Os autores gostariam de agradecer a Erin Fennern para auxiliar experimento. Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa da Noruega (180504, 185306 e 191699), PEW Charitable Trust, eo Instituto Nacional do Envelhecimento (NIA P01 AG22500).

Parte 1: RNAi mediado pelo gene knockdown dupla 1. dsRNA Synthesis <ol><li> Iniciadores do projeto de dsRNAs segmentação vg, usp e um controle de gene que codifica a proteína verde fluorescente (GFP), que não está no genoma da abelha do mel: primers foram desenhados utilizando o software online gratuitamente Primer3 ( <a href="http://frodo.wi.mit.edu/" target="_blank">http://frodo.wi.mit.edu/</a> ) . </li><li> síntese de dsRNA para vg, usp e GFP: use RiboMax T7 sistema de produção de RNA da Promega para transcrição in vitro. </li><li> dsRNA purificação: <ol><li> Desnaturação e renaturação: aqueça o dsRNA a 85 ° C por 5 minutos e deixe esfriar em temperatura ambiente por 1 hora. </li><li> DNase tratamento I: adicione 1 mL DNase I em cada reação dsRNA e misturá-los sacudindo os tubos. Incubar durante 15 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 150 mL de água livre de nuclease e 750 mL TRIZOL - LS em cada reação, e misture-as delicadamente por inverting do tubo. Incubar as amostras durante 5 min a 30 ° C. </li><li> Adicionar 200 ul de clorofórmio para cada amostra. Misturar vigorosamente durante 20 segundos. Centrifugar as amostras durante 15 min a 12.000 xg, a 4 ° C. </li><li> Transferir a fase sobrenadante de cada tubo novo e adicionar 500 mL de álcool isopropílico para cada tubo. Misture invertendo o tubo. Incube-se a mistura durante 20 min a -20 ° C. Centrifugar durante 10 min a 12.000 xg, a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e utilizar 1.000 ul de 75% de etanol para lavar o sedimento. Após centrifugação o tubo durante 5 min a 7500 xg, a 4 ° C, o ar seco do ARNdc pelete, e usar água livre de nuclease para dissolver o sedimento. A fim de assegurar a eficácia do gene da sub-regulação, a concentração deve ser cerca de ARNdc 9 -10 ug / uL. </li></ol></li></ol> 2. Injeção de dsRNA Abdominal Para gene knockdown dupla, existem duas estratégias: 1) injeção única: mix dsRNA de dois genes e inject-se a mistura, 2) dois dias de injecção: injectar o primeiro dsRNA alvo um gene no primeiro dia, e injectar a segunda ARNdc nos mesmos abelhas no segundo dia. <ol><li> Frio recentemente surgiram abelhas em um 4 ° C geladeira por 1-2 min. Quando as abelhas são imobilizadas, montar 3-4 abelhas em paralelo em placas de Petri cheias de cera sólida, com pinos de insetos cruzaram entre seus abdomens e thoraces. </li><li> Relaxar as abelhas novamente em um 4 ° C geladeira. Certifique-se de que as abelhas são completamente imóvel. Demora cerca de 1-2 min. As abelhas devem olhar solto. Se as abelhas se enrolado ou contorcidos, que significa que eles são arrefecidas muito tempo que deve ser evitado. Tempo Livre demais provoca uma elevada mortalidade, mas imobilização completa é importante porque qualquer movimento aumenta o tamanho da ferida e mortalidade. </li><li> Coloque uma agulha descartável 30 G (BD) em um micro seringa Hamilton. Take 3 dsRNA mL e verifique se não há nenhuma bolha de ar na seringa. A agulha é inserida para um lado do abdómen para evitar damaging órgãos internos. Pressione o êmbolo da seringa, lentamente para permitir que o ARNdc ser absorvida. Uma vez que o dsRNA é muito viscosa, que leva 2-3 segundos para ser completamente expelido da seringa. Após completamente empurrando o êmbolo para baixo, deixando a agulha na ferida para 4-5 