verbindungen auf die Glucocorticoid-Signalweg zu bestimmen. Wir haben eine transgene Zebrafisch-Test, der die Messung von Glukokortikoid-Signalaktivität in vivo und in Echtzeit ermöglicht gegründet, die Grizly-Assay (Glucocorticoid Responsive In-vivo-Zebrafisch-Luciferase-Aktivität). Die Luciferase-Assay weist basierend Auswirkungen auf die Glukokortikoid-Signalisierung mit hoher Sensitivität und Spezifität, einschließlich der Effekte durch Verbindungen, die Metabolisierung verlangen oder beeinflussen endogene Glucocorticoid-Produktion. Wir stellen Ihnen hier eine detaillierte Protokoll für die Durchführung chemischer Bildschirme mit diesem Test. Wir beschreiben die Datenerfassung, Normalisierung undAnalyse, indem ein Fokus auf Qualitätskontrolle und Datenvisualisierung. Der Assay stellt eine einfache, zeitaufgelösten und quantitative Anzeige. Sie kann als Stand-Alone-Plattform betrieben werden, sondern ist auch einfach in Hochdurchsatz-Screening Abläufe integriert. Es ermöglicht darüber hinaus für viele Anwendungen, die über chemische Screening, wie die Umweltüberwachung von endokrine Disruptoren oder Stressforschung.

