Wir danken Susan Farmer und die Mitarbeiter der UAB Zebrafisch-Forschungseinrichtung für Zebrafisch-Pflege. Finanzierung von Start-up-Fonds von der Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie zur Verfügung gestellt.

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von der Universität von Alabama in Birmingham Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Zebrafisch-Zucht-und Ei-Sammlungen <ol><li> Drei Tage vor Beginn der Einwirkung von Chemikalien, montieren Zuchtbecken mit Unterteilungen, getrennte Männer und Frauen. Füllen Sie jeden Tank zur Hälfte mit Wasser Aquakulturanlage. Mit einem Netz, übertragen Tg (5xERE: GFP) c262/c262 Fisch Zuchtbecken, indem zwei Männer und 3 Frauen in jedem Tank durch einen Teiler getrennt. Legen Sie einen Deckel auf jedem Behälter und Etikett mit Datum und Stämme gekreuzt werden. </li><li> Am folgenden Morgen, entfernen Sie alle Hindernisse und Neigungs verblüfft einen flachen Bereich an einem Ende der Zuchtbecken zu schaffen. Lassen Zebrafisch zu paaren, sammeln Embryonen im 10-Minuten-Intervallen, präzise Inszenierung Entwicklungs gewährleisten. Saubere Eier durch Spülen durch ein Teesieb mit E3B Medium und sanft bündig Embryonen in Petrischalen. Zurück erwachsenen Fischen zu dauerhaftenTanks. </li><li> Mit einem Binokular, sortieren, zählen, und entfernen Sie alle unbefruchtet, abnormale oder beschädigte Embryonen. Platz Embryonen in Petrischalen in E3B Medium und Haus bei 28,5 ° C mit einer 14.10 Licht: Dunkel-Zyklus. Embryo Dichte Entwicklung beeinflussen. Legen nicht mehr als 100 Embryonen in einer 100 x 35 mm-Schale und nicht mehr als 50 Embryonen in einem 60 x 15 mm-Schale. </li><li> Nach 24 hpf, ersetzen Sie Medien mit E3B, die 200 uM 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU). PTU verhindert Pigmentbildung und hält Zebrafisch-Embryonen und Larven für eine verbesserte Bildqualität transparent. ACHTUNG: konzentriert PTU Lager ist gefährlich; Handschuhe tragen, wenn Sie E3B + PTU Lösung. </li><li> Am 1. Tag nach der Befruchtung (DPF), manuell das Chorion von jedem Embryo mit feinen Pinzette entfernen. Das Chorion nicht erscheint, um das Eindringen der Östrogene beeinflussen, jedoch die Entfernung verbessert die Bildklarheit. Es gibt keine Notwendigkeit, Chorion aus den Medien zu entfernen. HINWEIS: Als Alternative zur manuellen dechorionation, Chargen von Embryonen che werdenmisch dechorionated mit 1 mg / ml Pronase-Behandlung, wie zuvor beschrieben 11. </li></ol> 2. Chemische Behandlung von Embryonen <ol><li> Der Tag vor der Behandlung, die Stammlösungen jeder Chemikalie bei 1000-facher Konzentration in DMSO (oder geeigneten Lösungsmittel). Zum Beispiel, um Embryonen zu 10 uM Bisphenol A (BPA) ausgesetzt werden, bereiten eine 10 mM Stammlösung BPA in 100% DMSO. Dies sichert eine gleichmäßige DMSO-Konzentration in jeder Behandlung und ermöglicht eine ungiftige 1:1000 Verdünnung von DMSO als Vehikelkontrolle dienen. Shop-Stammlösungen bei -20 ° C Für dieses Protokoll, wird Embryonen bis 1 um und 10 um BPA, 18,5 nM und 1,85 &amp;mgr; M Genistein, 367 nM Östradiol (positive Kontrolle) und Vehikel (0,1% DMSO, negative Kontrolle) ausgesetzt. VORSICHT: Chemikalien wie BPA und Östradiol sind gefährlich und können nachteilige Wirkungen auf den menschlichen Fötus. Griff endokrine Disruptoren mit Sorgfalt und verwenden Sie immer die richtige persönliche Schutzausrüstung.</li><li> Am Tag der Behandlung, Tauwetter vorbereitet Lager chemische Lösungen. 1:1000 verdünnt durch Pipettieren von 1 ml E3B + PTU in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Zugabe von 1 ul Lager chemische Lösung. Vortex kräftig. DMSO verdünnt 1:1000 in E3B + PTU als Fahrzeugkontrolle. Verwenden Sie 1 mL E3B + PTU in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen als unbehandelte Kontrolle. </li><li> Mit einer großen Bohrung Kunststoff Transferpipette, Transfer-Embryonen aus Petrischalen in jedes Well einer 96-Well-Platte, 3 Embryonen pro Well, 3 Wells pro Zustand. Verdunstung während längerer Behandlung zu verhindern, lassen Embryonen von äußeren Reihen und Spalten der Platte (Zeilen A und E, Spalten 1 und 12). Außenbrunnen mit 300 pl E3B + PTU gefüllt werden. Beschriften Sie die Platte Deckel entsprechend. