Diese Arbeit wurde von der Versicherungsgesellschaft &quot;Novalis-Taitbout&quot;, Ecole des Neurosciences de Paris (ENP), die Agence Nationale de la Recherche &quot;ANR-09-neur-004&quot; im Rahmen des &quot;ERA-NET NEURON&quot; der unterstützten RP7-Programm von der Europäischen Kommission, &quot;Foundation pour la Recherche Medicale&quot;, die Letten-Stiftung und der Pasteur-Stiftung.

1. Stereotaktische Injektion <ol><li> Das Virus in diesen Experimenten verwendet wird ein Replikations-defizienten lentiviralen Vektors auf das HIV-Virus basiert auf Channelrhodopsine2-YFP (gelb fluoreszierendes Protein) exprimieren Fusionskonstrukt angetrieben von einem Synapsin Förderer 6. Das Plasmid wurde freundlicherweise von K. Deisseroth &#39;s Research Group (sofern <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html">http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html</a> ). Lentiviren können im Handel bezogen werden oder im Labor hergestellt nach etablierten Protokollen 7. Durchschnittliche Vektor-Titer wurden in der Reihenfolge 10 10 Transduktion Einheiten / ml. Viral Aliquots bei -80 ° C gelagert und sollte kurz vor Pipette loading aufgetaut werden. Mehrere Frost / Tau-Zyklen sollte vermieden werden. Nie Exposition der Virus-Lösung direkt auf Trockeneis. </li><li> Bereiten Glaspipetten mit Borosilikatglas Kapillaren auf Standard-Pipette Puller (Sutter P-97 Pipette puller). Das Ziehen Einstellung sollte richtig kalibriert werden, um eine lange und starre Pipette erhalten. Anschließend schneiden Sie die Spitze der Pipette mit einer Schere, um ein Trinkgeld von 30-40 &amp;mgr; m im Durchmesser erreichen. Shop gezogen Pipetten in einer staubfreien Box. </li><li> Richten Sie die Nanoject II Mikroinjektor mit den Anweisungen des Herstellers für die Lieferung von 50 nL. Bereiten Sie die Injektionspipette von Back-Füllung mit Mineralöl und fügen Sie ihn in den Mikroinjektor Kolben. Bringen Sie die Mikroinjektor auf einen stereotaktischen Rahmen. Teilweise leere Öl aus der Glaspipette vor dem Befüllen mit der Virus-Lösung </li><li> Mit einer Mikropipette, Transfer 2 ul-Virus-Lösung auf eine sterile Stück Parafilm. Senken Sie die Glaspipette in die Drop-Virus-Lösung und füllen Sie die Pipette mit 1-2 pl. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen in der Pipette. </li><li> Anesthetize eine Maus mit 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin, in steriler Kochsalzlösung verdünnt. Entfernen Sie die Haare aus der Kopfhaut desTier mit Nagetier Klipper, Rasierklingen, Scheren oder chemische depilitory Agenten. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit drei Anwendungen von Wechselstrom 70% Ethanol und betadine. Alle chirurgischen Instrumente sollten auch autoklaviert werden und dann mit 70% Ethanol desinfiziert. Legen Sie das Tier in den stereotaktischen Rahmen mit Ohr Bars und Nase bar, sicherzustellen, dass der Kopf sicher ist. Übernehmen Augensalbe zu verhindern Austrocknen der Hornhaut. </li><li> Mit einem Skalpell, schneiden Sie die Kopfhaut vor zwischen den Augen, zwischen den Ohren. Ziehen Sie die Haut beiseite, um den Schädel zu entlarven und verankern Sie die Haut mit einem Paar Klammern. Reinigen Sie die Oberfläche des Schädels. Die stereotaktischen Apparat ist mit der Spitze der Glaspipette auf Bregma auf Null gestellt. Dann wird die Spitze an der Injektionsstelle (; Medio-Lateral, ± 0,82, für beide rechten und linken Hemisphäre bzw. von vorne nach hinten, 3,30) positioniert. Die Position der Nase bar ist nach der Berechnung der stereotaktischen Koordinaten angepasst werden. In unserem Experiment ist die Nase bar u eingestelltntil Bregma und der Injektionsstelle sind auf die gleiche Höhe ausgerichtet. </li><li> Identifizieren Sie die Einstichstelle. Mit einem High-Speed-chirurgische Bohrer vorsichtig bohren Löcher in die Schädel. Mit einer gebogenen Kanüle an der Spitze angeschlossen, entfernen Sie die Reste der dünnen Knochen, die Dura mater aussetzen. Prüfen Sie, ob das Loch an der richtigen Stelle zentriert ist. Achten Sie darauf, nicht zu brechen Blutgefäße auf der Oberfläche des Gehirns während des Bohrens. Wenn Blutgefäße zerrissen sind, vorsichtig auf die Oberfläche des Gehirns mit einem kleinen Wattestäbchen oder Gewebe für mehrere Sekunden drücken, bis der Blutfluss stoppt. </li><li> Senken Sie die Pipette und Null der Dorso-Ventral Höhe, wenn die Spitze der Pipette berührt die Oberfläche des Gehirns. Dann, um die richtige Dorso-Ventral Tiefe (Dorso-Ventral, 2,9 von Hirnoberfläche) niedriger und warten Sie 30 Sekunden für Druckausgleich. Inject 4 mal 50 nl von Viren für eine Gesamtmenge von 200 nl. Warten Sie 30 Sekunden zwischen jeder Injektion. </li><li> Eine Minute nach der letzten Injektion langsam zurückziehen Rohrtte. Wiederholen Sie die Punkte 1,6-1,8 für die andere Hemisphäre. Entfernen Sie das Tier von stereotaktischen Apparat, reinigen Sie den Schnitt und Stich der Schnitt Haut mit chirurgischen Fäden. Lassen Sie das Tier auf die Erwärmung pad vor der Rückkehr in Käfig zu erholen. Darüber hinaus können Tiere eine nicht-steroidale entzündungshemmende Schmerzmittel (zB Carprofen 4mg/kg) unmittelbar nach gegeben und 3 Tage nach der Operation. </li></ol> 2. Chronische LED Implantation in vivo optogenetische Stimulation im Riechkolben <ol><li> Tiere mit lentiviralen Partikel injiziert bilateral nächsten chronisch mit einem Miniatur-blauen LED (Osram, LED CMS 4.6W blau) implantiert. Löten Sie die LED-Pins, um eine weibliche Mini-Elektro-Anschluss, so dass der Stecker auf der gegenüberliegenden Seite der LED positioniert ist. Überprüfen Sie, dass es keinen elektrischen Kurzschluss und identifizieren Sie die positiven und negativen Pin am Stecker. Testen Sie die LED durch den Anschluss an einen Stromregler denn wenn Sie ein passendes Kabel LED. </li><li> Zur Messung und / oder setzt die absolute Lichtleistung der LED, montieren Sie die LED auf einem Mikromanipulator und die Position der LED in direkten Kontakt mit dem Photodetektor ein Leistungsmesser eines Peaks Lichtintensität bei 470 nm. Bohren Sie ein Loch von 3 mm Durchmesser in einem undurchsichtigen PVC Bord. Bringen Sie dieses Loch auf die Power-Meter und bauen eine Standardkurve der optischen Leistung im Vergleich zu Eingangsstrom auf die Leistung pro mm 2 zu berechnen. </li><li> Zur Messung der Ausbreitung von Licht durch das Gehirn, schneiden Blöcke von frischem Hirngewebe von 300, 500, 1000, 1500 und 2500 um Dicke in 0-4 ° C ACSF mit einem Vibratom 14. Legen Sie ein Stück Schädel mit einer Kraniotomie identisch mit der in lebenden Mäusen unter der LED durchgeführt. Zunächst messen die Lichtleistung ohne Gewebe auf LED zentriert. Legen Sie dann jeden Block von Gewebe zwischen den LED und dem Photodetektor des Leistungsmesser, und messen die Kraft. Erstellen Sie eine Kurve der Gewebedicke gegenüber der relativen Übertragung Fraktion, als das Verhältnis berechnetzwischen der Macht durch das Gewebe und ohne Gewebe