In einer früheren Publikation 18, abgeschirmt wir eine Bibliothek von 640 FDA zugelassenen Medikamente in einer Pilot-Bildschirm, um die Leistung des Grizly Assay zu beurteilen. Diese Bibliothek enthielt 12 bona fide GCs, was es uns ermöglicht, Qualitätsmaßnahmen für die Sensitivität und Spezifität des Assays zu bestimmen. Abbildung 2 zeigt typische Beispiele für die Roh-Daten-Analyse und Normalisierung von diesem Bildschirm genommen. Ein typisches Ergebnis einer Dexamethason-Kontrollvertiefung ist in Fig. 2a dargestellt ist, veranschaulicht die Zeitinformation von den Daten. Ein Höhepunkt in Biolumineszenz, die bei etwa 12 Stunden nach der Behandlung erfolgt langsam über den folgenden 36 Stunden der Messung. Abbildung 2a &#39;unterstreicht die Annäherung der AUC-Wert mit der Trapezmethode ab. Diese Berechnung wird für alle Brunnen und jedes technische Wiederholung durchgeführt. Das Ergebnis der Log-Transformation ist in Fig. 2b &lt;gezeigten/ Strong&gt; und b &#39;. Hier ist der Mittelwert der positiven Kontrollen sind in einem normalen QQ-Plot aufgetragen. Log-Transformation führt zu einer größeren Angleichung der Datenpunkte auf den theoretischen normal verteilten Werte mit den roten Diagonalen angegeben. Eine Transformation zur Normalität der Daten zu erreichen erhöht die statistische Aussagekraft der nachfolgenden Analysen. Schließlich 2c und 2c &#39;zeigen die Wirkung von robusten Z-Score-Normalisierung auf Platte zu Platte Variabilität: Die mit verschiedenen Platten (2c) erhalten unterschiedliche Ausgangswerte normalisiert in der robusten Z-Score-Diagramm in Abbildung 2c&#39;. Die robuste Z-Score-Werte können verwendet werden, um systematische Fehler in den Daten durch die Visualisierung der Verteilung der Treffer auf den Platten zu identifizieren. 3A zeigt ein Beispiel eines heatmap der Bibliotheksplatte, bei der die robuste Z-Score values aufgetragen sind gut in die Positionen farblich gekennzeichnet. Eine leicht identifiziert Spalte 12 mit den in-Platte positiven Kontrollen. Positive Scoring-Verbindungen sind in der Bibliothek gut gesehen und F8, wenn auch schwächer, E2. 3b zeigt eine Platte, in der ein systematischer Fehler vorliegt. Man beobachtet eine Reihe von Verbindungen mit abnehmender Z-Score-Werte in den Zeilen A und E über mehrere Spalten. Keine der Verbindungen in diesen Vertiefungen wurde in der Re-Test positiv getestet. Da die Vertiefungen mit diesem abnehm Grizly Testaktivitäten sind auf dem Weg, wenn die Aliquotierung Bibliotheksplatten der Pipettier-Roboter nimmt platziert, ist dieses Muster anzeigt Verschleppung von einer positiven Verbindung während des automatisierten Pipettieren. Die robuste Z-Score-Normalisierung zusammen mit der Anwesenheit von bekannten GCs in der Bibliothek konnten wir auch einen receiver operating characteristic (ROC)-Kurve für den Bildschirm 18 zu berechnen. Abbildung 3c zeigt eine Darstellung der geschätztengepaart richtig positiv Kurs gegenüber dem geschätzten falsch positiv Rate für verschiedene robuste Z-Score-Cut-off-Werte. Die geschätzte wahre positive Satz wird als Prozentsatz der richtig positiven Treffern (hier die in der Bibliothek vorhanden bekannt Glucocorticoide), die zu einem bestimmten robuste Z-Score-Cut-off-Wert gefunden werden, definiert. Die geschätzten False Positive Rate zeigt an, der Anteil der nicht-positive Verbindungen zu diesem Cut-off-Wert getroffen. Die AUC von dieser Kurve ist 0,95, was auf eine hohe Sensitivität und Spezifität des Bildschirms und hervorragende Testergebnis. Die AUC-Kurve wurde auch verwendet, um die optimale Cut-off-Wert für Hit-Identifizierung durch Berechnung der Youden Index für verschiedene robuste Z-Werte zu schätzen. Wir identifizierten die robuste Z-Score von 1,49, wie mit der höchsten Youden Index. Dieser Cut-off-Wert ist in Abbildung 2c &#39;als schwarze Linie trennt die Hits aus der Masse der Verbindungen angezeigt. In unserem Bildschirm18, waren wir in der Lage, nahezu alle bekannten in der Bibliothek vorhanden GCs zu identifizieren. Nur drei der 12 bona fide GCs wurden nicht nachgewiesen. Im Fall von Melengestrolacetat, war dies ein falsches negatives Ergebnis, da diese Verbindung Positiv in der Wiederholungsprüfung in einer höheren Konzentration als die in der Bibliothek verwendet. Die beiden anderen GCs waren auch in der Re-Test negativ. Corticosteron ist die Haupt GC in Nagetieren, aber nicht in Menschen, Fischen oder 1, wobei die Prodrug Prednison vielleicht nicht gut durch die Larven System metabolisiert werden. Interessant ist, dass auch zwei Medikamente nicht als GCs kommentierte wurden auf dem Bildschirm identifiziert, von denen man nicht in der Re-Test (Spironolacton, ein Mineralokortikoid-Rezeptor-Antagonist) bestätigt werden. Die andere Verbindung, Pregnenolon ist ein Vorläufer in Steroid-Biosynthese, die Cortisol durch die Nebenniere umgewandelt wird. Tatsächlich Behandlung mit Pregnenolon stimuliert Cortisol-Produktion in der 18 Larven. Alle diese Ergebnisse bestätigen die hohe performance des Tests: nur eine falsch negative und falsch positive Verbindung ein gehörten zu den primären Bildschirm Ergebnisse, und 10 der 11 bestätigte Verbindungen mit GC-Signalisierung stimulierende Aktivität wurden bereits in der primären Bildschirm identifiziert. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50439/50439fig1.jpg" /> Abbildung 1. Allgemeines Prinzip des Assays und Arbeitsfluss des Screening-Verfahren. A) Schema der Grizly Assay Reporter-Konstrukt. Luciferase (gelb) Expression von einem minimalen Promotor (P min, orange) und vier concatemerized GRE Elemente ((GRE) 4, weiß), die durch Liganden-aktivierten GR Homodimere gebunden sind (GR, Blau) gesteuert wird. Rote Felder zeigen Tol2 Transposase Websites, die Integration des Konstrukts in das Genom zu erleichtern. Die rosa Box stellt eine Polyadenylierungsstelle (pA). Transgene Larven Durchführung dieses VerStruktur sind in opaken Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen für Biolumineszenz-Messungen gelegt. b) Schema des Luciferase-Reaktion. Luciferase katalysiert die Oxidation von Luciferin zu Oxyluciferin, was zu Lichtemission (hv) führt. Die Reaktion erfordert auch ATP und Mg 2 +, die von der Larve zur Verfügung gestellt wird. PP i, Pyrophosphat. C) Arbeitsablauf auf dem Bildschirm. Arbeitsstamm Verdünnungen werden hergestellt aus einer von der FDA zugelassene Medikament Bibliothek in 96-Well-Platten, einer Säule, die eine negative innerhalb Plattenkontrolle (DMSO nur, grün) und eine Spalte, die eine positive Kontrolle (Dexamethason, rot) (Bibliothek Design). GRE: Luc Larven werden in 96-Well-Platten verteilt (5-11 Wiederholungen) und mit den Bibliotheks Verbindungen (Drug Application) behandelt. Biolumineszenz Spuren sind mit einem Biolumineszenz-Leser für zwei Tage (Datenerhebung) aufgezeichnet. Biolumineszenz Spuren sind integriert (AUC Berechnungen), melden Sie sich transformiert und robuste Z-Score normalisiert (Normalisierungrung). Normierte Daten werden für die Ermittlung und Qualitätsmetriken für Hit-Identifizierung (Datenanalyse) verwendet. Gewählt Treffer werden für dosisabhängige Aktivität im Test (Retest) erneut getestet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50439/50439fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50439/50439fig2.jpg" /> 2. Datenanalyse dargestellt mit Daten aus einem Bildschirm eine FDA zugelassene Medikament Bibliothek. a) Vertreter Spur von einem positiven Steuer gut. a &#39;) Die Fläche unter der Kurve (AUC) mit der Trapezregel angenähert. Die für die Berechnung verwendeten Trapeze in verschiedenen Schattierungen von rot dargestellt. B) Normal-QQ-Plot von Roh-AUC-Werte der Positivkontrolle Brunnen (y-Achse) im Vergleich zu einem Standard-Normalbevölkerung (x-Achse) vor dem Log-Transformation. B &#39; )<html> Normale QQ-Plot der AUC-Werte nach Log-Transformation. Eine Normalverteilung wird durch die Linearität der Log-transformierten Datenpunkte angezeigt. C) Plot von log verwandelt Rohdaten für alle auf dem Bildschirm getesteten Verbindungen. Blau, bona fide Glukokortikoiden;. Grau, alle anderen Verbindungen, c &#39;) Plot von Bildschirmdaten nach robusten Z-Score-Normalisierung. Systematische Fehler wie Plattenzwischen Variationen aus den Daten entfernt. Rote Linien zeigen den Mittelwert ± SEM von positiven innerhalb Platte Kontrollen. Schwarze Linie: Hit-Identifizierung Cut-off-Wert von Youden-Index Optimierung (Abbildung 3). Mit Genehmigung aus 14, 2012 wiedergegeben ACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50439/50439fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . 0439fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. Bildschirm Ergebnisse. a) Heatmap von Bildschirm Ergebnisse. Robuste Z-Score-Werte der Verbindungen der Bibliothek werden in die jeweiligen Positionen gut aufgetragen. Die positiven Kontrollen in Spalte 12 sowie zwei positive Hit Verbindungen in Brunnen F8 und E2 sind sichtbar. B) Heatmap einer Platte, die Verschleppung von einer positiven Verbindung während Bibliothek Zubereitung mit einem Pipettier-Roboter. Ein Gradient von Aktivität ist sichtbar an der Pipettier-Pfad vom Roboter übernommen. C) Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve für den Bildschirm. Die geschätzten wahren positiven Raten (linke y-Achse) und falsch positiven Raten (x-Achse) zur Erhöhung robuste Z-Score-Cut-off-Werte (farbcodiert, rechte y-Achse) aufgetragen. Die AUC-Wert der resultierenden Kurve nahe 1, was auf eine gute Testleistung. Nachdruck mit Genehmigung aus 14, 2012 ACS. D) Tabelle mit Verbindungen aktiv (yellow) oder inaktiv (blau) in der primären Bildschirm (prim.) oder in der Wiederholungsprüfung. Bona fide Glukokortikoiden nicht immer erneut getestet (weiß). Neu