seg. Observe as abelhas por 3-5 seg após as injeções. Se uma gota de hemolinfa vazamentos da ferida, descartar a abelha. </li><li> Use cores diferentes para marcar seus thoraces correspondentes a diferentes tratamentos. Neste ponto, se a estratégia de injeção única foi utilizada, as abelhas podem ser colocados de volta em uma colônia depois de 1 hora de observação. No entanto, se a estratégia de injecção de dois dias foi utilizado, após a injecção com o primeiro dsRNA, as abelhas devem ser colocados numa gaiola de malha de cilindro com mel fornecido na parte lateral e ser mantido numa incubadora a 34 ° C e 80% de humidade . </li><li> No segundo dia, siga os passos 2.2 e 2.3 para relaxar as abelhas nas gaiolas de malha e montá-los em placas de cera. Realizar as injecções com a segunda ARNdc como é descrileito na etapa 2.4. </li><li> Deixe que as abelhas se recuperar em temperatura ambiente por 1 hora e apresentá-los em uma colônia. </li></ol> Nota: Os efeitos Knockdown pode ser detectado por RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) e transferência western. Em geral, a eficácia knockdown varia e depende de muitos fatores. Em nosso estudo, o gene knockdown dupla pode ser detectado de 7 dias após as injeções individuais e injeções de dois dias. Parte 2: narigudo extensão resposta ensaio (PER) 1. Coleta de abelhas da colmeia No dia 6 após as injeções, coleta de abelhas tratadas da colônia sem o uso de um fumante. Coletar as abelhas em gaiolas cilindro de malha de metal. Mantenha três abelhas em cada gaiola. 2. Abelhas de montagem para PER Frio as abelhas a 4 ° C até serem completamente imobilizado. Monte cada abelha verticalmente em um tubo de plástico especialmente projetado para PER. Mantenha o abdômen dentro do tubo por using dois pequenos pedaços de fita, e manter a cabeça para fora do tubo. Coloque os tubos em um rack com duas fileiras de colunas pequenas de plástico, e atribuir a cada tubo (abelha) com um número de identificação. Em seguida, coloque as abelhas tratadas nas prateleiras em uma incubadora (34 ° C e 80% de umidade) e mantê-los na incubadora por 2 horas. 3. Preparando uma série de sacarose Water Solutions Prepare a 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% e 30% de água, soluções de sacarose e carregar as soluções para as seringas com agulhas de 15-20. 4. Por ensaio Toque a antena da abelha com uma gota de solução a 0% (água), seguido de 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% e 30% de água, soluções de sacarose. Testar todas as abelhas com água primeiro e permitir que pelo menos dois minutos, como o intervalo entre cada solução é utilizada. Por isso, costumamos ter pelo menos 20 abelhas para cada tentativa. Se uma abelha estende totalmente seus tromba, uma resposta positiva é contado. 5.Gerenciamento de Dados Soma-se o total de respostas positivas para cada indivíduo para a pontuação resposta gustativa (GRS). Realizar uma análise estatística adequada sobre os dados. Parte 3. Validação knockdown Gene Corpos gordos são dissecados a partir de um outro conjunto de abelhas tratadas idade de 7 dias. Um procedimento padrão Trizol é utilizado para a extracção de RNA, que é seguido pelo tratamento com DNase I 24. Vg e expressão do gene da USP é analisado por um de dois passos de qRT-PCR. Actina é usado como um gene de referência, uma vez que tem expressões estáveis ​​em tecidos diferentes das abelhas. Publicada em tempo real para os iniciadores de PCR e o gene vg USP são utilizados nesta experiência 24. Os dados são analisados ​​usando o método de delta-delta CT 25.