gemessen. </li><li> Anesthetize eine Maus mit 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin, in steriler Kochsalzlösung verdünnt. Reinigen und desinfizieren Sie die LED mit 70% Ethanol. Entfernen Sie die Haare aus der Kopfhaut des Tieres und desinfizieren Sie die Kopfhaut mit drei Anwendungen von Wechselstrom 70% Ethanol und betadine. Dann legen Sie das Tier in den stereotaktischen Rahmen. Übernehmen Augensalbe zu verhindern Austrocknen der Hornhaut. Befestigen Sie die Sendeeinheit einen stereotaktischen Halter. Die Position der Nase bar sollte so eingestellt, bis die Oberfläche des Schädels über den Riechkolben ist perfekt horizontal und parallel zur Oberfläche der Miniatur-LED sein. </li><li> Mit einem Skalpell, schneiden Sie die Kopfhaut von 3 mm vor den Augen bis 3 mm hinter den Ohren. Ziehen Sie die Haut beiseite und verankern mit einem Paar Klammern. Kratzen entfernt die Membranen an der Oberfläche des Schädels mit einer Rasierklinge. Reinigen und trocknen Sie den Schädel. Tragen Sie eine dünne Abdeckung des Cyanacrylat-Klebstoff auf nachfolgende ad ermöglichenmenhalt der zahnärztlichen Acryl. </li><li> Mit einem High-Speed-chirurgische Bohrer, führen Sie einen rechteckigen Kraniotomie (1 mm und 3 mm kaudal lateral; zentriert auf 5,1 mm caudal, 0 mm lateral vom Bregma) über den Riechkolben. Um dies zu tun, sorgfältig dünnen Schädel, bis nur noch eine dünne Schicht des Knochens bleibt. Entfernen Sie vorsichtig die restlichen Knochen mit Hilfe einer gebogenen Kanüle. Besondere Vorsicht ist geboten, um zu vermeiden Punktion der Dura Materie und Bersten der großen Blutgefäße, die zwischen den beiden Hemisphären und in die hintere Begrenzung der Riechkolben liegen. Blut Akkumulation und Koagulation bei der Hirnoberfläche schließt optimale Lichteinfall in das Gewebe. Spülen Sie die Kraniotomie und der Oberfläche des Gehirns mit einer sterilen Kochsalzlösung und dann trocknen den Schädel. </li><li> Bringen Sie die Miniatur-LED, um den Anschluss. Senken Sie die Miniatur auf der Oberseite der Riechkolben LED. Die Hauptachse des Miniatur-LED sollte parallel zu den rostral-kaudale Achse der Maus, Clean mit steriler Kochsalzlösung und dry des Schädels. Dann sichern die LED auf den Schädel mit einer ersten Schicht aus Acryl (dh Polycarboxylatzement), gefolgt von einer zweiten Schicht von zahnärztlichen Acryl gefolgt. Die Zugabe von zwei kleinen Schrauben erforderlich, um die LED zu beheben. Die Schrauben sollten auf dem Schädel eingefügt werden (hinter der LED-Position) und mit beiden Acryl. Während die Acryl noch flüssig ist, zurück zu ziehen und kleben Sie die freien Kanten der Kopfhaut auf der Oberfläche des zahnärztlichen Acryl. Achten Sie darauf, alle Acryl auf den Anschluss beantragen. Nach dem Acryl ausgehärtet ist, entfernen Sie das Tier von stereotaktischen Apparat und lassen Sie es auf eine wärmende Unterlage wieder vor der Rückkehr in Käfig. Die Tiere sind in ihrem Käfig, aus dem Eingriff für mindestens sieben Tage erholen links isoliert. Darüber hinaus können Tiere eine nicht-steroidale entzündungshemmende Schmerzmittel (zB Carprofen 4mg/kg) unmittelbar nach gegeben und 3 Tage nach der Operation. LEDs sollten vor der Implantation und nach Beendigung der Experimente getestet werden. </li><li> Ein leichter elektrischercal-Kabel wird verwendet, um tether das Tier mit einem Stromregler für LED gekoppelt mit einem Impulsgeber (Master-8), um das Timing und die Intensität der LED-Steuerung. Die dünnen Kabel ermöglicht volle Bewegungsfreiheit. Achten Sie auf die Polarität der Stecker achten. Umkehren der Polarität kann brechen die LED. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: ChR2-YFP ist in transduzierten Neuronen etwa 48 Stunden nach der Injektion zum Ausdruck, und bleibt für mehrere Monate 7 stabil. Abbildung 1 ist ein repräsentatives Bild von einem Sagittalschnitt einer Paraformaldehyd-fixierten Tier 15 Tage nach der Injektion. Beachten Sie die dichten Kennzeichnung und die Größe der Injektionsstelle in das RMS. Eine große Zahl von Neugeborenen Zellen entlang der RMS migriert, die verschiedenen Schichten der Riechkolben (Abb. 1) zu besiedeln. Das Fusionsprotein wird in allen Neuronen Fächer, einschließlich der Soma, Dendriten und Dornen ausgedrückt. Miniatur-LED IMPLA<html> ntation ermöglicht in großem Maßstab und kostengünstige optische Stimulation von einem breiten Bereich von Interesse. Das Tier ist es, die LED-Controller mit einem leichten elektrischen Kabel, die eine völlige Bewegungsfreiheit ermöglicht angebunden. Mit der Charakterisierung der Lichtstreuung in das Hirngewebe und die Schwelle von ChR2 Aktivierung, schätzen wir, dass die optische Aktivierung in einer Tiefe von ~ 2 mm unterhalb der Oberfläche der LED (Abb. 2A) ausgelöst werden könnten. Zur Überwachung der funktionellen Aktivierung von ChR2-exprimierenden Neuronen in vivo, kann die Expression von c-fos, einem Marker der neuronalen Aktivität, nach wiederholtem Licht-Stimulation (Abb. 2B) analysiert werden. Als Alternative, können in vitro elektrophysiologische Ableitungen von ChR2-exprimierenden Neuronen gekoppelt fokalen Licht Stimulation 14 durchgeführt werden. Schließlich haben Zwei-Photonen gezielt loose-Patch-Aufnahmen verwendet worden, um die funktionelle Aktivierung von ChR2-exprimierenden kortikalen Neuronen durch ähnliche Miniatur in vivo 9 LED studieren. ntent &quot;&gt; <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig1.jpg" /> Abbildung 1. ChR2-YFP Ausdruck von lentiviralen Injektion in den rostralen wandernde Bach. Representative konfokalen Bildern einer saggital Abschnitte der Riechkolben der Maus 15 Tage nach den Injektionen der ein Lentivirus im rostralen RMS. Beachten Sie die Anwesenheit von zerstreuten YFP neugeborenen Neuronen Migration von Ende der RMS, die verschiedenen Schichten der OB. Die meisten Neugeborenen-Zellen (95%) sind Körnerzellen, die Soma liegen in der Körnerzellschicht (GCL) und Dendriten verzweigen in die externe Plexiform Layer (EPL). Eine kleine Population von neugeborenen Neuronen wandern bis zu den oberflächlichen Schichten des OB, in der glomerulären Layer (GL). Scale-bar, 100 um. Inset, hoher Vergrößerung eines neugeborenen Körnerzellen, welche die Membran Ausdruck ChR2-YFP in den Dendriten als auch in Dornen. Scale-bar, 20 um. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig2.jpg" /&gt; Abbildung 2. Schematische Darstellung der implantierten LED auf der Oberseite der Riechkolben und Licht-evozierte c-fos-Expression in ChR2-YFP exprimieren neuen Körnerzellen. A, Schematische Darstellung des implantierten über den Riechkolben LED. B, Vertreter konfokalen Bildern zeigt Doppel-markierten ChR2-YFP + c-fos + Körnerzellen eine Stunde nach Licht Stimulation der Riechkolben. C-fos-Expression offenbart mit einem Kaninchen-anti-c-fos primärer Antikörper (Calbiochem, 1:5000) und A568-konjugierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Invitrogen, 1:1000). Scale-bar, 10 um.