gezeichnet mit Genehmigung aus 14, 2012 ACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50439/50439fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4"> Allgemeine Einstellungen: </td></tr><tr><td colspan="4"> Schritt 1.1 </td></tr><tr><td> Verfahren </td><td> Typ: </td><td colspan="2"> einzigen flüssigen </td></tr><tr><td></td><td> Modus: </td><td colspan="2"> auspusten </td></tr><tr><td></td><td> spendet pro absaugen: </td><td colspan="2"> 1 </td></tr><tr><td></td><td> Optimierung der Geschwindigkeit: </td><td colspan="2"> Ja </td></tr><tr><td></td><td> Luftspalte System: </td><td colspan="2"> 10 ul </td></tr><tr><td></td><td> Verkehr: </td><td colspan="2"> 0 </td></tr><tr><td> Flush / Wash </td><td colspan="3" width="426"> Nicht </td></tr><tr><td> Absaugen </td><td> Art der Einstellung </td><td> Wert </td><td> Bemerkungen </td></tr><tr><td></td><td> Position </td><td> B7, B10, B13, B16 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Saugen Vol. </td><td> 10 ul </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Geschwindigkeit </td><td> 200 &amp;mgr; l / s </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Flüssig-Tracking </td><td> 60% </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Saugen Höhe </td><td> Standardlaborartikel </td><td> 22.28 </td></tr><tr><td> Dosieren </td><td> Art der Einstellung </td><td> Wert </td><td> Bemerkungen </td></tr><tr><td></td><td> Positionen </td><td> D7, D10, D13, D16 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dispense Vol. </td><td> 10 ul </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Geschwindigkeit </td><td> 200 &amp;mgr; l / s </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Flüssig-Tracking </td><td> 100 ul </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dispense Höhe </td><td> Standardlaborartikel </td><td> 17.01 </td></tr><tr><td colspan="4"> Schritt 1.2 </td></tr><tr><td> Verfahren </td><td> Typ: </td><td colspan="2"> Reagens </td></tr><tr><td></td><td> Modus: </td><td colspan="2"> Verschwendung </td></tr><tr><td></td><td> spendet pro absaugen: </td><td colspan="2"> 3 </td></tr><tr><td></td><td> Optimierung der Geschwindigkeit: </td><td colspan="2"> Ja </td></tr><tr><td></td><td> Luftspalte System: </td><td colspan= &quot;2&quot;&gt; 15 ul </td></tr><tr><td></td><td> Verkehr: </td><td colspan="2"> 0 </td></tr><tr><td colspan="2"> Flush / Wash </td><td colspan="2"> Nicht </td></tr><tr><td> Absaugen </td><td> Art der Einstellung </td><td> Wert </td><td> Bemerkungen </td></tr><tr><td></td><td> Position </td><td> A4 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Saugen Vol. </td><td> 3 x 490 ul </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Luftspalte </td><td> 15 und 0 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Geschwindigkeit </td><td> 200 &amp;mgr; l / s </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Flüssig-Tracking </td><td> 400% </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Saugen Höhe </td><td> Flüssigkeitsoberfläche </td><td></td></tr><tr><td> Dosieren </td><td> Art der s<html> Etting </td><td> Wert </td><td> Bemerkungen </td></tr><tr><td></td><td> Position </td><td> D7, D10, D13, D16 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dispense Vol. </td><td> 490 ul </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Luftspalte </td><td> 15 und 0 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Geschwindigkeit </td><td> 200 &amp;mgr; l / s </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Flüssig-Tracking </td><td> 100% </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dispense Höhe </td><td> Standardlaborartikel </td><td> 17.01 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Einstellungen für die Multiprobe II. Das Protokoll in Tabelle 1 beschreibt die Herstellung von 4-Platten (jeweils 96 Löcher). Die Platten werden auf Platte Adapter in den Arbeitsbereich an den Positionen der Roboter (zB B7, B10, B13, B16) angegeben haben. <html> 1 &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="4"> Allgemeine Einstellungen: </td></tr><tr><td colspan="2"> Anzahl der Testwiederholungen </td><td colspan="2"> abhängig von der Länge der Lauf </td></tr><tr><td colspan="2"> Anzahl der Platten </td><td colspan="2"> unbegrenzt </td></tr><tr><td colspan="2"> Temperaturregelung </td><td colspan="2"> 28 ° C </td></tr><tr><td colspan="2"> Protokoll </td><td colspan="2"> Berechnungen </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> US-Lum 96 (cps) lesen </td></tr><tr><td></td><td> Messzeit </td><td> 2,5 Sek. </td><td rowspan="3"> Crosstalk-Korrektur </td></tr><tr><td></td><td> Die Entfernung zwischen Platte und Detektor </td><td> 0 mm </td></tr><tr><td></td><td> Glow (CT2) Korrekturfaktor </td><td> 0% </td></tr></tbody></table>Inhalt &quot;&gt; Tabelle 2. EnVision Einstellungen für den Bildschirm verwendet.