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus jedem Well mit einem spitzen, dünnen Kunststofftransferpipette. Arbeiten Sie schnell, um ein Austrocknen zu vermeiden, die Embryonen. </li><li> Geben Sie 200 ul der Behandlungslösung in entsprechende gut. Setzen Sie den Deckel underneath die Platte als Leitfaden für die Zugabe von Behandlungen in die richtigen Brunnen zu gewährleisten. Vortex jedes Rohr vor dem Pipettieren, um die Chemikalie in Lösung zu verteilen. Optisch bestätigen jeder Embryo ist in der Behandlungslösung. Wenn Embryonen sind auf der Seite der gut mit einem sauberen Transferpipette, um sie in den Brunnen mit der Behandlungslösung zu waschen. </li><li> Die Platte wird in den Brutschrank bei 28,5 ° C. Die Embryonen werden für die Fluoreszenz bei 72 hpf analysiert werden. </li></ol> 3. Mated Imaging von Embryonen in 96-Well-Platten <ol><li> Betäuben Embryonen durch Zugabe von 10 ul von 4 mg / ml in jede Vertiefung Tricaine. HINWEIS: Anesthetize Embryonen vor der Bilderzeugung. Bei 24-96 hpf, Zebrafisch zeigen spontane Bewegung und eine Schreckreaktion auf die veränderte Lichtquelle während der Bildaufnahme. Anästhesie Embryonen reduziert Bewegung während der Bildgebung. </li><li> Legen Sie die 96-Well-Platte in der Motortisch und kalibrieren die Bühne. Mit Zeiss Zen Blau-2011-Software automatisch für die Mikroskopieauf und Kontrolle, wählen Sie den Probenträger Option und Multiwell-96. Wählen Sie Kalibrieren. Folgen Sie den schrittweisen Anweisungen auf die Bühne zu kalibrieren. HINWEIS: Nach diesem Schritt deaktivieren Sie das Fliesen-Taste. Wenn die Fliesen-Taste deaktiviert ist, können Kalibrierungseinstellungen verloren gehen und die 96-Well-Platte muss neu kalibriert werden. </li><li> Mit einem 10-fach Objektiv und die Hell (BF) Einstellung, identifizieren eine positive Kontrolle Embryo und die Belichtung Einstellungen entsprechend für BF-und GFP-Kanäle, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Signal nicht Sättigung der Kamera. Konzentrieren Sie sich auf einen einzigen Embryo und programmieren das Mikroskop bis 3 Gesamt Z-Profile, ein Bild um 50 oben und 50 um unter der aktuellen Brennebene zu erwerben. HINWEIS: Da die verschiedenen Gewebe besetzen unterschiedliche Brennebenen, wird dadurch sichergestellt, dass für jeden Zebrafisch-Bilder sind mit Herz und Leber im Fokus gefangen genommen. </li><li> Stellen Sie die Software-Parameter, um ein Bild mit Fliesen GFP und BF channe erwerbenls. Unter der Registerkarte Erwerb, wählen Sie Advanced Setup. Wählen Fliesen Regionen, dann Fliesen. Wählen Sie die Option Kreis auch. HINWEIS: Fliesen verwendet wird, um ein zusammengesetztes Bild von jeder Vertiefung zu schaffen. Ein einzelnes Feld-of-view erfasst nur einen kleinen Teil der Vertiefungen. Die Fliesen-Funktion kann automatisch zu erfassen mehrere benachbarte Felder-of-view aus jeder Vertiefung, wodurch ein zusammengesetztes Bild des gesamten gut. Es ist daher möglich, automatisch zu erfassen 96 zusammengesetzte Bilder pro Platte, wobei jede zusammengesetzte Bild enthält mehrere Dutzend Einzelbilder aus einem einzigen gut. </li><li> Wählen Träger und Füllfaktor 90%. Auswählen einen Füllfaktor von 90% werden zu erfassen mehrere Bilder der ausgewählten Vertiefungen, so dass 90% der Fläche von jeder Vertiefung in dem zusammengesetzten Bild sichtbar sein. HINWEIS: Bei der Auswahl der Füllfaktor wird ein Diagramm angezeigt werden, die den abzubildenden Bereich. Wählen Sie einen Prozentsatz, der den Bereich der gut umfassen wirddas ist für den Versuch geeignet. </li><li> Unter Optionen, wählen Sie die gewünschte Menge an Überschneidungen. HINWEIS: Beim Zusammennähen Fliesen für ein einzelnes repräsentatives Bild, eine Überdeckung von 5-10% ermöglicht eine glatte Naht zwischen den Bildern. Allerdings, wenn Stitching ist unnötig, mit einer Überlappung 0% wird Belichtungszeit zu reduzieren. Unter Verwendung von 90% Füllfaktor und 5% überlappen, ein zusammengesetztes Bild von einem einzigen Bohrloch besteht aus 59 Einzelbildern. </li><li> Starten Bildgebung. Das Mikroskop wird automatisch Bilder zu erwerben. </li><li> Manuell inspizieren zusammengesetzte Bilder von jeder Vertiefung zur gewebespezifischen Fluoreszenz (Abb. 1). </li><li> HINWEIS: Es ist am besten, mit der positiven Kontrolle beginnen, um zu bestätigen, dass die chemische Exposition vor Beobachtung experimentelle Behandlung Brunnen gearbeitet. </li></ol> 4. Manuelle Bildaufnahme von Embryonen in 96-Well-Platte HINWEIS: Um die Ergebnisse zu bestätigen, verwenden Sie ein 20x Arbeitsabstand Ziel, acerfordern detaillierte Bilder manuell (Bild 2). <ol><li> Mit einem 20x-Objektiv und das Hellfeld (BF) Einstellung, identifizieren eine positive Kontrolle Embryo und die Belichtung Einstellungen für BF und GFP Kanäle richtig, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Signal nicht Sättigung der Kamera. </li><li> Identifizieren einzelner Embryonen und die Aufnahmen manuell. HINWEIS: Wenn die Belichtungseinstellungen für die positive Kontrolle Embryo ausgewählt wurde, werden die Einstellungen nicht verändern. Dies ermöglicht einen Vergleich der Fluoreszenzintensität jedes Bild unter einheitlichen Bedingungen erfasst. </li></ol>