<ol>
	<li>Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits.">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li><li>Alonso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+astrocytes+from+the+rostral+migratory+stream+into+neurons:+a+role+for+the+olfactory+sensory+organ.">Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ.</a> J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).</li><li>Mouret, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+survival+of+newly+generated+neurons:+when+time+matters.">Learning and survival of newly generated neurons: when time matters.</a> J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).</li><li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How,+when,+and+where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb.">How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).</li><li>Haubensak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+an+amygdala+microcircuit+that+gates+conditioned+fear.">Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear.</a> Nature. 468, 270-276 (2010).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446, 633-639 (2007).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+Production.">Lentivirus Production.</a> J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nature protocols. 5, 247-254 (2010).</li><li>Huber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+optical+microstimulation+in+barrel+cortex+drives+learned+behaviour+in+freely+moving+mice.">Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice.</a> Nature. 451, 61-64 (2010).</li><li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+light-induced+activation+of+neural+circuitry+in+transgenic+mice+expressing+channelrhodopsin-2.">In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 .</li><li>Albeanu, D. 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Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).</li><li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li><li>Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Affordable+LED+Arrays+for+Photo-Stimulation+of+Neurons.">Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons.</a> J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Optogenetische Werkzeuge haben vor kurzem unsere Kontrolle über selektive neuronale Populationen, einschließlich der Erwachsenenbildung geboren Neuronen im olfaktorischen System erhöht. Hier beschreiben wir, wie Sie eine stereotaktische Injektion eines lentiviralen Vektor, ChR2-YFP in einer bestimmten Population von Erwachsenen geboren Neuronen führen. Durch die sorgfältige Überwachung der Zeit nach der Injektion, sind wir in der Lage zu analysieren und zu manipulieren, die Aktivität von einer Kohorte von Erwachs...

