Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung Erin Fennern Experiment danken. Diese Arbeit wurde von der Research Council of Norway (180504, 185306 und 191699), Pew Charitable Trust und dem National Institute on Aging (NIA P01 AG22500) finanziert.

Teil 1: RNAi-vermittelte doppelte Gen Knockdown 1. dsRNA Synthese <ol><li> Design-Primer dsRNAs Targeting vg, usp und ein Kontroll-Gen kodiert grün fluoreszierendes Protein (GFP), die nicht in der Honigbiene Genom: Primer wurden mit Online-freie Software Primer3 ( <a href="http://frodo.wi.mit.edu/" target="_blank">http://frodo.wi.mit.edu/</a> ) . </li><li> dsRNA-Synthese für vg, usp und GFP: Verwendung RiboMax T7-RNA-Produktion-System von Promega für in-vitro-Transkription. </li><li> dsRNA Reinigung: <ol><li> Denaturierung und Renaturierung: Wärme die dsRNA bis 85 ° C für 5 min und abkühlen lassen bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> DNase I Behandlung: add 1 ul DNase I in jeder dsRNA Reaktion und mischen sie durch Schwenken der Röhrchen. Inkubieren für 15 min bei 37 ° C. </li><li> In 150 ul Nuklease-freies Wasser und 750 ul TRIzol - LS in jeder Reaktion und vorsichtig mischen sie von inverting die Röhre. Inkubieren der Proben 5 min bei 30 ° C. </li><li> In 200 ul Chloroform in jeder Probe. Mischen Sie kräftig für 20 Sekunden. Zentrifugieren Sie die Proben für 15 min bei 12.000 xg bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand Phase zu jedem neuen Rohr und fügen Sie 500 ul Isopropanol in jedes Röhrchen. Mischen Sie sie durch Invertieren des Röhrchens. Inkubieren des Gemisches für 20 min bei -20 ° C. Zentrifuge für 10 min bei 12.000 xg bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und benutzen 1.000 ul 75% Ethanol, um das Pellet zu waschen. Nach Zentrifugieren der Röhrchen 5 min bei 7.500 xg bei 4 ° C, Luft trocknen die dsRNA Pellet, und verwenden Nuklease freiem Wasser, um das Pellet zu lösen. Um die Wirksamkeit von Gen Down-Regulation zu gewährleisten, sollte die Konzentration dsRNA rund 9 -10 ug / ul sein. </li></ol></li></ol> 2. dsRNA Bauch-Injection Für Doppel-Gen Knockdown, gibt es zwei Strategien: 1) einzelne Injektion: mix dsRNA von zwei Genen und inject die Mischung, 2) zweitägigen Injektion: Injektion der ersten dsRNA Targeting ein Gen am ersten Tag, und injizieren das zweite dsRNA in die gleichen Bienen am zweiten Tag. <ol><li> Gefühlt neu geschlüpfte Bienen in einem 4 ° C Kühlschrank für 1-2 min. Wenn die Bienen immobilisiert sind, montieren Sie 3-4 Bienen parallel auf Petrischalen voller festes Wachs mit Insektennadeln zwischen ihren Bäuchen und thoraces gekreuzt. </li><li> Kühlen Sie die Bienen wieder in einem 4 ° C Kühlschrank. Sicherstellen, dass die Bienen sind völlig unbeweglich. Es dauert ca. 1-2 min. Die Bienen aussehen sollte locker. Wenn die Bienen gewellt oder verdreht werden, bedeutet dies, sie zu lang, die vermieden werden sollte gekühlt. Erholung zu viel verursacht hohe Sterblichkeit, vollständige Immobilisierung ist jedoch wichtig, da jede Bewegung erhöht die Größe der Wunde und Mortalität. </li><li> Setzen Sie ein Einweg-30 G-Nadel (BD) auf einer micro Hamilton Spritze. Take 3 ul dsRNA und stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblase in der Spritze. Die Nadel wird auf eine Seite des Bauches eingefügt dama vermeidenGing inneren Organe. Drücken Sie den Kolben der Spritze langsam, damit die dsRNA absorbiert werden. Seit dsRNA sehr zähflüssig ist, dauert es 2-3 Sekunden vollständig aus der Spritze ausgeschlossen werden. Nach dem vollständigen Herunterdrücken des Kolbens, lassen Sie die Nadel in die Wunde für 4-5 sek. Beachten Bienen für 