<ol>
	<li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).</li><li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish.">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li><li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish.">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li><li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+tool+for+chemical+screens.">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li><li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos.">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li><li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+reporter+quantification+in+vivo:+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish.">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+estrogen+response+element.">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li><li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation.">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , (2000).</li></ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode, um automatisch Bild Gewebe-spezifischen Fluoreszenz in Zebrafischembryonen. Das Protokoll wurde mit einem Zeiss Axio Observer entwickelt. Z1 mit Zen-Blau-2011-Software, aber die Technik kann mit jedem inversen Mikroskop mit einem motorisierten Mikroskop Bühne und Steuerungssoftware, die Fliesen durchführen, um zusammengesetzte Bilder erstellen angepasst werden. Das Ausrüsten eines inversen Mikroskops mit einem motorisierten Stufe kann eine praktische, preiswerte Alte...

Transgene Zebrafisch entwickelt worden, die zur direkten Visualisierung der Aktivität in Signalwege, wie beispielsweise Fibroblasten-Wachstumsfaktoren 1, 2 Retinsäure und Östrogene 3, lebenden Embryos zu ermöglichen. Solche Werkzeuge ermöglichen Screening für Chemikalien, die Signalwege zu stören (wie Änderung der Fluoreszenzintensität analysiert wurde) oder Chemikalien, die Signalgebung modulieren in einer gewebespezifischen Art und Weise (Änderung der Fluoreszenzlokalisierungs) 4. Automatisierte Bildaufnahme erhöht den Durchsatz der chemischen Bildschirme dramatisch 5,6. Bildschirme, die automatisch im Live-Test Fluoreszenz Zebrafisch verlassen sich oft auf teure Spezialgeräte. High-Content-Screening sogenannte bietet den Vorteil hoher Auflösung, quantitative Bildgebung, aber auf Kosten der Verwendung von spezialisierten Plattenleser für die konfokale Mikroskopie 7,8 ausgestattet. Das Ziel dieser Methode ist es, automatisch Assay gewebespezifische Fluoreszenz in Zebrafischembryonenin einer 96-Well-Platte unter Verwendung eines Standard-Epifluoreszenz-Mikroskop. Gewebespezifische Fluoreszenz kann mit dieser Technik unterschieden werden und kann ein vernünftiger Ansatz für die Laboratorien, die den Zugang zu spezialisierten Plattenleser oder High-Content-Screening-Geräte fehlt sein. In diesem Protokoll verwenden wir automatisierte Bildgebung von Gewebe-spezifischen Östrogen-Rezeptor (ER)-Agonisten in lebenden Zebrafisch nach 3 Tagen nach der Befruchtung (dpf) zu erfassen. Die transgene Linie Tg (5xERE: GFP) c262/c262 enthält 5 Tandem Östrogen-Response-Element-DNA-Sequenzen (ERE) stromaufwärts des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) 3. In der Abwesenheit von Liganden, ERs sind normalerweise inaktiv. Ligandenbindung löst eine Konformationsänderung, wodurch Rezeptoren binden ERE DNA und regulieren die Transkription 9. 5xERE: GFP Fische verwendet werden, um Substanzbibliotheken für ER-Modulatoren zu screenen und kann verwendet werden, um Umweltwasserproben für östrogene Verunreinigungen zu screenen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:885px;" width="886">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:451px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; wide bore</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; fine tip</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well, round, flat bottom plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">21-377-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 35mm paltes</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 60mm plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont #5 fine forceps</td>
			<td style="width:100px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tricane methanesulfonate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040-25G</td>
			<td>see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629-10G</td>
			<td>Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 &#956;M in E3B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20x long working distance objective</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiocam HRm digital camera</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ZenBlue 2011 microscope control software</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;MB-1; 25 grams</td>
			<td>make 2% solution in RO water for use in E3B (below)</td>
		</tr>
		<tr height="273">
			<td height="273" style="height:273px;">E3B</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">60X E3 SOLUTION: 
			NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 17.2 grams 
			KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.76 grams 
			CaCl2-2H2O&#160;&#160;&#160;&#160; - 2.9 grams 
			MgSO4-7H2O&#160; - 4.9 grams or MgSO4 &#8211; 2.39 grams 
			Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 
			 