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We have nothing to disclose.

Nosso estudo é o primeiro esforço para bater simultaneamente até dois genes em insetos adultos. Nossos resultados mostram que as duas estratégias de dsRNA injeção (injeção única e injeção de dois dias) são eficazes para a supressão gene casal e silenciamento gênico simultânea de vg e usp pode ser testado seis dias após as injeções de dsRNA em abelhas 8,9. No entanto, a eficácia knockdown gene varia em diferentes espécies de insetos, dependendo do nível de transcrição d...

Interferência de RNA (RNAi) é baseada em ARN o silenciamento pós-transcricional que ocorre em uma ampla variedade de organismos eucarióticos. O processo de RNAi é desencadeada por RNA (dsRNA) precursores double-stranded endógenos ou exógenos. O dsRNA ativa a proteína ribonuclease Dicer que liga e corta o dsRNA de pequenos fragmentos (20-25 pb). Em seguida, os pequenos fragmentos de ARNdc de um guia de reconhecimento e de clivagem de mRNAs complementares por proteínas Argonaute, um componente catalítico do RNA induzida por complexo silenciamento (RISC) 1. Nos mamíferos, dsRNAs mais de 30 nt, ativar uma resposta antiviral (resposta interferon, IFN), que leva à degradação inespecífica de RNA transcrições 2. No entanto, os longos dsRNAs têm provado ser eficazes e específicos no insectos já que existe uma falta de este IFN 3. Longos dsRNAs têm sido utilizados para regulação negativa dos genes alvo em diferentes espécies de insectos. As abelhas são um dos pionorganismos insectos EER em que as funções de muitos genes importantes no desenvolvimento e comportamento foram revelados usando ARNdc 4,5. Vários métodos de entrega de dsRNA foram realizados em abelhas: Alimentação dsRNA downregulates eficiente expressão do gene alvo em larvas de abelhas 6, enquanto a injeção dsRNA é uma abordagem eficaz para knockdown do gene em embriões de mel de abelha 4 e abelhas adultas 7,8. Efeitos knockdown do gene exibidos pela aplicação de dsRNA de insetos são transitórias e localizadas. Estudos têm demonstrado que ambas as injecções de dsRNA abdominais e torácicas injecções dsRNA suprimir eficazmente a expressão do gene alvo em células de gordura corporal abdominal de insectos 9,10. DsRNA é injetado na cavidade abdominal e torácica e células de gordura corporal são capazes de assumir o dsRNA da hemolinfa, onde as células são banhadas 10. No entanto, os genes de outros órgãos, tais como o cérebro, ovários e não pode ser alvo de qualquerinjeções abdominal ou torácica. A fim de visar genes no cérebro da abelha do mel, a injecção de ARNcd cérebro também tem sido realizada, o que influencia de forma eficaz a expressão do gene alvo em áreas cerebrais locais 11. Aqui, nós só documentar injeção dsRNA abdominal, que é mais comumente usado em abelhas adultas. RNAi tem sido utilizado principalmente para atingir um único gene e tem sido uma ferramenta poderosa para revelar a função do gene. No entanto, qualquer gene não está isolada das outras, é em redes reguladoras complexas. Uma chave para a compreensão de um processo biológico é dissecar como os genes interagem uns com os outros, o que requer manipulações simultâneas de múltiplos genes, em vez de um único gene knockdown. Em linhagens de células de mamíferos, os cientistas conseguiram inibir simultaneamente dois ou três genes por meio de sistemas de entrega de 12 ou multi-microRNA (miRNA) projeta hairpin 13. Mas, em insetos, vários knockdowns genes ainda não foram testados. Aqui, nós present estratégias de injeção diferentes, que podem atingir um gene knockdown dupla. Nós alvo dois genes: vitelogenina (vg), que codifica um precursor da proteína da gema e ultraspiracle (USP), que codifica um receptor putativo para a hormona juvenil (HA), pode servir como um factor de transcrição de mediação de respostas a JH 14 em abelhas de mel. Vg e JH regular o outro em um ciclo de realimentação 15 e estão envolvidos em mel de abelha comportamental regra 9. Usando o gene knockdown dupla, que perturbam tanto Vg e vias de JH, e descobrir como eles afetam conjuntamente o comportamento das abelhas de mel e fisiologia e como vg, usp e JH interagir 9. Percepção gustativa é um preditor comportamental para mel de abelha comportamento social 16. Em termos de desenvolvimento comportamental, abelhas ninho com alta percepção gustativa comportamentalmente maduro rápidos, e geralmente de forragem no início da vida e preferem coletar pólen 16,17. Embora m regulamentarecanismos subjacentes percepção gustativa ainda não estão claros, os estudos mostraram que a percepção gustativa está ligada ao metabolismo de energia interna 9, secreção hormonal 18,19 e biogenética amina caminhos 20. Ambos Vg e JH são importantes reguladores hormonais modulando a percepção gustativa 7,21. No laboratório, a uma variação da percepção gustativa em abelhas de mel pode ser avaliada testando a resposta extensão tromba (PER) para diferentes soluções de sacarose. Cada abelha é testada tocando tanto suas antenas com uma gota de água, seguido por uma série ascendente de concentração de 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% de sacarose. A resposta positiva é observado se a abelha estende totalmente seus tromba quando uma gota de água ou sacarose é tocado a cada antena. Com base no número de respostas positivas para as soluções, o nível de percepção gustativa de cada indivíduo pode ser determinada 16. No entanto, a aplicação do PER não se limita a medir gpercepção ustatory. O PER é também um método eficaz para testar o estado metabólico de abelhas, tais como a saciedade vs fome. As abelhas com maiores respostas a sacarose são mais faminto em geral (Wang e Amdam, dados não publicados). Além disso, o paradigma PER também pode ser utilizado na aprendizagem e na memória associativa em abelhas de mel. Neste caso, as abelhas serão treinados para associar a presença de água de sacarose, com um odor. Quando as abelhas aprender a associação, apenas a presença do odor pode evocar uma resposta positiva tromba sem premiar os com sacarose a 22,23. Neste vídeo, vamos mostrar como realizar PER para avaliar a percepção gustativa, que tem sido relacionada com vg e usp knockdown casal em um estudo anterior 9.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GE Healthcare PCR beads in 96 well plate</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27-9557-01</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RiboMax T7 RNA production system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trizol LS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hamilton micro syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80301</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>30G BD disposable needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1 ml Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>30960</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereo dissection microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>S6D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000-25</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Wax plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