3-5 sec nach den Injektionen. Wenn ein Tropfen Hämolymphe Lecks aus der Wunde, entsorgen Sie die Biene. </li><li> Verwenden Sie unterschiedliche Farben, um ihre thoraces entsprechend den verschiedenen Behandlungen zu markieren. Zu diesem Zeitpunkt, wenn der einzelne Injektion Strategie wurde verwendet, können die Bienen zurück in eine Kolonie plaziert werden nach 1 Stunde Beobachtung. Wenn jedoch die zwei Tage Injektion Strategie wurde verwendet, nachdem sie mit dem ersten dsRNA injiziert wird, sollte die Bienen in einem Zylinder Maschenkäfig mit Honig auf der Seite zugeführt gebracht und in einem Inkubator bei 34 ° C gehalten werden und 80% Luftfeuchte . </li><li> Am zweiten Tag, befolgen Sie die Schritte 2.2 und 2.3, die den Bienen in den Käfigen Mesh Chillen und montieren sie auf Wachsplatten. Führen Injektionen mit dem zweiten dsRNA, wie es ist beschrieBett in Schritt 2.4. </li><li> Lassen Sie die Bienen bei Raumtemperatur für 1 Stunde erholen und führen sie in eine Kolonie. </li></ol> Hinweis: Knockdown Effekte können durch quantitative RT-PCR (qRT-PCR) und Western Blot nachgewiesen werden. Im Allgemeinen variiert Knockdown Wirksamkeit und hängt von vielen Faktoren ab. In unserer Studie kann die doppelte Gen Knockdown von 7 Tagen nach einzelnen Injektionen und zweitägigen Injektionen nachgewiesen werden. Teil 2: Rüssel extension response (PER) Assay 1. Sammeln Bienen aus dem Bienenstock Am 6. Tag nach der Injektion, sammeln behandelten Bienen aus der Kolonie ohne Verwendung eines Rauchers. Sammeln Bienen in Metallgitter Zylinder Käfigen. Halten Sie 3 Bienen in jedem Käfig. 2. Montage Bees für PER Kühlen Sie die Bienen bei 4 ° C bis sie vollständig immobilisiert. Hängen Sie jede Biene vertikal in einem Kunststoffrohr speziell für PRO entwickelt. Halten Sie den Bauch in der Röhre durch using zwei kleine Stücke des Bandes, und halten Sie den Kopf ragte aus dem Rohr. Setzen Sie die Rohre auf einem Gestell mit zwei Reihen von kleinen Kunststoff-Säulen, und weisen jedes Rohr (bee) mit einer ID-Nummer. Dann legen Sie behandelten Bienen auf den Regalen in einen Inkubator (34 ° C und 80% Luftfeuchte) und halten sie in den Inkubator für 2 Stunden. 3. Vorbereiten einer Reihe von Saccharose Water Solutions Bereiten 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% und 30% Saccharose Wasser-Lösungen und laden Sie die Lösungen in die Spritzen mit 15-20 G Nadeln. 4. PER Assay Berühren Sie die Biene die Antenne mit einer Tröpfchengröße von 0% ige Lösung (Wasser) von 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% und 30% Saccharose Wasser-Lösungen verfolgt. Testen Sie alle Bienen zuerst mit Wasser und lassen Sie mindestens zwei Minuten, wie das Intervall zwischen jeder Lösung verwendet wird. Deshalb haben wir in der Regel mindestens 20 Bienen für jeden Versuch. Wenn eine Biene voll streckt ihre Rüssel wird eine positive Reaktion gewertet. 5.Data Management Fassen Sie die insgesamt positive Antworten für jeden einzelnen für geschmackliche Antwort Punktzahl (GRS). Führen Sie eine geeignete statistische Analyse der Daten. Teil 3. Gene Knockdown Validierung Fat Körper sind aus einem anderen Satz von 7 Tage alten Bienen behandelt seziert. Ein Standard TRIZOL Verfahren zur RNA-Extraktion, die von DNase I-Behandlung 24 gefolgt wird. Vg und USP Genexpression durch eine Zwei-Schritt-PCR qRT. Actin analysiert wird als ein Referenz-Gen verwendet werden, da sie stabil Ausdrücke in verschiedenen Geweben hat von Honigbienen. Veröffentlicht Echtzeit-PCR-Primer für vg und USP-Gens sind in diesem Experiment 24 verwendet. Die Daten werden durch Delta-Delta CT-Verfahren 25 analysiert.