			1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 
			60X E3&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 150mls 
			2% methylene blue&#160;&#160;&#160;&#160; 100&#956;l&#160; 
			Bring to 9 liters with Milli-Q water 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos

Zebrafisch-Embryonen sind ein mächtiges Werkzeug für große Screening kleiner Moleküle. Transgene Zebrafisch, die fluoreszierende Reporter-Proteine ​​exprimieren, werden häufig verwendet, um Chemikalien, die die Genexpression modulieren. Chemische Bildschirme, die Fluoreszenz-in-Live Zebrabärblingtest verlassen sich oft auf teure Spezialausrüstung für High Content Screening. Wir beschreiben ein Verfahren, mit einem Standard-Epifluoreszenzmikroskop mit einem motorisierten Bühne, um automatisch Bildzebrafischembryonen und erkennen Gewebe-spezifische Fluoreszenz. Mit transgenen Zebrafisch, die Östrogen-Rezeptor-Aktivität berichten über die Expression von GFP, entwickelten wir eine semi-automatische Verfahren für Östrogen-Rezeptor-Liganden, die die Reporter in einem Gewebe-spezifisch aktivieren screenen. In diesem Video beschreiben wir Verfahren zum Ordnen von Zebrafisch-Embryonen von 24-48 Stunden nach der Befruchtung (hpf) in einer 96-Well-Platte und das Hinzufügen von kleinen Molekülen, die Östrogen-Rezeptoren binden. Bei 72-96 hpf, Bilder von jedem gut ausdie gesamte Platte, werden automatisch gesammelt und manuell für Gewebe-spezifischen Fluoreszenz untersucht. Dieses Protokoll zeigt die Fähigkeit, Östrogen-Rezeptoren, die in Herzklappen zu aktivieren, aber nicht in der Leber zu erkennen.

Fig. 1 zusammengesetzte Bilder aus einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Jedes zusammengesetzte Bild wird von 59 Einzelbildern mit 5% Bildüberlappung besteht. Beachten Sie, dass die Live-Zebrafisch sind zufällig in jedem gut orientiert, aber wir sind in der Lage, um die Fluoreszenz im Herzen von der Leber zu unterscheiden. Hell Bilder sind als Verweise auf Zebrafisch-Orientierung zu beurteilen und zu visualisieren, morphologische Veränderungen (1A und 1C). Automated Imaging mi...

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Hier beschrieben ist ein Protokoll zur halbautomatischen Bilderzeugungsgewebespezifischer Fluoreszenz in Zebrafischembryos.

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

semi-automated-imaging-tissue-specific-fluorescence-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Aufrufe.  University of Alabama at Birmingham.  Hier beschrieben ist ein Protokoll zur halbautomatischen Bilderzeugungsgewebespezifischer Fluoreszenz in Zebrafischembryos. 

Serie: Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Forschung

Biologie

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Semi-automatische optische Heartbeat-Analyse von kleinen Herzen

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Imaging Glykane in Zebrafisch-Embryonen durch metabolische Markierung und Bioorthogonale Click-Chemie

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Metabolic-Profil-Analyse von Zebrafischembryonen

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...