<table border="1"><tbody><tr><td> Material </td><td> Firma </td><td> Katalog Nr. </td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Merial </td><td> Imalgène 1000 </td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Bayer Health Care </td><td> Rompum 0,2% </td></tr><tr><td> Pipette Puller </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> Glaskapillaren (3,5 &quot;) </td><td> Drummond Scientific </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> Nanoject II Mikroinjektor </td><td> Drummond Scientific </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> High-Speed-chirurgische Bohrer </td><td> Feine Science Tools </td><td> 18000-17 </td></tr><tr><td> Micro Drill Stahl Grate 0,7 mm Spitzendurchmesser </td><td> Feine Science Tools </td><td> 19008-07 </td></tr><tr><td> LED CMS blau 4,6 W </td><td> OSRAM </td><td> LBW5SN </td></tr><tr><td> Kabeldose (2,54 mm) </td><td> Fischer Elektronik </td><td> BL5.36Z </td></tr><tr><td> Stromregler für LED (max: 1A) </td><td> A1W Electronik </td><td> HKO-KL50-1000 </td></tr><tr><td> Impulsgeber </td><td> AMPI </td><td> Meister-8 </td></tr><tr><td> Optisches Leistungsmessgerät </td><td> Thor Labs </td><td> PM100 </td></tr><tr><td> Cyanacrylat-Klebstoff </td><td> Loctite </td><td> 454 </td></tr><tr><td> Polycarboxylatzement (erste Schicht Zement) </td><td> Septodont </td><td> Selfast (# 0068Q) </td></tr><tr><td> Methacrylat-Zement (zweite Schicht Zement) </td><td> GC InternationalCorp. </td><td> Unifast Trad - Liquid (# 339292) Unifast Trad - Pulver (# 339114) </td></tr><tr><td> Carprofen </td><td> Pfizer </td><td> Rimadyl </td></tr></tbody></table>