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We have nothing to disclose.

Unsere Studie ist der erste Versuch, gleichzeitig niederzuschlagen zwei Gene in erwachsenen Insekten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die beiden Strategien der dsRNA Injektionen (einzelne Injektion und zweitägigen Injektion) für die doppelte effektive Genunterdrückung und gleichzeitig Gen-Silencing von vg und usp sind, können 6 Tage nach der dsRNA Injektionen in Bienen 8,9 getestet werden. Allerdings variiert Gen Knockdown Wirksamkeit in verschiedenen Insektenarten abhängig Transkript Ni...

RNA-Interferenz (RNAi) RNA ist auf post-transkriptionale Gen-Silencing, das in einer Vielzahl von eukaryotischen Organismen auftritt. Verfahren nach RNAi durch endogene oder exogene doppelsträngige RNA (dsRNA)-Vorstufen ausgelöst. Die dsRNA aktiviert das Protein Ribonuclease Dicer bindet und spaltet die dsRNA zu kleine Fragmente (20-25 bp). Dann werden die kleinen Fragmenten der dsRNA Führung eine Erkennung und Spaltung der komplementären mRNAs durch argonaute Proteine ​​eine katalytische Komponente des RNA-induced silencing complex (RISC) 1. Bei Säugetieren aktivieren dsRNAs länger als 30 nt, eine antivirale Reaktion (Interferon-Antwort, IFN), die unspezifische Abbau von RNA-Transkripte 2 führt. Allerdings haben lange dsRNAs als wirksam erwiesen und spezifische in Insekten, da ein Mangel an diesem IFN 3. Lange dsRNAs haben Herunterregulation der Zielgene wurde in verschiedenen Insektenarten verwendet. Honigbienen sind eine der pionEER Insekten Organismen, in denen viele wichtige Funktionen der Gene in der Entwicklung und das Verhalten haben mit dsRNA 4,5 offenbart worden. Mehrere dsRNA Versandmethoden haben in Honigbienen durchgeführt: dsRNA Fütterung effizient herunterreguliert Ziel Genexpression in Honigbienenlarven 6, während dsRNA Injektion ist ein wirksamer Ansatz für die Gen-Knockdown in Honigbiene Embryonen 4 und erwachsenen Bienen 7,8. Gene Knockdown durch das Aufbringen von dsRNA Insekten ausgestellt sind vorübergehend und lokalisiert. Studien haben gezeigt, dass beide Bauch dsRNA Injektionen und Brust-dsRNA Injektionen wirksam unterdrücken Ziel Genexpression in Bauchfett Körperzellen von Insekten 9,10. DsRNA in Bauch-und Brusthöhle und fetten Körper Zellen injiziert sind in der Lage, sich der dsRNA aus der Hämolymphe, wo die Zellen 10 gebadet werden. Allerdings können Gene in anderen Organen, wie Eierstöcke und Gehirn, nicht entweder gezieltBauch-oder Brust-Injektionen. Um Gene in Honigbiene Gehirn zielen, hat Gehirn Injektion von dsRNA auch durchgeführt worden, die effektiv beeinflusst Zielgenexpression in lokalen Hirnareale 11. Hier haben wir nur dokumentieren Bauch dsRNA Injektion, die häufiger verwendet wird, ist bei erwachsenen Bienen. RNAi wurde in erster Linie verwendet, um ein einzelnes Gen gezielt und ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Genfunktion zu offenbaren. Allerdings ist jedes Gen nicht isoliert von den anderen, es ist in komplexen regulatorischen Netzwerke. Ein Schlüssel für einen biologischen Prozess zu verstehen ist, sezieren, wie Gene miteinander, die eine gleichzeitige Manipulationen von mehreren Genen, anstatt ein einzelnes Gen Knockdown erfordert interagieren. In Säugerzellen, haben Wissenschaftler in gleichzeitig hemmen zwei oder drei Gene mithilfe Delivery-Systeme 12 oder multi-microRNA (miRNA) Haarnadel Designs 13 gelungen. Aber in Insekten, sind mehrere Gen Niederschlägen noch ungetestet. Hier presen wirt verschiedene Injektions-Strategien, die eine doppelte Gen Knockdown erreichen können. Wir haben das Ziel zwei Gene: vitellogenin (VG), die eine Vorläufer-Protein kodiert, Eigelb und Ultraspiracle (USP), die