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A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System | Biology  | Video

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Wir beschreiben das Verfahren und die Analyse der Daten aus einer chemischen Screening-System für Glukokortikoid-Stress-Hormon-Signalisierung unter Verwendung von Zebrafisch-Larven: Die Glucocorticoid Responsive In-vivo-Zebrafisch-Luciferase-Aktivität (Grizly)-Assay. Der Test sensitiv und spezifisch erkennt Auswirkungen auf die Glukokortikoid-Signalisierung durch Verbindungen, die Metabolisierung verlangen oder beeinflussen endogene Glucocorticoid-Produktion.

Eine Stoff Screening Verfahren für die Glucocorticoid-Signalisierung mit einem Zebrafisch-Larve Luciferase-Reportersystems

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

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11.8K Aufrufe.  Karlsruhe Institute of Technology - Campus North.  Wir beschreiben das Verfahren und die Analyse der Daten aus einer chemischen Screening-System für Glukokortikoid-Stress-Hormon-Signalisierung unter Verwendung von Zebrafisch-Larven: Die Glucocorticoid Responsive In-vivo-Zebrafisch-Luciferase-Aktivität (Grizly)-Assay. Der Test sensitiv und spezifisch erkennt Auswirkungen auf die Glukokortikoid-Signalisierung durch Verbindungen, die Metabolisierung verlangen oder beeinflussen endogene Glucocorticoid-Produktion. ...

Serie: A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Studieren Membrane Biogenesis mit einem Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Forschung

Biologie

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

Entwicklung von automatisierten Imaging und Analyse für Zebrafisch chemische Bildschirme.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Lineage Kennzeichnung von Zebrafisch-Zellen mit Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

Identifizierung von Zielen für Menschenrechte microRNAs mit dem LightSwitch Luciferase Assay System mit 3&#39;UTR-Reporter-Konstrukte und eine microRNA Mimic in adhärenter Zellen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been made in identifying the components of the editosome complex that catalyze RNA editing. However, it is still not clear how those proteins work together. Chemical compounds obtained from a high-throughput screen against the editosome may block or affect one or more steps in the editing cycle. Therefore, the identification of new chemical compounds will generate valuable molecular probes for dissecting the editosome function and assembly. In previous studies, in vitro editing assays were carried out using radio-labeled RNA. These assays are time consuming, inefficient and unsuitable for high-throughput purposes. Here, a homogenous fluorescence-based &#8220;mix and measure&#8221; hammerhead ribozyme in vitro reporter assay to monitor RNA editing, is presented. Only as a consequence of RNA editing of the hammerhead ribozyme a fluorescence resonance energy transfer (FRET) oligoribonucleotide substrate undergoes cleavage. This in turn results in separation of the fluorophore from the quencher thereby producing a signal. In contrast, when the editosome function is inhibited, the fluorescence signal will be quenched. This is a highly sensitive and simple assay that should be generally applicable to monitor in vitro RNA editing or high throughput screening of chemicals that can inhibit the editosome function.

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

RNA-Katalysator als Reporter für Drogen-Screening gegen RNA-Editing in Trypanosomen

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Transfizieren RAW264.7-Zellen mit einem Luciferase-Reportergen

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Screening Multi-Enzym ein High-throughput Genetic Enzymscreening-System verwenden

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...