selective viral transduction of adult-born olfactory neurons for chronic in vivo optogenetic stimulation

Lokale Interneurone werden kontinuierlich in den Riechkolben der erwachsenen Nagetieren 1-3 regeneriert. In diesem Prozess, genannt adulte Neurogenese, neuronale Stammzellen in den Wänden der Seitenventrikel Anlass zu Neuroblasten, die für mehrere Millimeter entlang der rostralen wandernden Strom (RMS) zu erreichen und in den Riechkolben enthalten migrieren. Zur Untersuchung der verschiedenen Schritte und die Auswirkungen der Erwachsenen-geboren Neuron Integration in bereits vorhandene Geruchs-Schaltungen ist es notwendig, gezielt Label und Manipulation der Aktivität dieser speziellen Population von Neuronen. Die jüngste Entwicklung der optogenetische Technologien bietet die Möglichkeit, Licht zu verwenden, um genau zu aktivieren diese spezifische Gruppe von Neuronen, ohne die umliegenden Neuronen 4,5. Hier präsentieren wir eine Reihe von Verfahren, die viral ausdrückliche Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP in einer zeitlich beschränkten Gruppe von Neuroblasten in der RMS, bevor sie den Riechkolben zu erreichen und zu Erwachsenen-geboren neurons. Darüber hinaus zeigen wir, wie zu implantieren und zu kalibrieren eine Miniatur für chronische in vivo Stimulation von ChR2-exprimierenden Neuronen LED.

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Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-geboren Neuronen des Bulbus kann optogenetically gesteuert werden mit Channelrhodopsin2-exprimierenden lentiviralen Injektion in den rostralen wandernde Bach und chronischen Photostimulation mit einem implantierten Mini-LED.

Selektive Viral Transduktion von Adult-geboren olfaktorischen Neuronen für chronische In vivo Optogenetische Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

selective-viral-transduction-adult-born-olfactory-neurons-for-chronic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

15.4K Aufrufe.  Institut Pasteur and Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Adult-geboren Neuronen des Bulbus kann optogenetically gesteuert werden mit Channelrhodopsin2-exprimierenden lentiviralen Injektion in den rostralen wandernde Bach und chronischen Photostimulation mit einem implantierten Mini-LED.

Serie: Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

Die Untersuchung der Integration von Adult-geboren Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus-vermittelte Gen-Manipulation und Visualisierung von Riechzellen In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash-Photolyse von Caged Compounds in den Zilien der Riechzellen

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

LWL-Implantation für chronische optogenetische Stimulation des Hirngewebes

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenetische Stimulation von Escape Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

Optogenetische Stimulation des Hörnervs

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...