eine putative Rezeptor für Juvenilhormon (JH) codiert und als ein Transkriptionsfaktor Vermittlung antwortet JH 14 in Honigbienen dienen. Vg und JH regulieren sich gegenseitig in einer Rückkopplungsschleife 15 und sind in Honigbiene Verhaltensregulation 9 beteiligt. Mit dem Doppel-Gen Knockdown, entdecken wir stören sowohl Vg und JH Wege, und wie sie gemeinsam beeinflussen Honigbiene Verhalten und Physiologie und wie vg, usp und JH interagieren 9. Gustatorisch Wahrnehmung ist ein Verhaltens-Prädiktor für die Honigbiene Sozialverhalten 16. In Bezug auf die Entwicklung des Verhaltens, nest Bienen mit hohen geschmacklichen Wahrnehmung behaviorally reifen schnell, und in der Regel Futter früh im Leben und es vorziehen, Pollen sammeln 16,17. Obwohl regulatorische mechanisms zugrunde geschmacklichen Wahrnehmung sind noch unklar, Studien haben gezeigt, dass geschmackliche Wahrnehmung der internen Energiestoffwechsel 9, Hormonausschüttung 18,19 und biogenetische Amin Signalwege 20 verbunden ist. Sowohl Vg und JH sind wichtige hormonellen Regulatoren modulierenden geschmacklichen Wahrnehmung 7,21. Im Labor kann eine Variation der geschmacklichen Wahrnehmung in Honigbienen durch die Prüfung der Rüssel extension response (PER) zu verschiedenen Saccharoselösungen ausgewertet werden. Jede Biene durch Berühren sowohl ihre Antennen mit Wassertröpfchen durch einen aufsteigenden Konzentrationsreihe von 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% Saccharose gefolgt getestet. Eine positive Antwort wird darauf hingewiesen, wenn eine Biene voll streckt ihre Rüssel, wenn ein Tröpfchen von Wasser oder Saccharose zu jeder Antenne berührt wird. Basierend auf der Anzahl der positiven Reaktionen auf der Lösungen kann die geschmackliche Wahrnehmung Ebene der einzelnen 16 bestimmt werden. Jedoch ist die Anwendung der PER nicht auf die Messung begrenzt gustatory Wahrnehmung. Die PRO ist auch eine wirksame Methode, um den metabolischen Zustand der Bienen wie Sättigung gegen Hunger testen. Die Bienen mit mehr Antworten auf Saccharose sind hungriger im Allgemeinen (Wang und Amdam, unveröffentlichte Daten). Darüber hinaus kann die PER Paradigma auch in assoziativen Lernen und Gedächtnis in Honigbienen verwendet werden. In diesem Fall Bienen ausgebildet, um die Gegenwart von Saccharose Wasser mit einem Duft zu assoziieren werden. Wenn die Bienen den Verein zu erfahren, können nur die Anwesenheit des Geruchs eine positive Antwort ohne Rüssel belohnte sie mit dem Saccharose 22,23 evozieren. In diesem Video zeigen wir, wie Sie ausführen PER gustatory Wahrnehmung, die mit vg und usp Doppel Knockdown in einer früheren Studie 9 angeschlossen wurde evaluieren.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GE Healthcare PCR beads in 96 well plate</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27-9557-01</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RiboMax T7 RNA production system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trizol LS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hamilton micro syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80301</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>30G BD disposable needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1 ml Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>30960</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereo dissection microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>S6D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000-25</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Wax plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

rnai-mediated double gene knockdown and gustatory perception measurement in honey bees (apis mellifera)

