Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen auf dem Gebiet der immunsuppressiven therapeutischen Intervention für die Untersuchung der nachteiligen Auswirkungen von Medikamenten auf die Geweberegeneration, insbesondere in Knochen, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie vergangene Modelle der Zebrafischknochenregeneration mit systemischer Drogenexposition durch Eintauchen des verletzten Zebrafisches in medikamentöses, ergänztes Fischwasser kombiniert. Vor Beginn des Verfahrens bedeckte Autoklav eine Aluminiumfolie 600 Milliliter Becher pro Zebrafisch und eine entsprechende Anzahl von Glasflaschen Fischwasser für das Experiment und bereitete das immunsuppressive Medikament in experimentellen Kontrolllösungen von Interesse vor.
Für eine Amputationsverletzung verwenden Sie stumpfe Zangen, um einen anästhesierten Zebrafisch vorsichtig auf seine seitliche Seite auf den umgekehrten Deckel einer 100-Millimeter-Petrischale zu legen und ein Skalpell zu verwenden, um 50% der Flosse wiederherzustellen. Dann legen Sie den Fisch in einen autoklavierten Becher mit 300 Milliliter Fischwasser, ergänzt mit geeignetem Versuchsmittel, und bedecken Sie den Becher mit Folie, um das Entweichen von Zebrafischen zu verhindern. Um eine Flossenfrakturverletzung auszulösen, legen Sie einen anästhesierten Zebrafisch auf seiner Seitenseite in eine 100 Millimeter agarosebeschichtete Petrischale unter einem Seziermikroskop und schieben Sie eine Injektionsnadel leicht in ein knöchernes Flossenstrahlsegment, bis ein Riss auftritt.
Es ist wichtig, nicht zu viele Frakturen in die Flosse einzuführen, da dies die Stabilität stark beeinträchtigen könnte. Dann den Fisch in einen autoklavischen Becher mit 300 Milliliter Fischwasser geben, ergänzt durch das entsprechende Versuchsmittel. Um eine kalvariale Schädelverletzung zu erzeugen, halten Sie einen anästhesierten Zebrafisch in der aufrechten Position, so dass die Calvarialknochen leicht unter einem Seziermikroskop visualisiert werden können.
Legen Sie einen rotierenden Mikrobohrer mit einem 500-Mikrometer-Bohrer über die Mitte des Frontalknochens und berühren Sie sanft den Knochen, um ein Loch von der Größe des Mikrobohrgrabens zu erzeugen. Es ist wichtig, den Bohrer nicht seitlich zu bewegen, während die Verletzung produziert wird, und sofort zu stoppen, sobald der Widerstand des Gewebes sinkt. Andernfalls wird das Gehirn beschädigt.
Dann legen Sie den Fisch in einen autoklavierten Becher mit 300 Milliliter Fischwasser, ergänzt durch das entsprechende Versuchsmittel. Wechseln Sie das Wasser in den Bechern täglich, indem Sie den Zebrafisch und das Fischwasser in einen geeigneten temporären Behälter überführen und den Becher mit frischem, mit Medikamenten ergänztem Fischwasser nachfüllen. Dann verwenden Sie ein Fischnetz, um den Zebrafisch zu seinem Becher zurück.
Für Behandlungen, die insgesamt bis zu zwei Tage dauern, füttern Sie den Zebrafisch nicht. Füttern Sie den Zebrafisch bei längeren Experimenten jeden zweiten Tag mit 0,5 bis einem Milliliter geschlüpfter Artemia SSP. Für die Fin-Verletzungsanalyse, ernten Sie die Feine und verwenden Sie feine Zange, um die Flosse an einer Kante des Stumpfes zu greifen.
Verwenden Sie ein zweites Paar Zangen, um die gegenüberliegende Stumpfkante zu greifen und drücken Sie das Gewebe leicht auf den Boden der Schale, die kalte 4%PFA für 10 bis 20 Sekunden enthält. Bei Bedarf die Abflachung der Flossen wiederholen. Die Flosse sollte nun flach ohne Curling liegen.
Für eine langfristige Probenlagerung nach der Fixierung das Gewebe mit drei 20-minütigen PBS-Waschungen und einer aufsteigenden Methanolserie waschen. Die Proben können dann in 100% Methanol bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Für Alizarin Red Färbung, Rehydrat Methanol gelagert Proben in einer absteigenden Methanol-Serie gefolgt von zwei 20-Minuten-Wäsche in PBS und eine fünfminütige Wäsche in entionisiertem Wasser.
Nach der letzten Wäsche, fügen Sie Alizarin Red Lösung in das Probengewebe und inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur mit Schaukeln für die entsprechende Färbung Zeit. Um die Proben zu löschen, behandeln Sie das Gewebe mit der abnehmenden 1%Kaliumhydroxidglycerin-Serie. Dann lagern Sie die Proben in einem ein s bis 1%Kaliumhydroxid zu 80%Glyzerin-Lösung und montieren Sie die Gewebe mit 80%Glycerin zur Vorstellung.
Für Calcein-Färbung bis zu drei Zebrafische gleichzeitig in 100 Millimeter Calcein-Lösung für 20 Minuten in einem mit Aluminiumfolie überzogenen Glasbecher bebrüten. Am Ende der Brutzeit den Zebrafisch in einen Behälter mit Fischwasser geben und die Fische kurz schwimmen lassen, bevor sie in einen neuen Behälter mit Fischwasser überführen. Nach 20 Minuten im zweiten Becher, um Live-Bilder von Flossenregenerierungen zu erfassen, legen Sie einen anästhesierten Zebrafisch auf eine agarose beschichtete Petrischale und stellen Sie die Flosse per Stereomikroskopie ab.
Um Bilder der regenerierenden Schädelknochen zu erfassen, legen Sie den Zebrafisch aufrecht in einen Schwamm und stellen Sie den Schädel durch Fluoreszenzmikroskopie ab. Die Behandlung mit Prednisolon, ähnlich wie andere Glukokortikoide, führt zu einer allgemeinen Hemmung der Flossenregeneration einschließlich der Knochenbildung, wie sie von Alizarin Red Staining von festem kaudalen Flossengewebe nachgewiesen wird. In ähnlicher Weise hat das Medikament verzögerte Wirkung auf calvariale Schädelverletzung Verschluss.
Aufgrund der Immunsuppression können reduzierte Makrophagenzahlen auch durch Immunhistochemie auf gefrorenen Gewebeabschnitten nachgewiesen werden, wie durch die Verwendung von Anti-MCherry und Anti-GFP-Antikörperfärbung und transgenen MPEG-1 mCherry mit Osterix NGFP Zebrafischen auf Zebrafisch-Schädelgewebeproben von Prednisolon behandelten Tieren belegt wird. Beim Versuch dieser Verfahren ist es wichtig, die Variabilität der Knochenregenerationsgeschwindigkeit zu minimieren, indem die Verletzungsaufsätze sehr reproduzierbar durchgeführt werden. Es ist auch wichtig, Einhaus-Zebrafische in autoklavierten Bechern mit autoklavierten Fischwasser, um mikrobielle Infektionzufall zu vermeiden.
Dieses Protokoll wird dazu beitragen, die zugrunde liegenden Mechanismen der Glukokortikoium-Wirkung weiter zu adressieren. Zum Beispiel, im Zusammenhang mit Glukokortikoid induzierte Osteoporose und kann auch für die Verwendung von anderen Medikamenten und anderen Zebrafischknochen angepasst werden.