rnai-mediated double gene knockdown and gustatory perception measurement in honey bees (apis mellifera)

Este vídeo demonstra novas técnicas de interferência de RNA (RNAi), que downregulate dois genes simultaneamente em abelhas usando RNA (dsRNA) injeções de cadeia dupla. Ele também apresenta um protocolo de resposta extensão probóscide (PER) ensaio para medir a percepção gustativa. Knockdown gene RNAi mediado é uma técnica eficaz diminuindo a expressão de genes-alvo. Esta técnica é geralmente utilizada para a manipulação de um único gene, mas tem limitações para detectar interações e efeitos conjuntas entre genes. Na primeira parte deste vídeo, apresentamos duas estratégias para bater simultaneamente até dois genes (chamados gene knockdown duplo). Mostramos as duas estratégias são capazes de suprimir efetivamente dois genes, vitelogenina (VG) e ultraspiracle (USP), que estão em um ciclo de feedback regulador. Esta abordagem gene knockdown dupla pode ser usada para dissecar inter-relações entre genes e podem ser prontamente aplicadasdiferentes espécies de insetos. A segunda parte deste vídeo é uma demonstração de tromba extensão resposta ensaio (PER), em abelhas produtoras de mel após o tratamento de gene knockdown dupla. O ensaio PER é um teste padrão para medir a percepção gustativa em abelhas produtoras de mel, que é um indicador chave para o quão rápido amadurecimento comportamental de uma abelha de mel é. Maior percepção gustativa de abelhas ninho indica maior desenvolvimento comportamental, que é muitas vezes associada a uma idade mais precoce de início do forrageamento e forrageamento especialização em pólen. Além disso, por ensaio pode ser aplicado para identificar estados metabólicos de saciedade ou a fome em abelhas de mel. Finalmente, por ensaio combinado com diferentes estímulos emparelhamento de odor para o condicionamento as abelhas também é amplamente utilizada para estudos de aprendizagem e memória em abelhas de mel.

Tanto o single-injeção e dois dias de injeção de estratégias reduziu significativamente vg (One-way ANOVA, p &lt;0,001) (Figura 2A) e USP (One-way ANOVA, p &lt;0,001) (Figura 2B) níveis de transcrição em abelhas seis dias depois do ARNdc foi injectada. A supressão da USP transcrição usando a única injecção com uma mistura de ARNdc e ​​a injecção de dois dias com vg primeiro e segundo USP (vg / USP) foi significati...

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RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

Neste protocolo, descrevemos duas estratégias que suprimem simultaneamente dois genes (gene knockdown double) em abelhas. Em seguida, apresentamos como usar a resposta de extensão probóscide (PER) ensaio para estudar o efeito do gene knockdown duplo em mel de abelha percepção gustativa.

RNAi mediado por Gene Knockdown duplo e Mensuração Percepção gustativa em abelhas do mel (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

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