Dieses Video zeigt neue Techniken der RNA-Interferenz (RNAi), die zwei Gene gleichzeitig herunterreguliert in Honigbienen mit doppelsträngigen RNA (dsRNA) Injektionen. Es stellt auch ein Protokoll der Rüssel extension response (PER) Assay zur Messung geschmacklichen Wahrnehmung. RNAi-vermittelte Gene Knockdown ist eine effektive Technik Herunterregulieren Ziel Genexpression. Diese Technik ist in der Regel für einzelne Genmanipulation verwendet, aber es hat seine Grenzen Wechselwirkungen und gemeinsame Wirkung von Genen nachzuweisen. Im ersten Teil dieses Video präsentieren wir zwei Strategien gleichzeitig niederzuschlagen zwei Gene (so genannte Doppel-Gen Knockdown). Wir zeigen beide Strategien sind in der Lage, effektiv zu unterdrücken zwei Gene, Vitellogenin (vg) und Ultraspiracle (usp), die in einer regulatorischen Rückkopplungsschleife sind. Diese doppelte Gen Knockdown Ansatz kann verwendet werden, um Zusammenhänge zwischen Genen sezieren und kann leicht in angewendet werdenverschiedene Insektenarten. Der zweite Teil dieses Videos ist eine Demonstration der Rüssel extension response (PER)-Assay in Honigbienen nach der Behandlung von Doppel-Gen Knockdown. Die PER-Assay ist ein Standard-Test zur Messung geschmackliche Wahrnehmung in Honigbienen, die ein wichtiger Prädiktor für wie schnell eine Honigbiene Verhaltens Reifung ist. Größere Geschmacks Wahrnehmung Nest Bienen zeigt erhöht Verhaltensstörungen Entwicklung, die oft mit einem früheren Alter bei Beginn der Futtersuche und Futtersuche Spezialisierung in Pollen assoziiert ist. Darüber hinaus können pro Test angewendet, um metabolische Zustände der Sättigung oder Hunger in Honigbienen zu identifizieren. Schließlich PER-Assay mit verschiedenen Paarung Geruch Reize für die Konditionierung die Bienen auch weit verbreitet ist für Lernen und Gedächtnis in Studien Honigbienen kombiniert verwendet.

Sowohl die Single-Einspritzung und zwei Tage Injektion Strategien deutlich vg (One-way ANOVA, p &lt;0,001) (Abbildung 2A) und USP (One-way ANOVA, p &lt;0,001) (Abbildung 2B) reduziert Transkripte in Honigbienen Sechs Tage nach der dsRNA injiziert. Die Unterdrückung der usp Transkript mit dem einzigen Injektion mit dsRNA Mischung und die zweitägige Injektion mit vg ersten und zweiten usp (vg / usp) war signifikant niedriger als der ...

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RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In diesem Protokoll beschreiben wir zwei Strategien, die gleichzeitig zwei Gene unterdrücken (doppelte Gen Knockdown) in Honigbienen. Dann präsentieren wir, wie die Rüssel extension response (PER) Test, um die Wirkung der doppelten Gen Knockdown auf Honigbiene geschmacklichen Wahrnehmung studieren verwenden.

RNAi-vermittelte Gene Knockdown Doppelzimmer und Gustatorisch Perception Measurement in Honey Bees (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

rnai-mediated-double-gene-knockdown-gustatory-perception-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

14.8K Aufrufe.  Arizona State University. In diesem Protokoll beschreiben wir zwei Strategien, die gleichzeitig zwei Gene unterdrücken (doppelte Gen Knockdown) in Honigbienen. Dann präsentieren wir, wie die Rüssel extension response (PER) Test, um die Wirkung der doppelten Gen Knockdown auf Honigbiene geschmacklichen Wahrnehmung studieren verwenden.

Serie: RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Forschung

Neurowissenschaften

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the survival of a honeybee colony depends on the exploitation of food sources, forager bees learn and memorize variable flower sites as well as their profitability. Forager bees can be easily trained in natural settings where they forage at a feeding site and learn the related signals such as odor or color. Appetitive associative learning can also be studied under controlled conditions in the laboratory by conditioning the proboscis extension response (PER) of individually harnessed honeybees3,4. This learning paradigm enables the study of the neuronal and molecular mechanisms that underlie learning and memory formation in a simple and highly reliable way5-12. A behavioral pharmacology approach is used to study molecular mechanisms. Drugs are injected systemically to interfere with the function of specific molecules during or after learning and memory formation13-16.
Here we demonstrate how to train harnessed honeybees in PER conditioning and how to apply drugs systemically by injection into the bee flight muscle.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

We demonstrate how to implement a behavioral pharmacology method in an appetitive olfactory conditioning paradigm in honeybees (Apis mellifera) by systemic application of drugs. This method allows investigation of the mechanisms underlying learning and memory formation in a simple and reliable way.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning der Proboscis Erweiterung Reaktionszeit in Honigbienen ( Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

Creating Objects and Object Categories for Studying Perception and Perceptual Learning

In order to quantitatively study object perception, be it perception by biological systems or by machines, one needs to create objects and object categories with precisely definable, preferably naturalistic, properties1. Furthermore, for studies on perceptual learning, it is useful to create novel objects and object categories (or object classes) with such properties2.
Many innovative and useful methods currently exist for creating novel objects and object categories3-6 (also see refs. 7,8). However, generally speaking, the existing methods have three broad types of shortcomings.
First, shape variations are generally imposed by the experimenter5,9,10, and may therefore be different from the variability in natural categories, and optimized for a particular recognition algorithm. It would be desirable to have the variations arise independently of the externally imposed constraints.
Second, the existing methods have difficulty capturing the shape complexity of natural objects11-13. If the goal is to study natural object perception, it is desirable for objects and object categories to be naturalistic, so as to avoid possible confounds and special cases.
Third, it is generally hard to quantitatively measure the available information in the stimuli created by conventional methods. It would be desirable to create objects and object categories where the available information can be precisely measured and, where necessary, systematically manipulated (or 'tuned'). This allows one to formulate the underlying object recognition tasks in quantitative terms.
Here we describe a set of algorithms, or methods, that meet all three of the above criteria. Virtual morphogenesis (VM) creates novel, naturalistic virtual 3-D objects called 'digital embryos' by simulating the biological process of embryogenesis14. Virtual phylogenesis (VP) creates novel, naturalistic object categories by simulating the evolutionary process of natural selection9,12,13. Objects and object categories created by these simulations can be further manipulated by various morphing methods to generate systematic variations of shape characteristics15,16. The VP and morphing methods can also be applied, in principle, to novel virtual objects other than digital embryos, or to virtual versions of real-world objects9,13. Virtual objects created in this fashion can be rendered as visual images using a conventional graphical toolkit, with desired manipulations of surface texture, illumination, size, viewpoint and background. The virtual objects can also be 'printed' as haptic objects using a conventional 3-D prototyper.
We also describe some implementations of these computational algorithms to help illustrate the potential utility of the algorithms. It is important to distinguish the algorithms from their implementations. The implementations are demonstrations offered solely as a 'proof of principle' of the underlying algorithms. It is important to note that, in general, an implementation of a computational algorithm often has limitations that the algorithm itself does not have.
Together, these methods represent a set of powerful and flexible tools for studying object recognition and perceptual learning by biological and computational systems alike. With appropriate extensions, these methods may also prove useful in the study of morphogenesis and phylogenesis.

We describe a novel methodology for creating naturalistic 3-D objects and object categories with precisely defined feature variations. We use simulations of the biological processes of morphogenesis and phylogenesis to create novel, naturalistic virtual 3-D objects and object categories that can then be rendered as visual images or haptic objects.

Erstellen von Objekten und Objekt Kategorien für Studium Wahrnehmung und Perceptual Learning

In order to quantitatively study object perception, be it perception by biological systems or by machines, one needs to create objects and object ...

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single cells in response to electrical or pharmacological manipulations1,2. With the invention of methods to optically control genetically targeted neurons (optogenetics), researchers now have an unprecedented level of control over specific groups of neurons in the standard slice preparation. In particular, photosensitive channelrhodopsin-2 (ChR2) allows researchers to activate neurons with light3,4. By combining careful calibration of LED-based photostimulation of ChR2 with standard slice electrophysiology, we are able to probe with greater detail the role of adult-born interneurons in the olfactory bulb, the first central relay of the olfactory system. Using viral expression of ChR2-YFP specifically in adult-born neurons, we can selectively control young adult-born neurons in a milieu of older and mature neurons. Our optical control uses a simple and inexpensive LED system, and we show how this system can be calibrated to understand how much light is needed to evoke spiking activity in single neurons. Hence, brief flashes of blue light can remotely control the firing pattern of ChR2-transduced newborn cells.

Adult-born neurons expressing ChR2 can be manipulated in slice electrophysiological preparations in order to examine their contribution towards the function of olfactory neural circuits.

Mit Affordable LED Arrays für Photo-Stimulation von Neuronen

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Selektive Viral Transduktion von Adult-geboren olfaktorischen Neuronen für chronische In vivo Optogenetische Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

MPI CyberMotion Simulator: Implementation of a Novel Motion Simulator to Investigate Multisensory Path Integration in Three Dimensions

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. Humans can do path integration based exclusively on visual 2-3, auditory 4, or inertial cues 5. However, with multiple cues present, inertial cues - particularly kinaesthetic - seem to dominate 6-7. In the absence of vision, humans tend to overestimate short distances (&lt;5 m) and turning angles (&lt;30&deg;), but underestimate longer ones 5. Movement through physical space therefore does not seem to be accurately represented by the brain.
Extensive work has been done on evaluating path integration in the horizontal plane, but little is known about vertical movement (see 3 for virtual movement from vision alone). One reason for this is that traditional motion simulators have a small range of motion restricted mainly to the horizontal plane. Here we take advantage of a motion simulator 8-9 with a large range of motion to assess whether path integration is similar between horizontal and vertical planes. The relative contributions of inertial and visual cues for path navigation were also assessed.
16 observers sat upright in a seat mounted to the flange of a modified KUKA anthropomorphic robot arm. Sensory information was manipulated by providing visual (optic flow, limited lifetime star field), vestibular-kinaesthetic (passive self motion with eyes closed), or visual and vestibular-kinaesthetic motion cues. Movement trajectories in the horizontal, sagittal and frontal planes consisted of two segment lengths (1st: 0.4 m, 2nd: 1 m; &plusmn;0.24 m/s2 peak acceleration). The angle of the two segments was either 45&deg; or 90&deg;. Observers pointed back to their origin by moving an arrow that was superimposed on an avatar presented on the screen.
Observers were more likely to underestimate angle size for movement in the horizontal plane compared to the vertical planes. In the frontal plane observers were more likely to overestimate angle size while there was no such bias in the sagittal plane. Finally, observers responded slower when answering based on vestibular-kinaesthetic information alone. Human path integration based on vestibular-kinaesthetic information alone thus takes longer than when visual information is present. That pointing is consistent with underestimating and overestimating the angle one has moved through in the horizontal and vertical planes respectively, suggests that the neural representation of self-motion through space is non-symmetrical which may relate to the fact that humans experience movement mostly within the horizontal plane.

An efficient way to gain insight into how humans navigate themselves in three dimensions is described. The method takes advantage of a motion simulator capable of moving observers in ways unattainable by traditional simulators. Results confirm that movement in the horizontal plane is underestimated, while vertical movement is overestimated.

MPI CyberMotion Simulator: Implementierung eines neuartigen Motion Simulator zu Multisensorische Pfadintegration in drei Dimensionen erforschen

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

Tactile Conditioning und Bewegungsanalyse der antennalen Sampling Strategies In Honey Bees (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

Doppelläufige und Concentric Mikroelektroden zur Messung der extrazellulären Ionensignale im Hirngewebe

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from flowering plants. Only a few studies have described the gustatory responses of bees toward toxins in food, and these experiments have mainly used the proboscis extension response on restrained honey bees. Here, a new behavioral assay is presented for measuring the feeding responses of freely-moving, individual worker bumble bees to nutrients and toxins. This assay measures the amount of solution ingested by each bumble bee and identifies how tastants in food influence the microstructure of the feeding behavior.
The solutions are presented in a microcapillary tube to individual bumble bees that have been previously starved for 2-4 hr. The behavior is captured on digital video. The fine structure of the feeding behavior is analyzed by continuously scoring the position of the proboscis (mouthparts) from video recordings using event logging software. The position of the proboscis is defined by three different behavioral categories: (1) proboscis is extended and in contact with the solution, (2) proboscis is extended but not in contact with the solution and (3) proboscis is stowed under the head. Furthermore the speed of the proboscis retracting away from the solution is also estimated.
In the present assay the volume of solution consumed, the number of feeding bouts, the duration of the feeding bouts and the speed of the proboscis retraction after the first contact is used to evaluate the phagostimulatory or the deterrent activity of the compounds tested.
This new taste assay will allow researchers to measure how compounds found in nectar influence the feeding behavior of bees and will also be useful to pollination biologists, toxicologists and neuroethologists studying the bumble bee&#39;s taste system.

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.

A Novel Verhaltenstest Gustatory Antworten einzelner, frei beweglichen Bumble Bees zur Untersuchung (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

Neuropharmakologische Manipulation von Verhaltene und Free-Fliegen-Honig-Bienen,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...